Asztrogliasejtek retinsav termelésének kimutatása

4.1.2.1. Retinsav szintetizáló enzimek kimutatása asztrogliasejtekből

Az asztrogliasejtek retinsav termelő képességének bizonyítása érdekében RT-PCR segítségével vizsgáltuk, hogy az asztrociták expresszálják-e a retinsav szintéziséhez szükséges enzimek mRNS-ét (12. ábra). A retinsav termelés kulcsenzimei a retinaldehid-dehidrogenázok (Raldh1,2,3), amelyek a sejtekben retinaldehidből all-transz retinsavat állítanak elő egy oxidációs lépésen keresztül. A retinsav előállításához elegendő csak az egyik típusú enzim jelenléte. A vizsgálat során egynapos egerekből, különböző agyterületekről izolált gliasejteket tenyésztettünk 30 napig. Ezekből a tenyészetekből vettünk mintát különböző időpontokban. A minták cDNS tartalmát a Hprt génről átírt cDNS arányok alapján hasonlítottuk össze. Az eredmények azt mutatják, hogy a tenyésztés során végig jelen van a Raldh2 és 3 enzim. Az 1-es típusú enzim mRNS-ének mennyiségében csökkenés tapasztalható a tenyésztés korai és utolsó szakaszában. A tenyészetek ellenőrzése végett megvizsgáltuk a Gfap és a Math2 expressziót is. A Gfap folyamatos jelenléte igazolja, hogy a sejtek valóban asztrogliasejtek, a Math2 fokozatos, de gyors eltűnése a primer tenyészetből pedig bizonyítja, hogy a kezdetben jelen levő idegsejtek kiszelektálódnak és eltűnnek a kultúrákból. Az enzimek mRNS-ének jelenléte arra utal, hogy az asztrogliasejtek rendelkeznek a retinsav termelés képességével.

67

12. ábra: A retinsav termeléséhez szükséges kulcsenzimek, a retinaldehid-dehidrogenázok (1, 2, és 3) mRNS-ének kimutatása tenyésztett asztrogliasejtekből, RT-PCR segítségével. A Gfap az asztrogliasejtek markereként, a Math2 pedig az érett idegsejtek markereként jelzi a tenyészetben levő sejtek összetételét.

4.1.2.2. Asztrogliasejtek RA termelésének kimutatása RA-szenzitív bioassay segítségével

A retinsav termelésért felelős enzimek mRNS-ének jelenléte azonban nem bizonyíték a retinsav termelésre. Ezért retinsav érzékeny bioassay-t alkalmaztunk. A különböző sejtek/szövetek endogén retinsav termelése az F9-RARE-lacZ embrionális karcinóma riporter sejtvonal (Sonneveld és mtsai, 1999) segítségével tesztelhető.

Retinsav jelenlétében az F9-RARE-LacZ sejtek β-galaktozidáz (β-gal) enzimet termelnek. Ennek az enzimnek a jelenléte megmutatható a kék csapadékot adó szubsztrátjának (XGal) segítségével. Kísérleteim során teljes előagyból tenyésztett asztrogliasejtek és kontrollként primer fibroblaszt sejtek endogén retinsav termelését vizsgáltam. Az F9 sejteket 20 órán keresztül kontakt ko-kultúrákban tenyésztettük a vizsgálni kívánt sejttípusokkal, majd a szubsztrát hozzáadása után vizsgáltuk a kék szín megjelenését. Tapasztalataink szerint az asztrogliasejtek környezetében az F9 sejtek jelentős retinsav mennyiséget jeleztek, míg a kontrollként használt fibroblaszt sejtek esetében nem volt színreakció, jelezve, hogy ezek a sejtek nem termelnek retinsavat.

Annak érdekében, hogy a retinsav termelés mértékét mennyiségileg is meg tudjuk határozni, fotometriás mérést is végeztünk (13/F ábra). Ebben az esetben a β-galaktozidáz enzim szubsztrátja az ONPG volt. Az ONPG a β-β-galaktozidáz enzim jelenlétében sárga színreakciót mutat és a végtermék optikai denzitása mérhető. Az F9 sejtek már az olyan alacsony retinsav koncentrációra is reagálnak, mint a 1 nM (14/A ábra). A kiértékelések során az F9 sejteken mért alap optikai denzitást tekintettük 100%-nak (kontroll) és ehhez viszonyítottuk a többi tenyészetben mért értéket.

68

13. ábra: Az asztrogliasejtek retinsav termelésének kimutatása retinsav szenzitív F9 sejtek segítségével. A: Az F9 riporter sejtek β-galaktozidáz enzim termelése a kontroll tenyészetekben illetve B: retinsav kezelés hatására. C: F9 sejtek reakciója asztrogliasejtek környezetében. D: A C képen látható tenyészet GFAP immunfestés után. E: Fibroblaszt sejtek környezetébe helyezett F9 sejtek (piros nyíl). F: Az F9 sejtek β-galaktozidáz enzim termelésének kimutatása fotometriás méréssel, sárga színű, ONPG nevű szubsztráttal. Mérce (fekete): 10 μm; (fehér): 50 μm. (p<0,05)

Az optikai denzitás jelentősen megemelkedett az asztroglia/F9 közös tenyészetekben, tehát az F9 sejtek retinsav tartalmat jeleztek a gliális környezetben, amikor egy hétig illetve két hétig fenntartott asztroglia tenyészetekkel dolgoztunk (13/F ábra). Ezzel szemben a fibroblaszt sejtek nem váltották ki az F9 sejtekben az enzim termelődését. Abban az esetben, amikor az asztroglia/F9 ko-kultúrákat retinsav receptor antagonistával kezeltük, gátolva a retinsav szignalizációt, az asztroglia által indukált riporter sejtek aktivációja elmaradt. Ennek magyarázata, hogy a retinsav receptor antagonista meggátolta, hogy az F9 sejtek környezetében levő retinsav a receptorhoz kötődve elindítsa a β-galaktozidáz mRNS-ének átíródását, és így nem tette lehetővé az enzim szintézisét (13/F ábra).

69

4.1.2.3. F9 sejtek aktiválódása kontakt és nem-kontakt ko-kultúrákban

Az eddigi kísérletek mindegyikében kontakt ko-kultúrában inkubáltuk együtt az F9 sejteket az asztrogliasejtekkel. Kíváncsiak voltunk, vajon az idegi irányú indukcióhoz hasonlóan, itt is működik-e az aktiválás nem-kontakt ko-kultúrákban, ahol a kétféle sejttípus között nincs közvetlen sejt-sejt kapcsolat. A korábbiakban bemutatott módon (7/D ábra) az F9 sejteket üveglemezen ragasztottuk be az asztrogliatenyészetekbe.

A kapott eredmények (14/B ábra) alátámasztják a korábbi feltevésünket, amely szerint a retinsav kiszabadul az asztrogliasejtekből és a folyadékközegen keresztül hatással van az F9 sejtekre. Ezzel szemben a kondicionált médium, amelyet frissen gyűjtöttünk a 24 órája szérummentes tápban tartott asztrogliasejtekről, nem aktiválta az F9 sejtekben a β-galaktozidáz enzim termelődését. Ez az eredmény azt a korábbi megfigyelést támasztja alá, amely szerint a kondicionált médium nem alkalmas az idegi irányú differenciáció kiváltására sem. Ennek magyarázata lehet, hogy a szérummentes környezetben a retinsav ugyanúgy ki van téve a környezeti hatásoknak (fény, oxidáció), ebben az esetben azonban nincsenek védő hatású szérumalkotók a közegben, mint például a szérum albumin vagy az Rbp.

A tenyésztett asztrogliasejtek tehát rendelkeznek a retinsav előállításához szükséges enzimekkel, és az általuk termelt retinsav kimutatható a retinsav érzékeny bioassay alkalmazásával.

14. ábra: A: Az asztrogliasejtek érzékenysége retinsav kezelés hatására. A retinsavat különböző koncentrációkban adtuk az F9 sejtek tenyészeteihez (10^-6 – 10^-10 M). B: F9 sejtek β-galaktozidáz aktivitása kontakt és nem-kontakt ko-kultúrákban, illetve kondicionált médium kezelés hatására. (p<0,05)

70