Filogenetikai analízis
DNS-kivonás, felszaporítás, szekvenálás
A filogenetikai vizsgálathoz a 1. táblázatban feltüntetett 93 törzset használtuk, melyeket a CBS (Utrecht, Hollandia) törzsgyűjteményéből szereztük be. A genomi DNS izolálása az Ultraclean Microbial DNA isolation kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, USA) felhasználásával történt a gyártó utasításainak megfelelően. Az RPB1, RPB2, Tsr1, Cct8, MCM7 és Acl1 lókuszok szakaszai kerültek amplifikálásra, majd szekvenálásra a 2. táblázatban feltüntetett indítószekvenciák segítségével. A PCR-elegyek végtérfogata 25 µl volt, összetételük az alábbi:
- 2,5 µl 10-szeres PCR puffer - 0,75 µl 50 mM MgCl2
- 1,85 µl 1 mM dNTP mix - 0,5-0,5 µl 100 mM primer - 16,55 µl steril bidesztillált víz
- 0,1 µl Taq- polimeráz enzim (BioTaq, Bioline) - 1 µl templát DNS
A PCR során a következő programot alkalmaztuk:
1.) denaturáció: 30 másodperc, 94 °C 2.) hibridizáció: 30 másodperc, 51-47 °C 3.) polimerizáció: 60 másodperc, 72 °C 4.) utópolimerizáció: 10 perc, 72 °C
Az 1-3. lépések összesen 40 ciklusban ismétlődtek. Az első öt ciklusban a hibridizáció hőmérséklete 51 °C volt, ezt 5 ciklusban 49 °C-os hibridizációs hőmérséklet követte, majd az utolsó 30 ciklusban a primerkötődés 47 °C-on zajlott. Végül utópolimerizációs lépésként 72
°C-ot alkalmaztunk 10 percen keresztül. A reakció végén a fölöslegben jelenlévő primer oligonukleotidokat és a dNTP mix maradékát QIAQuick PCR Purification Kit (Qiagen) segítségével távolítottuk el. A megtisztított PCR-termékeket 50 µl steril bidesztillált vízben szuszpendáltuk.
26 1. táblázat: A filogenetikai analízisbe bevont Aspergillus törzsek (NB = nem besorolt)
Nemzetség Faj Szekció Típustörzs
Aspergillus aculeatus Nigri 172.66T
Aspergillus aeneus Aenei CBS 128.54
Aspergillus allahabadii Terrei CBS 164.63
Aspergillus ambiguus Terrei CBS 117.58
Aspergillus amylovorus Usti 600.67T
Aspergillus arenarius Nigri 463.65NT
Aspergillus aureofulgens Terrei 653.74T
Aspergillus avenaceus Flavi 109.46NT
Aspergillus biplanus Sparsi 468.65NT
Aspergillus bisporus Bispori 707.71T
Aspergillus brasiliensis Nigri CBS 101740
Aspergillus calidoustus Usti 121611
Aspergillus campestris Candidi CBS 348.81
Aspergillus candidus Candidi 566.65NT
Aspergillus cervinus Cervini 196.64NT
Aspergillus clavatoflavus Flavi 473.65NT
Aspergillus clavatus Clavati 128202
Aspergillus conjunctus Sparsi 476.65NT
Aspergillus coremiiformis Flavi 553.77T
Aspergillus deflectus Usti CBS 109.55
Aspergillus duricaulis Fumigati CBS 481.65
Aspergillus eburneocremeus Aenei CBS 130.54
Aspergillus egyptiacus Usti 656.73NT
Aspergillus elongatus Usti CBS 387.75
Aspergillus flavus Flavi NRRL 3357
Aspergillus fumigatus Fumigati Af293
Aspergillus funiculosus Sparsi 116.56NT
Aspergillus gorakhpurensis Cremei CBS 648.74
Aspergillus gracilis Restricti CBS 115.36
Aspergillus heteromorphus Nigri CBS 117.55
Aspergillus heyangensis Aenei CBS 101751
Aspergillus implicatus Sparsi CBS 484.95
Aspergillus ivoriensis Raperi CBS 551.77
Aspergillus janus Terrei 118.45T
Aspergillus kanagawaensis Cervini 538.65NT
Aspergillus leporis Flavi 151.66T
Aspergillus microcysticus Terrei CBS 120.58
Aspergillus niger Nigri 513.88
Aspergillus niveus var. indicus Terrei CBS 444.75 Aspergillus ochraceoroseus Ochraceorosei 101887
Aspergillus ochraceus Circumdati 108.08NT
27
Nemzetség Faj Szekció Típustörzs
Aspergillus panamensis Sparsi CBS 120.45
Aspergillus penicillioides Restricti 130294
Aspergillus proliferans Aspergillus CBS 121.45
Aspergillus pulvinus Cremei 578.65NT
Aspergillus raperi Raperi CBS 123.56
Aspergillus restrictus Restricti 117.33NT
Aspergillus robustus Circumdati 649.93T
Aspergillus roseoglobosus Circumdati CBS 112800
Aspergillus saccharolyticus Nigri CBS 127449
Aspergillus sclerotiorum Circumdati CBS 549.65
Aspergillus silvaticus Silvati CBS 128.55
Aspergillus sparsus Sparsi 139.61NT
Aspergillus steynii Circumdati 112812T
Aspergillus subsessilis Terrei CBS 502.65
Aspergillus sydowii Versicolores 264.81
Aspergillus terreus Terrei NIH 2624
Aspergillus togoensis Flavi 272.89
Aspergillus versicolor Versicolores 245.65
Aspergillus viridinutans Fumigati CBS 127.56
Aspergillus wentii Cremei 104.07NT
Aspergillus westerdijkiae Circumdati CBS 112803
Aspergillus zonatus Flavi 506.65NT
Aspergillus tamarii Flavi SZMC 21469
Basipetospora halophila Polypaecili 380.74T
Chaetosartorya stromatoides Cremei CBS 265.73
Cristaspora arxii Cremei 525.83T
Dichotomomyces cejpii Clavati 157.66NT
Emericella aurantiobrunnea Nidulantes CBS 465.65
Emericella heterothallica Usti CBS 489.65
Emericella nidulans Nidulantes FGSC A4
Eurotium amstelodami Aspergillus 518.65NT
Eurotium herbariorum Aspergillus 516.65NT
Fennellia flavipes Terrei 260.73T
Fennellia neonivea Terrei CBS 115.27
Fennellia nivea Flavipedes CBS 261.73
Hamigera avellanea NB 295.48IsoT
Hemicarpenteles thaxteri NB CBS 105.25
Neocarpenteles acanthosporum Clavati 558.71T
Neosartorya fennelliae Fumigati CBS 598.74
Neosartorya fischeri Fumigati NRRL 181T
Neosartorya pseudofischeri Fumigati CBS 208.92
Neosartorya stramenia Fumigati CBS 498.65
Penicillium inflatum Cremei CBS 682.70
28
Nemzetség Faj Szekció Típustörzs
Petromyces alliaceus Flavi CBS 542.65
Phialosimplex caninus Polypaecili 128032T
Phialosimplex chlamydosporus Polypaecili 109945T Phialosimplex sclerotialis Polypaecili 366.77T
Polypaecilium insolitum Polypaecili 384.61
Sclerocleista ornata NB 124.53NT
Sclerocleista thaxteri NB 105.25
Talaromyces marneffei NB ATCC18284
Warcupiella spinulosa NB 512.65NT
2. táblázat: A filogenetikai rekonstrukció során felhasznált indítószekvenciák
Lókusz Primer Szekvencia (5’-3’) PCR termék
mérete (bp)
29 A PCR-termékek szekvenálását a CBS Gombakutató Központban (Utrecht, Hollandia) végeztük. A szekvenciákat mindkét irányból leolvastuk. A felhasznált indítószekvencia-párok megegyeztek a PCR során használtakkal. A reakció összemérésénél a DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit-et (Amersham Bioscience) használtuk. A szekvenáló reakció végtérfogata 10 µl volt, melynek összetétele a következőképpen alakult:
- 0,85 µl BigDye reagens - 3 µl puffer
- 4,75 µl bidesztillált víz - 0,4-0,4 µl 10 mM-os primer - 1 µl templát DNS.
A reakció termékeit Sephadex G-50 oszlopokon (Amersham Bioscience) tisztítottuk a gyártó utasításainak megfelelően. A forward és reverz szekvenciákat a LeserGene programcsomag SeqMan programjának segítségével állítottuk össze kontiggá.
Filogenetikai rekonstrukció
A szekvenciák illesztését PRANK v.140603 módszerrel végeztük az alapértelmezett beállítások mellett (Löytynoja 2014). Az egyedi szekvenciákat a SequenceMatrix 1.8 program segítségével fűztük össze (Vaidya és mtsai. 2011). Az adathalmazból a PhyML programmal egy Maximum Likelihood (ML) törzsfát generáltunk (Silvestro és Michalak 2012). Az analízis során GTR+Γ nukleotid-szubsztitúciós modellt alkalmaztunk. Az elágazások megbízhatóságának ellenőrzésére bootstrap analízist alkalmaztunk 1000 ismétlésben. A Bayes-i analízBayes-is során a MrBayes 3.2.6 szoftvert alkalmaztuk (RonquBayes-iest és mtsaBayes-i. 2012) GTR+Γ nukleotid-szubsztitúciós modell mellett. Az alkalmazott generációszám 107, a „burnin” 25%
volt. A két független futás alatt minden 1000. generációból történt a mintavétel. A robotok száma négy volt (1 hideg és 3 meleg lánc). Külcsoportnak egy Talaromyces marneffei törzset (ATCC 18224) választottunk.
Az A. niger és az A. welwitscheae testvérfajok közötti különbségek vizsgálata
UP-PCR analízis
Az analízis során a 3. táblázatban feltüntetett 8 primert használtuk fel. A mintázatokból összesen 88 fragmentumot vettünk figyelembe a bináris mátrix elkészítésénél. A filogenetikai analízist a PHYLIP programcsomag 3.67 (Felsenstein 2007) verziójának programjaival
30 végeztük. A filogenetikai fát „neighbor joining” módszerrel készítettük (Saitou és mtsai. 1987), a programcsomag Neighbor programjával.
3. táblázat: A UP-PCR analízis során használt indítószekvenciák (Bulat és mtsai. 1994, 2000, Lübeck és mtsai. 1998).
Primer neve Szekvencia (5’-3’)
L45 GTAAAACGACGGCCAGT
As15inv CATTGCTGGCGAATCGG
L15/As19 GAGGGTGGCGGCTAG
AA2M2 CTGCGACCCAGAGCGG
L21 GGATCCGAGGGTGGCGGTTCT
3-2 TAAGGGCGGTGCCAGT
AS4 TGTGGGCGCTCGACAC
AS15 GGCTAAGCGGTCGTTAC
UP-PCR program:
1.) elődenaturáció: 1 perc, 94 °C 2.) denaturáció: 30 másodperc, 94 °C 3.) hibridizáció: 45 másodperc, 55 °C 4.) polimerizáció: 1 perc, 72 °C 5.) utópolimerizáció: 2 perc, 72 °C
A 2-4. lépéseket 35 ciklusban hajtottuk végre.
Fülfertőzésekből származó fekete Aspergillus izolátumok vizsgálata
Vizsgált törzsek
A vizsgálathoz 14 Magyarországról és 7 Iránból származó törzset használtunk. A magyar törzseket a Szegedi Tudományegyetem Szent-Györgyi Albert Klinikai Központjából szereztük be, az iráni törzsek pedig a Jundishapur Orvostudományi Egyetemről érkeztek (Ahvaz, Irán).
31 Tiszta tenyészet létrehozása
Az izolátumokat MEA (Biolab, Magyarország) táptalajon tenyésztettük 5 napig 25°C-on, majd YPD (1% élesztőkivonat, 1% pept25°C-on, 1% D-glükóz, 2% agar) ferde agarra oltottuk át, további 5 napig inkubáltuk 25°C-on, majd 4°C-on tároltuk.
A micélium felszaporítása, DNS izolálás
A DNS-kivonáshoz a micélium felszaporítását mikrocentrifuga-csövekben végeztük. 1 ml YPD tápoldatba (1% élesztőkivonat, 1% pepton, 1% D-glükóz) egy kacsnyi mintát oltottunk a tiszta tenyészetekből, majd 3 napig 25 °C-on rázattuk (120-150 rpm). Amennyiben megfelelő növekedést tapasztaltunk, a mikrocentrifuga-csöveket 10000 rpm-es fordulatszámon (12350 g) centrifugáltuk 3 percig, majd eltávolítottuk a tápoldatot a leülepedett micélium tetejéről. A DNS-kivonáshoz az Epicentre Biotechnologies® MasterPure™ Yeast DNA Purification Kit-et használtuk a gyártó utasításainak megfelelően. A micéliumhoz steril homokot és lízis-puffert adtunk, és mikropisztillus segítségével mechanikai roncsolást alkalmaztunk. A DNS kivonatokat 20°C-on tároltuk.
Az izolátumok molekuláris azonosítása kalmodulin szekvenciák alapján
Cmd5 és Cmd6 indítószekvenciák (Hong és mtsai. 2006) a következők voltak:
Cmd5: CCGAGTACAAGGAGGCCTTC
Cmd6: CCGATAGAGGTCATAACGTGG
A kalmodulin PCR-reakcióelegy összetétele (20 µl-es végtérfogatban):
Egyszeres töménységű Dream Taq puffer (1,5 mM MgCl2-ot tartalmaz) (Thermo Scientific)
0,02 mM dNTP-oldat (Thermo Scientific) 4-4 pmol Cmd5 és Cmd6 primer
0,2 µl (1 U) Dream-Taq DNS-polimeráz (Thermo Scientific) 1 µl (10-100 ng) templát DNS
32 A kalmodulin PCR program:
A kívánt génszakasz sokszorosítására a Bio-Rad cég MJ Mini Gradient Thermal Cycler készülékét használtuk. A reakció lépései a következők voltak:
1.) elődenaturáció: 2 perc, 95 °C 2.) denaturáció: 30 másodperc, 95 °C 3.) hibridizáció: 40 másodperc, 56 °C 4.) polimerizáció: 45 másodperc, 72 °C 5.) utópolimerizáció: 2 perc, 72 °C
A 2-4. lépéseket 35 ciklusban ismételtettük.
Gélelektroforézis
A PCR-termékeket 1%-os agaróz gélen futtattuk 5-10 V/cm feszültség mellett horizontális gélelektroforézis készülék segítségével. A DNS-termékek méretének meghatározásához Gene Ruler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific) molekulasúly-markert használtunk. A fragmentumok láthatóvá tételéhez GR Green DNS-festéket használtunk. Futtatás után a DNS-sávokat 254 nm-es UV-átvilágítással tettük láthatóvá. A gélfotók elkészítéséhez az UVP cég BioDoc-It™ géldokumentációs berendezését használtuk.
A PCR-termékek szekvenálása a filogenetikai rekonstrukciónál leírtakhoz hasonlóan történt.
A fajok meghatározása, törzsfa készítése
A szekvenciákat a BioEdit programmal jelenítettük meg, majd ezeket egyenként a PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) internetes adatbázisával vetettük össze „nucleotide BLAST” segítségével (Altschul és mtsai. 1990). A szekvenciákat a MEGA szoftvercsomag 4.
verziójának segítségével illesztettük (Tamura és mtsai. 2007). A hiányzó nukleotidokat a program ötödik karakterállapotként kezelte. A parszimónia szempontjából nem informatív karaktereket kizártuk. A program minden karaktert azonos súllyal vett figyelembe. A topológia megbízhatóságának ellenőrzésére bootstrap analízist alkalmaztunk 1000 ismétlésben (Hillis és Bull 1993). Külcsoportnak egy A. flavus törzset vontunk be a vizsgálatba.
Fülfertőzésekből származó fekete Aspergillus izolátumok antifungális szerekkel szembeni érzékenységének vizsgálata
Az kiválasztott antifungális szerek in vitro antifungális aktivitását leveshígításos mikrodilúciós módszerrel vizsgáltuk a Klinikai és Laboratóriumi Standardok Intézetének
33 (Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI) ajánlása alapján (NCCLS 2002). A minimális gátló koncentráció (minimum inhibitory concentration - MIC) értékeket 96 lyukat tartalmazó mikrotiter-lemezeken határoztuk meg úgy, hogy az optikai denzitást (OD) mértük 620 nm-en Jupiter HD mikrotiterlap-olvasó fotométer segítségével (ASYS Hitech GmbH, Eugendorf, Ausztria). A vizsgálathoz RPMI 1640 médiumot (Sigma-Aldrich) használtunk, mely tartalmazott L-glutamint, de nem tartalmazott Na-bikarbonátot. A tápleves pH-ját 7,0-re állítottuk be 0,165 M MOPS-oldat hozzáadásával.
Az izolátumokat YPD agarlemezen tenyésztettük 5 napig 25 °C-on, majd konídium-szuszpenziót készítettünk steril fiziológiás sóoldatban. A konídiumok számát Bürker-kamra segítségével határoztuk meg, és 5x104 konídium/ml értékre állítottuk be. Ehhez a hígítást RPMI 1640 táplevesben végeztük. A vizsgálatba a következő antifungális szereket vontuk be:
flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, terbinafin, amfotericin B (Sigma-Aldrich). Az antifungális szereket DMSO-ban oldottuk fel. Az itrakonazol, terbinafin és amfotericin B esetében 0,031-16 µg/ml, a ketokonazolnál 0,062-32 µg/ml, míg flukonazolnál 0,125-64 µg/ml koncentráció-tartományt állítottunk be felező hígítással. A lemezeket 35 °C-on inkubáltuk 48 órán keresztül, majd meghatároztuk azt a koncentrációt, amely 100%-os növekedési gátlást eredményezett (MIC100).
Élelmiszereken előforduló fekete Aspergillus izolátumok
A vizsgált növényi részeket Diklorán-bengálrózsa-kloramfenikol (DRBC, 0,5% pepton, 1% glükóz, 0,1% KH2PO4, 0,0002% Dichloran, 0,05% MgSO4, 0,01% kloramfenikol, 0,0025%
bengálrózsa, 2% agar) agarlemez felületére helyeztük, majd a lemezeket 3 napig 25 °C-on, sötétben inkubáltuk. A tenyészetekből YPD agarlemezeken tiszta tenyészeteket készítettünk. A törzseket YPD ferde agaron, 4 °C-on tároltuk. A fajszintű azonosításhoz és a törzsfa készítéséhez a fülfertőzésekből származó törzsek esetén alkalmazott módszereket használtuk.
Fumonizin-extrakció
A vizsgált élelmiszerek fumonizin-tartalmának vizsgálata során a növényi részek 1 g-jához 8 ml metanol:víz (1:3, v/v) elegyet mértünk. UltraTurrax T25 (IKA, Staufen, Németország) nagysebességű homogenizátort alkalmazva rázattuk a mintákat (20000 rpm, 4 perc) majd 10 percig 10000 rpm fordulaton centrifugáltuk. A felülúszó fumonizintartalmát közvetlenül mértük RP-HPLC/ESI-IT-MS2 (Reversed-Phase High-Performance Liquid
34 Chromatography with Electrospray Ionization Ion Trap Tandem Mass Spectrometry) technikát alkalmazva.
Az izolátumok fumonizintermelő képességének vizsgálata során a törzseket CYA20S táptalajon (20% szacharóz, 0,5% élesztőkivonat, 0,1% K2HPO4, 0,03% NaNO3, 0,005% KCl, 0,005% MgSO4, 0,0001% FeSO4, 0,0001% ZnSO4, 0,00005% CuSO4, 2% agar) tenyésztettük 25 °C-on, 7 napig. Az agarlemezekből dugófúróval 5 db 6 mm átmérőjű korongot vágtunk ki csészénként. Az extrakciót 6 ml metanol:víz (3:1; v/v) elegyével végeztük. A fent említett nagysebességű homogenizátort alkalmazva rázattuk a mintákat (20000 rpm, 4 perc), majd 10 percig 10000 rpm fordulaton centrifugáltuk. A felülúszóból 2 ml-t beszárítottunk, majd újra feloldottuk 500 µl metanol:víz (3:1, v/v) elegyében. Ennek fumonizintartalmát közvetlenül vizsgáltuk RP-HPLC/ESI-IT-MS2 technikával.
Az analízis reverz fázisú HPLC/ESI-IT_MS módszerrel történt (Bartók és mtsai. 2006, 2010), egy Agilent 1090 Series II HPLC (Waldbronn, Germany) készülékkel. A HPLC elválasztást YMC-Pack J’sphere ODS H80 (YMC Europe GmbH, Dinslaken, Németország) (250 mm x 2,1 mm, 4 µm) HPLC oszlopokon végeztük. Az oldószergrádiens alkotói egyrészt desztillált víz és 0,1% hangyasav, másrészt acetonitril és 0,1% hangyasav voltak. Egy-egy µl mintát fecskendeztünk az oszlopokra. Az elválasztott vegyületeket Varian (Palo Alto, CA, USA) 500 IT-MS készülékkel detektáltuk, melyhez egy ESI forrás volt csatlakoztatva. A különböző fumonizin izomerek mennyiségét kalibrációs egyenes alapján számoltuk ki.
35