4. 1. Az Erysiphe necator Shwein ellen alkalmazható QoI-hatóanyagok és fungicidek ültetvényben történő összehasonlító vizsgálata
4. 1. 1. A kísérletek helye
A szabadföldi kísérletek 2008. kora tavaszán, a Balaton-felvidéki borvidéken kerültek beállításra. A terület kiválasztása során az volt a cél, hogy a mai üzemi gyakorlatnak megfelelő termesztéstechnológiával lehessen a kísérletet elvégezni.
A vizsgálatokat a Pannon Egyetem Georgikon Nonprofit Kiemelten Közhasznú Társaság kísérleti szőlészetében jelöltük ki, mely a Dunántúli-középhegység természetföldrajzi nagytájon belül a Bakonyvidék középtáj, a Keszthelyi-hegység és azon belül a Keszthelyi-fennsík kistáj DNY-i peremén helyezkedik el Cserszegtomaj községtől ÉK-i irányban (F.2. 1. ábra).
A pontos helymeghatározás céljából a vizsgálatok GPS-koordinátái a következők: 1.
kísérlet (Olasz rizling GK 1): 46.795307, 17.261017; 2. kísérlet (Merlot CI 181): 46.794768, 17.260771 (F. 2. 2.; F. 2. 3. ábra). A terület észak-keleti lejtésű és minden második sor füvesített. A sorok alját gyomirtottuk. A két tábla tájolását az 5. ábra, illetve elhelyezkedésüket az F.2. függelék szemlélteti. Az ’Olasz rizling GK 1’ vizsgálati területet az uralkodó szélirányra (É) merőlegesen, míg, a ’Merlot CI 181’ fajta vizsgálati területet azzal párhuzamos irányban alakítottuk ki. Az ültetvény légátjárhatósága a zöldmunkák időszakos elvégzésével biztosított volt. A metszést követően a nyesedéket eltávolítottuk az ültetvényből.
A kísérleti területen a talajvízszint mélysége 200 cm alatti. A termőréteg 150 cm-nél vastagabb. A humuszos réteg vastagsága sekély-közepes. Kémiai tulajdonságait elemezve látható, hogy a talajszintek gyengén lúgos kémhatásúak. A fizikai talajféleséget tekintve a terület talaja közepesen kötött homokos vályog. A fiziológiás mésztartalom közepes-magas mértékű. Mérhető mennyiségű vízoldható só csak elenyésző mennyiségben található a talajban. A humusztartalom alacsony, a forgatási mélység súlyozott átlagában a humusztartalom 1,36%. A terület foszforral és káliummal igen jól ellátott. A magnéziumellátottság jó, a mangán-, a réz- és a cinkellátottság túlzott. Az ásványinitrogén-ellátottság közepes. A talaj típusa: közép- és délkelet-európai barna erdőtalajok főtípusába tartozó Ramann-féle barna erdőtalaj visszameszeződött altípus.
43 4. 1. 2. A kísérletek anyaga
4. 1. 2. 1. A vizsgált szőlőfajták és termesztéstechnológiájuk
Olasz rizling (G.K. 1 klón): Magyarország legelterjedtebb szőlőfajtája. Az alapfajta származása nem tisztázott, 1956-ban lett államilag minősített fajta (Csepregi és Zilai 1988). A vizsgálatban szereplő klón 1980-ban kapott állami elismerést. Tőkéje középerős, vagy gyenge, sűrű, vékony vesszőzetű. Vesszői vékonyak, egyenesek és szalmasárgák, világosbarna csíkozásúak. Levele középnagy vagy kicsi, változatosan tagolt, levélszéle fűrészes, felülete alig hólyagos, inkább sima, fonáka pókhálós. Szövete vékony, finom. A vizsgálatba vont klón – az alapfajtával megegyezően – gombabetegségekkel szemben közepesen ellenálló (Bakonyi és Kocsis 2006). A telepítés 1993-ban Cserszegtomajon történt 3 m x 1 m-es tenyészterületre. Az oltványok alanya Teleki 5C volt, az ültetvény művelésmódja középmagas kordon, rövidcsapos metszéssel. A vizsgálatba kezdetben 397 db tőkét vontunk be (3. ábra).
3. ábra. Az ’Olasz rizling GK 1’ fajtában 2008-ban beállított kísérlet vázlata.
Merlot (CI 181 klón): A világ egyik legelterjedtebb szőlőfajtája. A XVIII. század végén jegyezték fel először a Bordeaux-i borvidéken. 1973-ban lett államilag minősített fajta (Csepregi és Zilai 1988). Tőkéje középerős, erős vesszőzetű. Vesszői középerősek, barnás-vörösek. Levele középnagy, felülete sima, fonáka enyhén molyhos. A vizsgálatba vont klónt 1996-ban Teleki Kober 125AA alanyra telepítették. Az ültetvény művelésmódja középmagas
44
kordon, rövidcsapos metszéssel, 2,3 x 1 m-es térállásban. A vizsgálatba kezdetben 226 db tőkét vontunk be (4. ábra).
4. ábra. A ’Merlot CI 181’ fajtában 2008-ban beállított kísérlet vázlata.
A vizsgálat második és harmadik évében – állagfenntartási okokból – mindkét kísérletben csökkentettük a tőkeszámot, az ’Olasz rizling GK 1’-ben 235 db, míg a ’Merlot CI 181’-ben 112 db tőkére (5. ábra). A tőkeszám-csökkentést az ültetvényben keletkező gazdasági károk enyhítése érdekében tettük.
5. ábra. Az ’Olasz rizling GK 1’ és ’Merlot CI 181’ fajtákban 2009-ben és 2010-ben beállított kísérletek vázlata.
A két kísérletet két egymástól mintegy 50 m távolságban lévő, egymástól elkülönülő táblában állítottuk be.
45 4. 1. 2. 2. A vizsgálatba vont fungicidek hatóanyagai
A QoI-fungicidek kiválasztásánál törekedtünk a gyakorlatban széles körben használt valamennyi hatóanyag vizsgálatára. A QoI-fungicidek és kiegészítő szerek dozírozását az egyes készítmények használati útmutatójában szereplő, területegységre számított mennyiségnek megfelelően határoztuk meg. A készítményeket 2008-ban 10 liter/ kezelés permetlével jutattunk ki. A permetlé mennyiségét az első kísérleti évben soknak találtuk, ezért 2009-ben és 2010-ben 5 liter/ kezelés mennyiségre csökkentettük.
Az ültetvényben végzett összehasonlítás során és az alkalmazott fungicidek vizsgálati területre történő átsodródásának kiküszöbölésére a vegetáció kezdetén a vizsgált területek mindkét oldalán kezdetben 6-6 sor, majd a vegetáció előrehaladtával 4-4 sor izolációs távolságot hagytunk el. A kísérletekben két vizsgálati parcellán négy vizsgálati csoportot alakítottunk ki (F.3.). Közülük az I. számú csoportban kizárólagosan QoI-fungicid hatóanyagokat alkalmaztunk. A II. számú csoport kialakításának elve a gyakorlatban is alkalmazott QoI-fungicidek azon csoportját foglalta magába, melyek egyéb más hatóanyagcsoporttal kerülnek alkalmazásra és Plasmopara viticola ellen is hatásosak. A III.
számú csoport a II. csoport kiegészítése más Erysiphe necator ellen alkalmazott hatóanyagokkal. A IV. csoportban a 2008-2010-es években a BASF, a Bayer és a Syngenta növényvédőszer-gyártó cégek aktuális védekezési programja alapján végeztük a permetezéseket. A permetezések során az adott cégek által forgalmazott vegyszereket használtuk fel az általuk javasolt sorrend és dózis betartása mellett. Kontrollként kezeletlen parcellákat jelöltünk ki a vizsgálati területen belül. A vizsgálati csoportokat és parcellákat az egymást követő években mindig ugyanazon parcellára helyeztük.
A fungicides védekezések mellett az inszekticidek, illetve a herbicidek esetleges gombagyérítő hatását nem vettük figyelembe. A vizsgálati években nem alkalmaztunk sem tavaszi sem vegetáció utáni téli lemosópermetezést annak érdekében, hogy a területen kialakuló, vagy meglévő esetlegesen toleráns/rezisztens állományok felszaporodását ne akadályozzuk.
A kijuttatáshoz SOLO 450 típusú (F.7.3.) 10 l-es tartállyal rendelkező motoros háti permetezőgépet használtunk. A permetezés során a szórás erősségét úgy állítottuk be, hogy a permetlé a teljes lombfelületet egységesen befedje. Minden védekezés előtt ellenőriztük a szórásképet az esetleges megfolyás elkerülése érdekében. A permetezések levélfedettsége ezzel megközelítette az erőgéppel működtetett permetezőgépek hatékonyságát.
46
A hatóanyagok és vegyszerek megfelelő hektáronkénti adagjait alkalmaztuk a 2008.
évben melyet tömegkoncentrációban adtunk meg. A gyártói technológiáknál a permetlé mennyiségére vonatkoztatott hektáronkénti dózist mértük be. A 2009-es évben a korábban is alkalmazott hatóanyagokat használtuk. A gyártói programokban alkalmazott vegyszereknek hektáronkénti dózisát, és a hatóanyagok oldat-tömegkoncentrációját 2009-ben a mindenkori hektáronkénti mennyiség kétszeresére növeltük. A dózis emelésének oka a rezisztencia/tolerancia jelenlétének további igazolása és szabadföldi körülmények közötti határozottabb elkülöníthetősége volt. A 2010-es évben a készítmények dozírozásán a 2009-ben alkalmazottakhoz képest nem változtattunk. Tömegkoncentráció képlete:
Önálló QoI-hatóanyagok (I. csoport) (1. táblázat):
Piraklostrobin: A BASF Comet nevű BAS 500 01F kódjelű EC formulációjú kísérleti készítménye, amely 250 g/l piraklostrobint tartalmaz. Alkalmazott adagja 1 l/ha volt.
Azoxistrobin: A Syngenta Quadris nevű SC formulációjú készítménye 250 g/l azoxistrobin-tartalommal. Alkalmazott dózis 1 l/ha volt.
Trifloxistrobin: A Bayer Zato 50 WG nevű készítménye, melynek hatóanyagtartalma 50%
trifloxistrobin. Ezt 0,5 kg/ha-os adagban alkalmaztuk.
QoI-hatóanyagok Plasmopara viticola elleni hatóanyagokkal kiegészített kombinációi (II.
csoport) (1. táblázat):
Piraklostrobin + metiram: A BASF Cabrio Top nevű WG formulációjú készítménye.
Hatóanyagtartalma: 5% piraklostrobin + 55% metiram. Alkalmazott dózisa 2 kg/ha volt.
Azoxistrobin + folpet: A Syngenta Quadris Max nevű SC formulációjú készítménye.
Hatóanyagtartalma: 93,5 g/l azoxistrobin + 500 g/l folpet. Hektáronként 2 literes adagban juttattuk ki.
Trifloxistrobin + cimoxanil: A Bayer Eclair 49 WG nevű készítménye. Hatóanyagtartlama:
25% trifloxistrobin + 24% cimoxanil. Alkalmazott adagja 0,5 kg/ha volt.
Cimoxanil + famoxadon: A DuPont Tanos 50 DF nevű készítménye. Hatóanyagtartlama:
25% cimoxanil +25 % famoxadon, amit 0,4 kg/ha-os adagban alkalmaztunk.
47
1. táblázat Az önállóan alkalmazott QoI-hatóanyagok (I.) és a peronoszpóra elleni hatóanyagokkal kombinált QoI hatóanyagok (II.) csoportja 2008-2010. években.
48
A QoI-hatóanyagok és a Plasmopara viticola elleni hatóanyagok kombinációinak lisztharmatölő hatóanyagokkal való kiegészítése (III csoport):
(Piraklostrobin + metiram) + kén: Cabrio Top + a BASF által gyártott Kumulus S. A 80% ként tartalmazó WG formulációjú Kumulus S-t hektáronként 4 kg-os adagban kombináltuk a 2 kg/ha-os dózisú Cabrio Top mellé.
(Trifloxistrobin + cimoxanil) + kén: Eclair 0,5 kg/ha-os és Kumulus S 4 kg/ha-os adagban alkalmazva.
(Azoxistrobin + folpet) + penkonazol: A Quadris Max és a Syngenta Topas 100 EC nevű készítményének kombinációja. A 10% penkonazolt tartalmazó Topas 100 EC-t 0,3 l/ha-os adagban elegyítettük a 2 l/ha-os dózisú Quadris Maxszal.
A kezelések éven belüli beéllítását a 2. táblázat szemlélteti.
49
2. táblázat A QoI-hatóanyagok peronoszpóra és lisztharmat ellen hatásos hatóanyagokkal kiegészített kombinációi (III.) 2008-2010. években.
Csoport Kezelés Vizsgálati
50
A gyártók komplex permetezési programjaiban szereplő egyéb készítmények
Ebben a kezelési csoportban a komplex védekezési programokat alkalmaztuk, melyben a QoI-hatóanyagok mellett más gombaölő szerek is szerepeltek (3. táblázat).
3. táblázat. A komplex programokban felhasznált növényvédő szerek.
Gyártó Termék neve Hatóanyagtartalom Kijuttatott dózis
BASF
Flamenco 100 g/l fluquinkonazol 0,5 l/ha
Forum R 60 g/kg dimetomorf + 400 g/kg
rézoxiklorid 3 kg/ha
Mythos 30 SC 300 g/l pirimetanil 2,5 l/ha
Vivando 500 g/l metrafenon 0,25 l/ha
BAYER
Falcon 460 EC 167 g/l tebukonazol + 43 g/l
triadimenol + 250 g/l spiroxamin 0,3 l/ha Melody Compact 49 WG 8,4 % iprovalikarb + 71,2 %
Pergado F 50 g/kg mandipropamid + 400 g/kg
folpet 2,5 kg/ha
A IV. csoport kezeléseit a 4. táblázat szemlélteti.
51 4. táblázat A gyártók komplex védekezési programjai (IV.) 2008-2010. években.
Csoport Kezelés Vizsgálati
52
A kísérleti terület sorainak kontroll tőkéi a kísérlet éveiben fungicides védelemben nem részesültek (Kontroll csoport) (F.3.).
A vizsgálati évek során 2008-ban 7, míg 2009-ben és 2010-ben 8-8 permetezést végeztünk (F.4.).
4. 1. 2. 3. A kísérleti terület klímatikus tényezőinek vizsgálata
A terület adottságai közül elsőként dél-keleti, vízfelületre néző fekvése a legszembetűnőbb (6. ábra). A vízfelület által biztosított kiegyenlítettebb klíma alapján egyenletesebb fertőzési nyomásra és kiegyenlítettebb évjárathatásra számítottunk. A vízfelület mikroklímatikus hatását ilyen szempontok alapján vettük figyelembe. A fertőzések jobb nyomonkövethetőségének érdekében, Methos típusú meteorológiai mérőállomással vettük fel a vizsgálati évek főbb időjárási adatait (F. 6). A mérések során, az automata mérőállomás által rögzített adatok közül, a lisztharmatgomba fertőzését leginkább befolyásoló időjárási paramétereket vettük figyelembe és követtük nyomon. Ezek a léghőmérséklet, a csapadék és a páratartalom voltak.
6. ábra. Az ’Olasz rizling GK1’ vizsgálati tábla és a Balaton.
53 4. 1. 3. A kísérletek beállítása, lefolytatása.
A szabadföldi vizsgálatok beállítása: A két különböző fajtában (‘Olasz rizling GK1’;
‘Merlot CI 181’) beállított kísérletben a kezeléseket 3 ismétlésben (2008-ban az ’Olasz rizling GK1’ fajtában 6 ismétlésben) végeztük. Egy ismétlést egy oszlopköz, azaz 5 tőke (’Olasz rizling GK1’) illetve 6 tőke (’Merlot CI 181’) jelentett 2008-ban. 2009-ben és 2010-ben az ismétlésenkénti tőkeszámot lecsökkentettük a ’Merlot CI 181’-es fajtában az ismétlésszám megőrzése érdekében. Kontrollként kezeletlen oszlopközöket/ tőkéket alkalmaztunk (Kontroll csoport). A vizsgálati csoportok a következők voltak: I. Önálló hatóanyagok; II. QoI-hatóanyagok Plasmopara viticola elleni hatóanyagokkal kiegészített kombinációi; III. QoI-hatóanyagok és a Plasmopara viticola elleni hatóanyagok kombinációinak lisztharmatölő hatóanyagokkal való kiegészítése; IV. A gyártók komplex permetezési programjai.
A felvételezések során egy 0-tól 5-ig terjedő skála alapján osztályoztuk a levelek fertőzöttségét azok lisztharmattal való borítottsága szerint, majd megállapítottuk a Townsend –Heuberger betegségfokot (Gartner 1971).
Az egyes parcellákon 50-50 levelet vizsgáltunk. Az összesített fertőzöttségi skála a 7.
ábrán látható. A levélfertőzöttséget a szabadföldi gyors értékelés céljából az ábrán látható módon értékeltük. A fertőzöttségi értékek alapján a %-os értékek is leírásra kerültek. A fertőzésmentes leveleket 0-ás szintnek, azaz 0 %-os fertőzöttségnek vettük. 1-es szintnek tekintettük a 0-5%-os fertőzöttséget, 2–es szintnek az 5-25 %-os fertőzöttséget, 3-asnak a 25-50%-ot, 4-esnek az 50-75%-ot és 5-ösnek a 75-100%-os fertőzöttséget.
7. ábra. Lisztharmat-borítottsági szintek a különböző fertőzöttségi kategóriákban.
54
Az éves védekezések megkezdése előtt általános állományfelmérést végeztünk a fertőzőképletek felmérése érdekében
A vegetációs időszakban végzett cserszegtomaji értékelések során a fertőzések egyértelműbb elbírálásához szúrópróba szerűen mintákat gyűjtöttünk a vizsgálati parcellákról, majd azokat binokuláris mikroszkópos vizsgálatnak vetettük alá, ahol a fertőzőképletek életképességét, illetve fejlettségi stádiumát vizsgáltuk (8. ábra). A fertőzöttségi szinteket (7.
ábra) ez alapján erősítettük meg.
8. ábra. Cserszegtomaji életképes minták (5X-378X nagyítási tartományban, 1X- 6,3X zoom tartományban).
A felvételezések során az egyes parcellákon belül található tőkék közül a középső, leginkább elszigetelt tőkét értékeltük. A vizsgálati évek során 2008-ban nyolc, míg 2009-ben és 2010-ben 10-10 értékelést végeztünk (F.4.).
4. 2. Az alkalmazott statisztikai módszerek
A fertőzöttségi adatokat évenként, kezelésenként és fungicidcsoportonként átlagoltuk.
A fungicidcsoportok átlagait az SPSS 13.0-ás verziójú statisztikai szoftverrel kéttényezős varianciaanalízisnek vetettük alá, ahol meghatároztuk a 95%-os konfidenciaszintet, majd ezt követően az egyes fungicidcsoportok egymáshoz viszonyított szignifikanciaszintjét. A vizsgált fajták esetében szintén meghatároztuk a 95%-os konfidenciaszintet és az egyes fajták fertőződésének szignifikanciáját. A fajták és a kezelések közötti összefüggéseket is hasonló módon vizsgáltuk.
55
4. 3. A szabadföldi kísérletekben használt QoI-fungicidek hatékonyságának in vitro vizsgálata
4. 3. 1. A vizsgálat helye
A Cserszegtomaji Tangazdaságban beállított 2008 és 2010 között végzett kísérletek önálló QoI-hatóanyagokkal permetezett parcelláiból begyűjtött levélmintákat in vitro vizsgálatoknak vetettük alá. Ezeket a vizsgálatokat a Pannon Egyetem Georgikon Karának Kertészeti Tanszékén és a Kar Biotechnológiai Csoportjánál végeztük.
4. 3. 2. A vizsgálat anyaga
A mintákat a vegetációs periódus végén szedtük, miután kialakult a végleges fertőzöttségi szint a lombozaton. Mindkét fajtában (’Olasz rizling GK 1’ és ’Merlot CI 181’) beállított kísérletből szedtünk mintákat, a parcellák középső tőkéjének középső termőalapjairól (9. ábra). A mintavételi hely meghatározásánál szempont volt, hogy minél jobban kizárjuk az esetleges permetlé-elsodródásból eredő hibás mintavétel lehetőségét. A szabadföldi kísérletektől eltérően, ennél a vizsgálatnál fertőzött fürtöket is begyűjtöttünk.
9. ábra. A Cserszegtomajon gyűjtött minták felvételezési helye a tőkén
56
A mintavételezés során tőkénként 1-4 db 4-6 leveles lisztharmattal fertőzött hajtást, valamit a bogyófertőzés idején 1-4 fürtöt gyűjtöttünk be. A mintákat annak érdekében, hogy a feldolgozásig ne károsodjanak, párás környezetben tároltuk. A párás környezet biztosítására nedves vattapamaccsal ellátott megfelelő méretű (30x50 cm) félig felfújt nejlonzacskókat alkalmaztunk. A szedés, a szállítás és a feldolgozás során a mintákat hűtőtáskában tároltuk (10. ábra).
10. ábra. A begyűjtött minták szállítása és feldolgozásig történő tárolása.
Az in vitro vizsgálatok megkezdése előtt binokuláris mikroszkóp (Nikon SMZ 800) alatt szemrevételeztük a lisztharmatgomba penészgyepének életképességét levélen és fürtön (11. ábra) annak érdekében, hogy biztosan életképes mintákkal dolgozzunk. A tenyészgyepeket, fertőzőképleteket, melyek kiszáradtak illetve sérültek voltak, életképtelennek ítéltük. Az ellenőrzést követően csak a leveleken talált életképes telepeket dolgoztuk fel.
11. ábra. Erysiphe necator friss penészgyepe a begyűjtött minták felszínén (5X-378X nagyítási tartományban, 1X-6,3X zoom tartományban).
57 4. 3. 3. A vizsgálat módszere
A minták feldolgozásának két módozatát alkalmaztuk:
Az első módszernél a 4-6 leveles hajtások 3 szintjéről (hajtásalaphoz közeli, középső és hajtásvég közeli) összeválogatott levelekről desztillált víz és ecset segítségével lemostuk a fertőzőképleteket tartalmazó penészgyepet. A szuszpenziót ezt követően egy-egy 2 ml-es Eppendorf csőbe injektáltuk 10 ml-es fecskendő segítségével. Az Eppendorf csöveket az elemzésig folyékony nitrogénben történő fagyasztás után -80 °C-on tároltuk.
A másik módszer esetében a hajtások 3 különböző levélemeletéről összeválogatott, fertőzőképleteket viselő leveleket feldaraboltuk. A feldarabolás során használt ollót az egyes hajtások és kezelési csoportok különböző parcelláiról származó minták feldolgozása között 80%-os etanolos oldattal és annak leégetésével fertőtlenítettük. A feldarabolt levelek fertőzött részeit ezek után fertőtlenített csipesszel 2 ml-es Eppendorf csövekbe helyeztük. A lezárt, katalogizált mintákat ebben az esetben is folyékony nitrogénben fagyasztottuk, és az elemzésig szintén -80 °C-on tároltuk (12. ábra).
12. ábra. Minták tárolása – 80°C-on.
58 4. 3. 3. 1. DNS-tisztítás
A DNS-tisztítást a 2010-ben gyűjtött mintákból végeztük el. A választás a Cserszegtomaji hatóanyag-vizsgálatok eredményei (Eredmények 5.1.) alapján esett erre az évre. A DNS-tisztítást cetiltrimetilammónium bromidos (CTAB) módszerrel (Doyle és Doyle 1990) végeztük, amelyet a jó minőségű DNS kivonásának érdekében tovább optimalizáltunk.
A -80°C-on tárolt levélmintákból 100 mg-ot helyeztünk Eppendorf csövekbe és 2 mg kvarchomokot adtunk hozzájuk. A kezdeti sejtfeltárást üveglándzsával történő zúzással végeztük. Ezt követően hozzáadtuk a feltárást segítő lízis puffert és tovább zúztuk.
Mintánként 600 µl lízis puffert (2% CTAB, 1,4 M NaCl, 0,2% 2-merkaptoetanol, 20 mM EDTA, 100 mM tris-HCl, 8,0 pH) használtunk, melyet előzetesen 60 °C-ra melegítettünk vízfürdőben. Ezt követően a mintákat 45 percre 60°C-os vízfürdőbe helyeztük. Az inkubálási idő alatt a mintákat három alkalommal 15 percenként a csövek oda-vissza forgatásával óvatosan összekevertük. A vízfürdő után szobahőmérsékleten állni hagytuk a mintákat, majd ezt követően a fehérjék eltávolítása érdekében 600 µl CIA-t (kloroform: izoamil-alkohol = 24:1) adtunk hozzájuk és 10 percig 90 rpm-mel szobahőmérsékleten rázattuk. A rázatás után 8000 rpm-en 15 percig centrifugáltuk (Hettich EBA 12). A centrifugálás után a felső vizes fázist (400 µl) tiszta Eppendorf csövekbe pipettáztuk, majd mintánként 500 µl előhűtött izopropanolt adtunk hozzá és 15 percre 4 °C-os hőmérsékleten inkubáltuk.
Az inkubáció után a mintákat 15000 rpm-en 10 percig centrifugáltuk. Az izopropanolos oldat eltávolítása után a pelletekhez 1 ml 99 %-os etanolt + 40 µl 3 M Na-acetát oldatot adtunk. A mintákat ezt követően 15000 rpm-en 10 percig centrifugáltuk, majd a folyadékot leöntöttük (13. ábra) és átmostuk 1 ml 75% etanollal, majd 8000 rpm-en 5 percig centrifugáltuk. Ezt követően a folyadékot eltávolítottuk. A pelleteket egy éjszakán át szobahőmérsékleten szárítottuk.
59
13. ábra. A pelletek 15000 rpm-es centrifugálás után.
Az inkubációs idő leteltével a pelleteket 100 µl TE pufferben (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 7,4 pH) visszaoldottuk. A visszaoldást követően NanoDrop (Thermo Scientific NanoDrop 2000 Spectrophotometer) segítségével megmértük a minták genomiális DNS-tartalmát (14. ábra) és egységesen 40-50 ng/ µl koncentrációra hígítottuk, majd - 20°C-on tároltuk őket.
Ezt a tisztítási eljárást mindkét mintavételezési módszer esetében elvégeztük.
14. ábra. A minták genomiális DNS-tartalmának ellenőrzése.
60
4. 3. 3. 2. E. necator fertőzött levélminták vizsgálata PCR technikával
Annak érdekében, hogy a mintáink gomba-DNS tartalmának megfelelő minőségét és mennyiségét ellenőrizzük, gomba specifikus ITS1-ITS4 primerekkel PCR-t végeztünk. A PCR reakciót Eppendorf Mastercycler 384-es készülékben futtatuk le. A reakcióelegy összetétele a következő volt: 40 ng DNS templát, 1,2 µl a primerekből (10 pmol) 1,2 mikroliter 2 mM dNTP (Fermentas, Litvánia), 1,5 µl DreamTaq PCR puffer, 0,2 U DreamTaq polimeráz enzim. A reakcióprofil a következő volt: 94°C 5 perc, 35 ciklus: 94°C 45 s, 55°C 30s, 72°C 80s, és a végső extenzió 72°C 10 perc. A QoI-rezisztencia kimutatására irányuló molekuláris vizsgálathoz a jó minőségű és detektálható mintákat választottuk ki.
4. 3. 3. 3. Primer tervezés a citokróm b gén pontmutációt tartalmazó szakaszára
A primer tervezés kiinduló pontja a citokróm b gén 329. nukleotid pozíciójában lévő és a QoI fungicidekkel szembeni rezisztenciáért más fajokban felelős mutációs pont kimutatása volt, melynek érdekében a mutációs pont két oldalára ún. belső, valamint e ponttól néhány száz bázispárral távolabb mindkét irányban ún. külső primereket terveztünk.
A primer tervezést a Blumeria graminis citokróm b génjének szekvenciájára alapoztuk. A B. graminis-hez és az Erysiphe necator-hoz filogenetikai értelemben közeli fajok citokróm b szekvenciáit kigyűjtöttük a NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) és DDBJ (DNA DataBase of Japan) adatbázisokból. A szekvenciák hasonlósága alapján külső és belső degenerált primereket terveztünk (5. táblázat). A külső primerekkel egy
~680 bázispár (bp) méretű PCR terméket vártunk, míg a belső primerek a 3’ végükön a 329.
pozícióban lévő és a rezisztenciáért felelős nukleotid normál, illetve mutáns típusára voltak specifikusak.
61
5. táblázat A Blumeria graminis alapján tervezett primerek.
Tervezett primer szekvenciák
4. 3. 3. 4. A citokróm b gén allél specifikus felszaporítása PASA primerekkel.
A citokróm bc1 gén 653 bázispár (bp) méretű pontmutációt tartalmazó szakaszát és a rezisztensekre jellemző 216 bp hosszúságú DNS fragmentumokat a BluGra124 (F)
(5’-GGATGATTAATACGTTACATACA-3’), CBR3 (R)
(5’-CCTAATAATTTATTAGGTATAGATCTTA-3’), és Enec1 R
(5’-TAGTAATAACTGTTGCTG-3’) primerek egyidejű alkalmazásával szaporítottuk fel. A PCR reakció a következő volt: 94°C 2 perc; 45 ciklus: 94°C 15 másodperc, 56°C 15 másodperc, 72°C 30 másodperc, végül 72°C 3 perc.
62
4. 3. 3. 5. A DNS fragmentumok elválasztása gélelektroforézissel, és dokumentálásuk A PCR termékeket 5 mikroliter Bromfenol-kék festékkel festettük meg majd 1,5%
agaróz (Electran, UK) gélen 0,5 x TBE pufferben választottuk szét. Az elektroforézist
agaróz (Electran, UK) gélen 0,5 x TBE pufferben választottuk szét. Az elektroforézist