Antibiotikum érzékenység meghatározása

Az antibiotikum érzékenységi vizsgálatokat a CLSI és a National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) aktuális évi, érvényben lévı nemzetközi ajánlásai alapján végeztük (48, 49, 192). A vizsgálatok kivitelezése az ajánlásoknak megfelelıen kontrolltörzsekkel ellenırzött táptalajokon, nemzetközi standardoknak megfelelı körülmények között történtek.

6.2.1. Antibiotikum érzékenység meghatározása korongdiffúziós módszerrel

A Kirby-Bauer-féle korongdiffúziós vizsgálatok során az alábbi antibiotikum-tartalmú korongokat alkalmaztuk: ceftazidim, ceftazidim+klavulánsav, cefotaxim, cefotaxim+klavulánsav, cefepim, ceftriaxon, ceftriaxon/klavulánsav és aztreonam. A kapott zónaátmérıt a kontrolltörzsekkel végzett standardizált körülmények között kapott eredményéhez hasonlítva kaptunk érzékeny, mérsékelten érzékeny és rezisztens eredményt. Az epidemiológiai összegzéseknél a baktériumoknak az adott antimikróbás szerre való érzékenységének megadásakor két kategóriát használtunk: érzékeny és nem érzékeny (mérsékelten érzékeny és rezisztens).

6.2.2. Antibiotikum érzékenység vizsgálata minimális gátló koncentráció (MIC) meghatározásával

6.2.2.1. MIC érték meghatározása E-teszttel

Az ampicillin, ampicillin/szulbaktám, amoxycillin/klavulánsav, piperacillin, piperacillin/tazobaktám, cefuroxim, ceftazidim, ceftazidim/klavulánsav, cefotaxim, cefotaxim/klavulánsav, ceftriaxone, cefpodoxim, cefepim, cefepim/klavulánsav, cefoxitin, ertapenem, imipenem, imipenem/EDTA, meropenem, aztreonam, nalidixsav, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, tetracyclin, trimethroprim-sulfamethoxazol, chloramphenicol, gentamicin, netilmicin, amikacin, tobramycin, tigecyclin, colistin MIC-értékeit az antibiotikumokat meghatározott koncentrációgradiensben tartalmazó csíkokkal, a gyártó elıírásainak megfelelıen alkalmazva (AB Biodisk, Solna, Svédország) határoztuk meg.

6.2.2.2. MIC érték meghatározása mikrodilúciós módszerrel

Az ampicillin, cefepim, imipenem, amikacin, ciprofloxacin, levofloxacin és A3-APO MIC értékeinek mikrodilúciós meghatározásához a mikrotitráló lemez vájulataiban kationnal kiegészített MH levest alkalmaztunk 0.1 ml végtérfogatban. A hígítási

sorozatot úgy terveztük meg, hogy a kiinduló koncentráció a várható MIC-értéknél 3-4-szer nagyobb, illetve a sorozat utolsó hígításának koncentrációja a várható legkisebb MIC-értéknél 3-4-szer kisebb legyen.

Bizonyos esetekben a standard 10⁵ CFU/ml baktérium koncentrációval párhuzamosan 10⁷ CFU/ml baktérium koncentráció esetében is meghatároztuk a MIC értéket.

6.2.2.3. MIC érték meghatározása agardilúciós módszerrel

Antibiotikum tartalmú MH agarlemezeket készítettünk, az antibiotikumok higítási sorozatával. A vizsgálandó baktériumokat a MH agarokon tenyésztettük, majd overnight tenyésztés után a baktérium növekedést detektáltuk. Agardilúciót használtunk az ampicillin, ampicillin/klavulánsav, amoxycillin/klavulánsav, piperacillin, piperacillin/tazobaktám, cephalotin, ceftriaxon, ceftazidim, ceftazidim/klavulánsav, cefotaxim, cefotaxim/klavulánsav és cefepim MIC értékeinek meghatározásához.

6.2.3. Antibiotikum érzékenység vizsgálata minimális baktericid koncentráció (MBC) meghatározásával

A MIC érték mikrodilúciós technikával történı meghatározása után, a mikrotiter lemez azon vályulataiból, amelyekben nem volt baktériumnövekedés véres táptalajra kioltottunk és egyéjszakás inkubálás után meghatároztuk, azt a legkisebb antibiotikum koncentrációt, ahol már nem volt baktérium növekedés.

Bizonyos esetekben a standard 10⁵ CFU/ml baktérium koncentrációval párhuzamosan 10⁷ CFU/ml baktérium koncentráció esetében is meghatároztuk az MBC értéket.

6.2.4. A ββββ-laktamáz enzim termelés detektálása antibiotikum érzékenység meghatározása alapján

6.2.4.1. AmpC termelés fenotípusos vizsgálata

Az E. cloacae osztályozását az indukálható, részlegesen derepresszált vagy derepresszált AmpC-termelés alapján Sanders és munkatársainak módszere alapján végeztük (257), amelyben a cefoxitin-cefotaxim antagonizmus-tesztet alkalmaztuk (210, 257). Az E. cloacae izolátumokat az alábbiak szerint kategorizáltuk: derepresszált AmpC mutánsoknak tekintettük, ha a cefoxitin MIC-értéke ≥ 32 µg/ml volt, a cefotaximé ≥ 16 µg/ml és a cefoxitin-cefotaxim antagonizmus teszt negatív volt;

részlegesen derepresszált AmpC mutánsoknak tekintettük, ha azonos jellegzetességeket

antagonizmus teszt pozitív volt; indukálható AmpC-termelı törzseknek tekintettük a baktériumot, ha a cefotaxim MIC-értéke ≤ 8 µg/ml volt és a cefoxitin-cefotaxim antagonizmus teszt pozitív (210).

6.2.4.2. ESBL termelés fenotípusos szőrése

ESBL-termelés szőrésére végzett kettıs-korong diffúziós teszt során az MH agaron elkészített baktériumpázsitra egymástól 20-30 mm-re (középpont a középponttól) helyeztünk klavulánsavat tartalmazó korongot és ceftazidim, cefepim, ceftriaxon, cefotaxim, aztreonam korongot. Az inkubációs idı után a β-laktám antibiotikumok körüli gátlási zóna jellemzı torzulása („kulcslyuk” jelenség) jelezte az ESBL jelenlétét.

6.2.4.3. ESBL termelés fenotípusos megerısítése

Fenotípusos konfirmáló tesztként a cefalosporin mellett klavulánsavat is tartalmazó speciális (kettıs, kombinált) korongokat alkalmaztuk: ceftazidim-klavulánsav, cefotaxim-klavulánsav, ceftriaxon-klavulánsav (minden esetben 30/10 µg; BioRad).

Pozitív eredménynek vettük, ha az antibiotikumot önmagában tartalmazó korong körül mért gátlási zónához képest (ceftazidim 30µg, cefotaxim 30µg, ceftriaxon 30µg) az antibiotikum-klavulánsav körüli gátlászóna átmérıje kevesebb, mint 5mm-rel nıtt. E-teszttel is meghatároztuk a pozitív kettıs korongdiffúziós tesztet eredményezı törzsek esetén a cefotaxim, a ceftazidim és a cefepim MIC-értékét és összehasonlítottuk a ceftazidim-klavulánsav, cefotaxim-klavulánsav és a cefepim-klavulánsav tartalmú E-tesztcsíkok esetén kapott értékekkel. A kombinált antibiotikum használata esetében a legalább hármas léptékő MIC koncentráció csökkenést értékeltük pozitívnak.

6.2.4.4. MBL termelés fenotípusos szőrése

MBL-termelés szőrésére végzett kettıs korong diffúziós teszt során technikailag ugyanúgy jártunk el, mint az ESBL-szőrésnél, azonban cefepim, ertapenem, imipenem és meropenem korongokat helyeztünk 20mm és 30mm távolságra (középpont a középponttól) az EDTA-t tartalmazó korongtól. Itt is a „kulcslyuk” jelenséget tekintettük pozitívnak.

6.2.4.5. MBL termelés fenotípusos megerısítése

MBL-termelés megerısítésére végzett teszt során technikailag ugyanúgy jártunk el, mint az ESBL-szőrésnél, azonban cefepim, ertapenem, imipenem és meropenem korongokra cseppentettünk 5 μl 0.05 M EDTA oldatot. Párhuzamosan csak EDTA-t tartalmazó

korong körül is lemértük a gátlási zónát, hogy az EDTA baktérium növekedésre gyakorolt gátló hatását is figyelembe vegyük. Pozitívnak tekintettük a teszt eredményét, ha az antibiotikum - cefepim, ertapenem, imipenem és meropenem – és EDTA kombinációs korong körül kialakult gátlási zóna legalább 5 mm-rel meghaladta a csak antibiotikumot tartalamzó korong körül kialakult zóna nagyságát.