4. Eredmények és megbeszélés
4.1. A molekuláris óraműködés vizsgálata Neurospora crassa modellorganizmusban
4.1.2. A WC-1 expresszió szabályozásának elemzése
4.1.2.2. A wc-1 promóterek regulációjának vizsgálata
A wc-1 expressziója megvilágítás hatására gyorsan és jelentősen emelkedik (179), amit adaptáció követ, és állandó világosban a sötétben mértnél valamivel magasabban állandósul az RNS szint. A wc-1 gén fényválaszát mind a WCC, mind az adaptációért nagy részben felelős VVD aktivitása befolyásolja. Felmerül a kérdés, hogy mi a helyzet állandó sötétben, akkor is befolyásolja-e a WCC a WC-1 expressziót. Ezt vizsgáltuk abban a wc-1-hiányos törzsben, amelyben a wc-1 gén Pdist-Pprox szakasza irányította a luciferáz átíródását (Δwc-1, Pdist-Pprox -luc). A vadtípusú háttérhez képest mintegy 50 %-os aktivitást mértünk, ami arra utal, hogy a
WCC sötétben is szerepet játszik saját kifejeződésének szabályozásában (15.A ábra). Ez összhangban volt azzal a megfigyeléssel, hogy a funkcionális WC-1-gyel nem rendelkező wc-1RIP, illetve a WC-2 hiányában WC-1-et detektálható mennyiségben nem tartalmazó Δwc-2 törzsben is alacsony volt a wc-1 RNS szintje sötétben (15.B ábra). Annak vizsgálatára, hogy a két promóter szakasz közül melyik működik WC-1-függő módon sötétben, a Δwc-1 törzset is transzformáltuk a Pdist-luc és Pprox-luc konstrukciókkal. Míg a proximális promótert tartalmazó törzsek aktivitása nem különbözött egymástól, a disztális promóter aktivitása WC-1 hiányában jelentősen alacsonyabb volt, mint vadtípusú háttér esetén (15.A ábra). Ennek alapján a disztális promóter működése függ a WC-1 jelenlététől sötétben.
15. ábra: A wc-1 expressziót sötétben is szabályozza a WCC
A) Különböző wc-1 promóter szakaszok WC-1-függésének vizsgálata. A feltüntetett konstrukciókkal (l. előző ábra) transzformált wc-1+ és Δwc-1 törzseket DD23-ban takarítottuk be, és a teljes sejtextraktumok luciferáz aktivitását mértük. A wc-1+, Pdist-Pprox-luc törzsben mérhető aktivitást tekintettük 100 %-nak (n=4). B) A wc-1 expresszió vizsgálata wc-1-deficiens törzsekben. A folyékony kultúrákat DD24-ben takarítottuk be. Az RNS szintek kvantifikálása valós idejű PCR-rel történt (n=3). C) A Pprox és Pdist aktivitása állandó világosban és különböző DD időpontokban. A wc-1+ folyékony kultúráját 24 órán át világosban inkubáltuk, majd (0 időpont) állandó sötétbe került a feltűntetett időtartamra. A teljes (fekete vonal) és a Pdist-re specifikus (szaggatott vonal) RNS mennyiségétvalós idejű PCR-rel határoztuk meg.
A megfelelő génszakaszokra specifikus primerek és próba használatával meghatároztuk a teljes wc-1 RNS mennyiségének és a disztális promóterhez tartozó transzkriptum szintjének alakulását két egymást követő cirkadián ciklus folyamán (15.C ábra). Egyik esetben sem tapasztaltunk cirkadián oszcillációt, ami összhangban volt korábbi irodalmi adatokkal (13). Míg azonban a Pdist-re specifikus RNS szintje nem különbözött világosban és sötétben, addig a teljes RNS mennyiség világosban mintegy kétszerese volt a sötétben detektált szintnek (0. időpont).
Ez pedig arra utal, hogy döntően a proximális promóter lehet fényre érzékeny.
16. ábra: A fényérzékeny wc-1 promóter szakasz azonosítása
A) A Pdist és Pprox szakaszok fényreakciójának vizsgálata. A wc-1+ (bal ábrarész), illetve a wc-1+ (wt, bd), Pdist-luc és wc-1+, Pprox-luc (jobb ábrarész) törzsek folyékony kultúráit a sötétbe történő áthelyezést követően 24 órával világítottuk meg a feltüntetett ideig, majd RNS-t preparáltunk, és azt valós idejű PCR-rel kvantifikáltuk. A DD kultúrákban (0 időpont) mért RNS mennyiségre normalizáltunk az ábrázolásnál. B) A Pprox promóter mutat fényérzékenységet. Felső ábrarész: A felhasznált primerek génszakaszokhoz való illeszkedését mutató sematikus ábra (F: forward primer, R: reverse primer). A számok a start kodontól való távolságot jelölik. Alsó ábrarész: az A) pontban ismertetett módon fénnyel kezelt wc-1+ kultúrából készült cDNS szolgált templátként a szemikvantitatív (23 ciklusból álló) PCR-hez. Az aktint kontrollként használtuk.
A következőkben az egyes promóterszakaszok fényválaszát vizsgáltuk. Ehhez a wc-1+ törzsben a teljes és a disztális promóterre specifikus wc-1 RNS szinteket határoztunk meg,
valamint mértük a wc-1+ hátterű Pdist-luc-ot és Pprox-luc-ot tartalmazó törzsekben a luciferáz RNS mennyiségét (16.A ábra). Mindkét esetben ugyanarra a következtetésre jutottunk: míg a disztális promóter csak nagyon mérsékelt fényválaszt ad, addig a proximális promóter jelentős mértékben indukálható fénnyel. Ezeket az eredményeinket szemikvantitatív PCR vizsgálattal is megerősítettük, melynek során egyrészt a disztális promóter által szabályozott régióra specifikus, másrészt a teljes wc-1 RNS mennyiséget reprezentáló termékeket amplifikáltunk (16.B ábra).
2. táblázat: A disztális és proximális promótert tartalmazó törzsek cirkadián működésének összehasonlítása a wt működésével
A futtatócsöveket a leoltást követően 2 napig világosban, majd a feltüntetett körülmények mellett további 4-5 napig inkubáltuk (n=3-5).
A disztális és proximális promóterek szabadon futó ritmusban betöltött szerepének tanulmányozására olyan törzseket hoztunk létre, amelyekben az endogén wc-1 gén deletált, viszont a his3 lókuszba a Pprox-wc-1, illetve Pdist-wc-1 konstrukció épült be, azaz a WC-1 kifejeződését a megfelelő promóter szakaszok külön-külön szabályozzák. Mindkét törzsben kissé csökkent WC-1 szintet detektáltunk (12.C ábra). A törzsek konidizációs ritmust mutattak mind állandó sötétben, mind LD-ciklusokban. Míg a disztális promótert tartalmazó törzs periódushossza sötétben a vadtípuséhoz hasonló volt, a proximális promóterrel rendelkező törzs hosszabb periódusú volt (2. táblázat). A konidizáció fázisában is a proximális promóterű törzs mutatott jelentősebb eltérést, LD 12:12 óra esetén 1,3 órás, míg LD 1:23 óra esetén több mint 7 órás késést detektáltunk a kontrollhoz képest (17.A ábra, 2. táblázat). A disztális promóterrel rendelkező törzsre ezzel szemben a kismértékű fázis előretolódás volt jellemző. Eredményeink
összességében arra mutatnak rá, hogy a fiziológiás fázis beállításához mindkét promóter működésére szükség van.
17. ábra: A wc-1 gén összetett szabályozása és ennek szerepe a konidizációs ritmusban
A) Mindkét promóter működéséhez kötött a konidizációs fázis megfelelő beállítása. A jelzett törzsekkel leoltott futtató csöveket 12:12 órás LD ciklusokban inkubáltuk. A denzitometriás analízis eredménye látható (szürke téglalap: sötét időszak, sárga téglalap: világos időszak), a konidizációs csúcsok fázisát ZT skálán adtuk meg (n = 6). (∗) p<0,05; (∗∗∗) p<0,005. B) A WCC szerepe a proximális és disztális promóter régiók szabályozásában.
Felső rész: a putatív CCAAT, TATA és iniciátor (Inr) szekvenciák wc-1 génen belüli elhelyezkedésének sematikus ábrázolása. A szürke téglalapok (Box 1, 2, 3) a GATN típusú, lehetséges WCC-kötő szakaszok elhelyezkedését mutatják. Alsó ábrarész: a wc-1 promóter (Box 1-3), a frq (11) és az al-3 LRE (180) szekvencia összehasonlítása.
A nyilak a GATN szekvenciák irányultságát jelölik.