A vastagbél idegrendszerének embryonális fejlődése a madár embryoban

Kísérleti munkánk során első lépésben a HNK1 immuncitokémiai jelölést ötvöztük transzgenikus GFP (green fluorescent protein) csirke embryok vagus régióból származó velőcső+ganglionléc transzplantációjával. A velőcsőkimérák kettős jelölésével az ENCC-k utóbél mentén történő vándorlását tudtuk nyomon követni, s ezzel részletesen jellemeztük a fejlődő vastagbél idegrendszerének ontogenezisét. A GFP-csirke és csirke embryok micromanipulációjának számos fontos előnye van az általánosságban használt csirke-fürj embryonális kimérákkal szemben. A fürj embryonális fejlődése rövidebb (17 inkubációs nap), ezért nehezebben lehet a két fajból származó embryot azonos stádiumnak megfelelően rekombinálni. A fürj sejteket jelölő QCPN ellenanyag a sejtmagban található fehérjét ismeri fel. Ezzel szemben, a citoplazmatikus GFP expresszió az egész ENCC-ben megfigyelhető, beleértve a sejttestet és annak nyúlványait, ami jelentősen megkönnyíti az ENCC-k migrációjának vizsgálatát és differenciálódási, illetve eloszlási mintázatának részletes elemzését immunhisztokémia nélkül is.

A gerinces állatokra és az emberre is igaz, hogy a bélidegrendszert létrehozó ENCC-k többsége a velőcső vagus szakaszának ganglionléc sejtjeiből származik, amelyek caudális irányba haladva a teljes béltraktust kolonizálják. A humán embryogenezis során az ENCC-k a 7. héten érik el az utóbél proximális szakaszát (Fu és mtsai., 2003; 2004a; Wallace és Burns, 2005), ez a folyamat egér embryoban a 11,5. embryonális napon (Young és mtsai., 1998;

Druckenbrod és Epstein, 2005), a csirkében a 6,5. embryonális napon (Burns és mtsai., 2002) következik be. Az utóbél kolonizációja egérben (McKeown és mtsai., 2001) és csirkében is 3 nap alatt befejeződik. Egyes gerinces fajokban két ganglionált plexus alakul ki a vastagbélben, amelyek eltérő fejlődési mintázattal rendelkeznek. Az ember, patkány és az egér embryok colorectumában először a myentericus plexus, később a submucosalis ganglionok alakulnak ki; humán embryokban a plexus submucosus a 14. embryonális héten (Fu és mtsai., 2004a) jelenik meg, míg egerekben és patkány embryokban csak a születés táján, illetve közvetlenül postnatálisan fejlődik ki (McKeown és mtsai., 2001). Ezzel szemben, a madárembryok utóbél szakaszában a plexus submucosus fejlődik ki először és néhány órával megelőzi a plexus myentericus fejlődését. Az utóbél distalis része olyan ENCC-ket is tartalmaz, amelyek a velőcső sacralis régiójából származnak (Kapur, 2000b; Burns és Le Douarin, 1998), de az a folyamat, ahogyan a különböző területről származó ganglionléc sejtek kolonizálják az utóbelet, illetve létrehozzák az első glia és neuron elemeket csak részben ismert.

EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ÉS KONKLÚZIÓ

Részletes immuncitokémiai analízissel kimutattuk, hogy az E6.5 (HH29) stádiumú csirke post-coecalis utóbélszakaszát kolonizáló differenciálatlan ganglionléc sejtek HNK-1, p75, SOX10, N-cadherin, és L1CAM faktorokat fejeznek ki. Az eredmények komparatív embryológia összehasonlításával igazoltuk, hogy az ENCC-ket jelölő immuncitokémiai expressziós mintázat nagyon hasonlít az egérben vándorló ENCC-k fenotípusához (Anderson és mtsai., 2006a;

Gershon és mtsai., 1993; Uesaka és mtsai., 2016; Young és Newgreen, 2001). Azt találtuk, hogy a felsorolt öt molekula a legelöl haladó ENCC-ben szelektíven kifejeződik. Velünk egyidőben, Hackett-Jones és mtsai., (2011) is kimutatták, hogy az L1CAM és az N-cadherin neuronális sejtadhéziós molekulák a fürj ENCC-ken expresszálódnak.

A neuronális differenciálódást, amely a vándorláshoz hasonlóan caudális irányt követ, pan-neuronális HuC/D ellenanyaggal mutattuk meg, amely a 7. embryonális napon a proximális utóbélben fejeződik ki, 12 órával a differenciálatlan ENCC-k megérkezése után.

Később, a differenciálódási hullám gyors előrehaladásával, a HuC/D molekula kifejeződése mindkét neurális plexusban megfigyelhető; E8-ra eléri el a distalis utóbelet, hasonlóan a Fairman és munkatársai által 1995-ben leírt differenciálódási mintázathoz. A Tuj1 és a CN ellenanyagok korai specifikus markerek a fejlődő bélidegrendszerben zajló neuronális differenciáció nyomonkövetésére. Az NCAM egy késői neuronális marker, amely először az E8 korban jelenik meg a proximális utóbélben, annak ellenére, hogy korábban erősen expresszálódik a Remak-ganglionban. Neurofilamentum expresszió csak az E8 után fordul elő az utóbélben. A gliális differenciáció hasonló mintázatot követ; a glia fenotípust a gliasejtek és azok prekurzorait jelölő B-fabp-vel tudtuk kimutatni (Kurtz és mtsai., 1994). A B-fabp E7-on

fejeződik ki

a proximális utóbélben, majd E8-tól kimutatható az utóbél teljes hosszán. Ezzel szemben, a GFAP expresszió ebben a stádiumban hiányzik a ganglionokból, ahol előszőr E10-tól a colorectum mindkét plexusában jelenik meg.

A colorectális ENS kialakulásakor azonosítottuk egy korábban nem ismert „harmadik plexust”, amely a belső submucosában lokalizálódik az epitheliumhoz közel. Ez a plexus csak átmenetileg van jelen a bélidegrendszer fejlődése során és rendszerint differeciálatlan marad ahol ritkán találunk benne HU+ sejteket. Hasonló belső submucosális ganglionsejteket leírtak 20 hetes humán magzati bélben is (Fu és mtsai., 2004a). A harmadik plexus kialakulásának lehetséges magyarázatát Zhang és munkatársai (2010) adják, akik matematikai modellezéssel

dc_1807_20

kapott eredmények alapján azt sugallják, hogy amikor az egyik plexus eléri a maximális sejtsűrűséget, a sejtek kis helyen való tömörülése megkönnyíti a másik plexus felé történő mozgást (Zhang és mtsai., 2010). A madarakban a belső submucosális plexus átmeneti jellege tükrözheti olyan szignálok hiányát a mesenchymában, amely az említett sejtek fenntartásához szükségesek. Emlősökön, beleértve az embert, a sertést, a lovat és a szarvasmarhát megfigyelték, hogy két-három különálló submucosális plexus is ki tud alakulni a submucosális terület különböző rétegei között (Balemba és mtsai., 1999; Timmermans és mtsai., 2001;

Wedel és mtsai., 1999).

Mindezek alapján a következő modellt javasoljuk az ENCC differenciálódásának karakterizálásához: a HNK-1, p75, SOX10 és az N-cadherint differenciálatlan ENCC-ek fejezik ki és az idegsejtekben, vagy a gliában a differenciálódás után is expresszálódnak (Nagy és mtsai., 2007, 2012). Az L1-CAM, amelyet kezdetben az összes ENCC-t jelöli, a neuronális vonalra korlátozódik, míg a SOX10 expressziója, amit kezdetben szintén az összes ENCC-ben kimutatható, a differenciált enterális neuronokban lecsökken és a glia prekurzor populációra korlátozódik (72. ábra), hasonlóan az egér embryoban megfigyelt expressziós mintázatához (Young és mtsai., 2004).

72. ábra: ENCC-k differenciálódása.

Összefoglalás: a részletes immuncitokémia karakterizálásból kapott eredmények megerősítik a bélidegrendszer fejlődésének hasonlóságát a madár és a rágcsáló embryok között és vezérfonalként szolgál a madár bélidegrendszer fejlődését célzó kísérletekhez.

EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ÉS KONKLÚZIÓ

5.2. Plexus pelvicusból származó ganglionléc-eredetű sejtek részt vesznek a vastagbél