A terminin fehérjék heterológ expressziója

A terminin fehérjék közötti kölcsönhatásokat genetikai módszerekkel és GST-pull down kísérleteket alkalmazva korábban is vizsgálták (16. ábra). A kísérleti adatok szerint a Ver interakcióba lép a DTL-lel és a HOAP-pal [Raffa et al. 2010], a DTL interakcióba lép a Ver, a HOAP és a HP1 proteinekkel [Raffa et al. 2009], míg a HipHop kölcsön hat a HP1-gyel és a HOAP-pal, de nem lép kölcsönhatásba a Ver vagy a DTL fehérjékkel [Raffa et al. 2009, Gao et al. 2010, Raffa et al. 2010]. Azért, hogy más módszerrel is igazoljuk e kölcsönhatások és a terminin komplex létezését, továbbá, hogy megvizsgáljuk a gyorsan változó domének kölcsönhatásait és esetleges szerepüket a fajképzésben, bakteriális expressziós rendszerben termeltettük a terminin fehérjéket.

51.

16. ábra: Terminin fehérjék között kimutatott kölcsönhatások

A kék körök a terminin fehérjéket mutatják, míg a vonalak a köztük lévő kölcsönhatásokat. A kölcsönhatások kimutatása főként GST-pull down kísérletekkel történt, heterológ fehérjék felhasználásával [Raffa et al. 2009, 2010, Gao et al. 2010].

Annak érdekében, hogy a proteinek natív térszerkezete ne torzuljon, és egy hozzáadott epitóp ne befolyásolja a komplex összeszerelődését, először jelöletlen („tag” nélküli) fehérjéket termelő plazmidokat állítottam elő. Később, amikor egyes esetekben indokolttá vált, haemagglutinin (HA) illetve hisztidin (his) jelölést használtam. A klónozás részleteit az Anyagok és módszerek fejezetben, a monocisztronos és policisztronos konstrukciók előállítása alpontban fejtettem ki (3.2.9).

Monocisztronos plazmidokról történő indukciót követően jól kimutatható mennyiségű fehérje termelődött a HP1, a HOAP, a Ver és a DTL fehérjékből (17. ábra).

17. ábra: A Drosophila terminin fehérjék egyenként különböző mértékben oldható formában termeltethetők baktériumsejtekben

A terminin fehérjét expresszált baktérium sejt lizátumok PAGE gél fotója. A képen látható expresszált fehérjék minden esetben jelölve. L: molekulatömeg marker (létra – egy gélt látunk több darabba vágva, így a marker az

52.

ábra minden részével összevethető); Ö: teljes sejt lizátum F: oldható frakció; NK: nem indukált sejtek oldható frakció - kontroll; P: oldhatatlan csapadék frakció (pellet). A sejtextraktumot (Ö) centrifugálva elkülöníthetjük annak oldható (F) és oldhatatlan frakcióit (P). A heterológ fehérje expresszió során gyakori, hogy a termelt fehérje a csapadékban fordul elő, „inclusion body”-t képezve.

Az önmagukban termeltetett terminin fehérjék oldhatósága változó. A termelődött HP1 és HOAP fehérjék körülbelül fele jelent meg a felülúszóban (F), míg a DTL és a Ver túlnyomó többsége a csapadékban található (P) (Arctic Expressz 18°C). Az alacsony expressziós szintje miatt, a HipHop termelődése nem látszik a gélen, viszont a fehérje várt pozícióját csillaggal megjelöltük.

A csapadékokban (P) látható 60 és 40 kDa körül megjelenő proteinek bakteriális eredetűek; dajka fehérjék (60 kDa), sejtfalhoz (40 kDa) asszociált fehérjék, vagy antibiotikum rezisztenciához szükséges fehérjék is lehetnek.

A HipHop expresszió a termeltetés körülményeitől függetlenül (hőmérséklet, indukálószer koncentrációja, tápoldat), mindig alacsony szintet mutatott. Az alacsony HipHop expresszió magyarázható azzal, hogy a baktériumok és a Drosophila sejtek eltérő gyakorisággal használnak bizonyos kodonokat, és tRNS-eket. Ezért a BL21 expressziós baktériumtörzset Rosetta sejtekre cseréltük, mely baktériumban ritka tRNS-eket kódoló plazmidot hordoz. Azonban a Rosetta sejtekben történő fehérje termelés sem fokozta a HipHop mennyiségét. Mivel a denaturáló gélen a HipHop kimutathatatlan volt, a követhetőség érdekében a fehérjét HA epitóppal jelöltem. A HipHop a későbbi vizsgálatok során stabilnak bizonyult.

Bakteriális rendszerben a HP1 kódoló régióról két fehérje képződött (17. ábra). A két fehérje megjelenését alternatív start kodon nem indokolta. N-terminális hisztidin tag jelölést követően csak a nagyobb fehérje futási magassága változott, ami a protein N-terminálisának degradációjára utal. Ezt megerősíti a később végzett tömegspektrometria: mindkét termelődött fehérjét HP1-ként azonosítottuk, azonban a kisebb fehérje esetén az N-terminálison nem volt peptid találat (19. ábra, B panel).

A Ver és a DTL expressziós szintje megfelelő ugyan, és degradáció sem jellemző rájuk, azonban, míg a többi protein az oldatban marad, addig a Ver és a DTL oldhatatlan formában (inclusion body) képződik (17. ábra). Ezt úgy vizsgáltuk meg, hogy a feltárt sejteket nagy fordulatszámon centrifugáltuk, melynek köszönhetően elkülönítettük az oldható fehérjéket (felülúszó) az oldhatatlan aggregátumot képző fehérjéktől (csapadék). A pelletben lévő fehérjék nem alkalmasak biokémiai vizsgálatokhoz, ezért a fehérjék oldható formában való termelésének kedvező körülményeket biztosítottunk az indukció során. A fehérje oldhatóságát növelheti a fehérje termelődés ütemének lassítása, az indukálószer koncentrációjának csökkentése, vagy az indukálás során alacsonyabb hőmérséklet alkalmazása [Rosano és Ceccarelli 2014]. Így a képződő fehérjének több idő áll a rendelkezésére a helyes térszerkezet felvételéhez. Az Arctic Express sejtek hideg sokk proteineket

53.

hordoznak, melyek lehetővé teszik a kultúra 18°C-on és az alatt történő növesztését. Esetünkben sem a Ver, sem a DTL oldhatósága nem növekedett jelentősen az említett módszerek alkalmazásával.

Az oldhatóságot fokozhatja még, ha a fehérje interakciós partnere jelen van a termelődés során [Henricksen et al. 1994, Yao et al. 2003, Diebold et al. 2011]. Az oldhatóság növelése érdekében olyan plazmidokat hoztam létre, melyek policisztronos formában koexpresszálják a fenti fehérjéket. A koexpressziós kísérleteket Arctic Express sejtekben végeztem.

A HOAP és a HP1 együtt történő termelése során mind a HP1, mind a HOAP oldhatósága jelentősen javult, szinte az összes fehérje a felülúszóban található (18. ábra). Ver és HOAP vagy Ver, HOAP és HP1 koexpresszió során azonban a Ver esetében nem tapasztaltunk változást. Amikor viszont a DTL is megjelent a sejtben, mind a négy fehérje termeltethető lett oldható formában (18. ábra). A fehérjék oldhatóságának javulása feltehetően a fehérjék között kialakuló interakcióknak köszönhető. A HOAP és a HP1 interakciója Ver fehérjével nem bizonyult annyira jelentősnek, hogy Ver oldhatóságát javítsa.

Elkészítettem az öt terminin fehérje egyidejű termelését biztosító plazmidot is, de a HipHop továbbra is rendkívül alacsony expressziós szintet mutatott, és nem volt érdemi hatással a többi fehérje oldhatóságára.

18. ábra: A baktériumsejtekben termelt terminin fehérjék oldhatóságát kölcsönható partnereik jelenléte megnöveli

A terminin fehérjéket koexpresszáló baktériumok lizátumának PAGE gél fotója. A HOAP és a HP1 koexpressziója esetén mindkét fehérje oldhatósága jelentősen fokozódik és a fehérjék túlnyomó többsége a felülúszóban (F) és nem a csapadékban (P) látható. A Ver viszont a HOAP és a HP1 jelenléte esetén is nagyrészt a csapadékban (P) van. Azonban, ha DTL is jelen van az expresszió során, akkor valamennyi fehérje kimutatható az oldható frakcióban (F) is. A Ver és a DTL koexpressziója is fokozta a fehérjék oldhatóságát.

L: molekulatömeg marker (létra); Ö: összes sejt lizátum - centrifugálatlan minta; F: felülúszó minta; NK: nem indukált felülúszó kontroll; P: csapadék (pellet)

54.