A SEPT9 gén DNS metilációs szintje vastagbélszövetben

A SEPT9 gén DNS metilációs szintje fontos klinikai előszűrési jelentőséggel bír.

Vizsgálatunk során a SEPT9 gén összesen 8 régióját vizsgáltuk egészséges, adenoma és CRC mintákon, valamint a tumor mellől mintavételezett mikroszkópikusan normális szövetek hám és stroma sejtjein. A legnagyobb DNS metilációs szint eltéréseket a normális és a kóros vastagbélszövetek között a harmadik CpG sziget esetén találtunk (CGI3). A lézer mikrodisszektált minták eredményei alapján feltételezhető, hogy az irodalomban is leírt [203], jelentős DNS metilációs változások elsősorban a hámsejtekből eredtek, míg a stromasejtek kismértékű változása csak a hámsejtek változását követően volt jellemző. Megfigyeltük a tumorokban jelentkező DNS

104

metiláció 5’ vég felé való terjedését is, ami az adenoma mintákra nem volt jellemző. A fentiek alapján feltételezhető, hogy a CGI3 metilációs szintjének változása a malignus átalakulás felé fontos biológiai folyamat lehet. Ez a folyamat valószínűleg a korai szakaszában végbemegy és közvetlenül befolyásolhatja a tumor kialakulását. A kötőszöveti sejtek fontos szerepet tölthetnek be a tumor mikrokörnyezetének kialakításában. A stromális sejtek változásai valószínűleg a hámsejtek változásait követően történnek a malignus átalakulás során. A vastagbéltumorok hám és stromális sejtjei a normál szövetben is alapvetően eltérő funkciókat látnak el és irodalmi adatok szerint a kialakult tumorban is eltérő változások zajlanak le bennük [204]. Ezek közül az epigenetikai különbségek is jelentősek a két sejttípus között [205-207]. Annak pontos mechanizmusa, hogy az egyik sejt epigenetikai változása hogyan idéz elő változást egy másik sejtben egyelőre nem ismert, de minden bizonnyal egy komplex folyamat eredménye, amelyben a bazális membrán, az extracelluláris mátrix, a növekedési faktorok és citokinek, valamint a direkt sejt-sejt kapcsolatok egyaránt szerepet játszhatnnak [208, 209]. Egy sejt malignizálódásához és invazivitásához első lépésben szükség van a bazális membrán proteolitikus degradációjára és az aktív migrációra. A Septin 9 fehérje a sejtosztódás során létrejövő két utódsejt szétfűződése során játszik fontos szerepet (34. ábra), így elképzelhető, hogy a tumorok kialakulása során tapasztalható megnövekedett DNS metilációs szintje és az ezzel párhuzamosan lecsökkenő fehérjeszintje közvetlen hatással lehet a sejtvándorlásra és az invazivitásra is.

34. ábra: A Septin 9 fehérje kifejezdése HeLa sejtekben a sejtosztódás különböző fázisaiban. Immunhisztokémiai jelölések: kék = DNS, zöld = Septin 9 fehérje, piros = alfa-tubulin. A méretjelzések 17 µm-nek felelnek meg. Az ábra Estey és munkatársai alapján, módosítva készült [210].

105

A fentieket támasztja alá a Septin 9 epiteliális-mezenchimális átalakulásra gyakorolt hatása is [211]. A SEPT9 gén számos transzkripciós variánssal rendelkezik, ezek egy része feltehetőleg a sejt normális funkcióihoz szükségesek. Ha a tumorképződés során végbemenő DNS hipermetiláció módosítja egyes transzkriptumok kifejeződését, a megváltozó filamentumstruktúrák fontos sejtfolyamatokat érinthetnek [78]. A CGI3 CpG sziget genomi elhelyezkedése és a transzkripciós start hely jelenléte is erősen arra utalhat, hogy a hipermetiláció a 2-es számú transzkripciós variáns kifejeződését befolyásolhatja. További kísérletek feladata lesz kideríteni azt, hogy a jelen vizsgálatban elemzett mintákban a megváltozott DNS metilációs szint milyen hatással van az egyes transzkripciós variánsok kifejeződésére.

A vizsgálat végeredménye szerint az Európában már CE engedéllyel rendelkező SEPT9 metilációt vizsgáló, ún. Epi proColon 2.0 teszt éppen ezt a leginformatívabb szakaszt vizsgálja, amely a szöveti mintákban, azon belül is a lézer mikrodisszektált hámsejtekben a legnagyobb DNS metilációs különbséget mutatja.

Az általunk alkalmazott Septin 9 fehérjére specifikus poliklonális antitest a C terminális vég felé elhelyezkedő 29 aminosav régió kimutatására alkalmas, ez a szakasz összesen 7 Septin 9 izoformában konzervált. A fehérjeszint elemzés eredménye szerint a megnövekedett DNS metilációs szinttel párhuzamosan jelentős Septin9 fehérjeszint csökkenés észlelhető vastagbél adenoma és tumoros szövetekben. Természetesen a DNS hipermetiláció önmagában nem magyarázza meg a fehérjeszinten tapasztalható változást, ahhoz valószínűleg egyéb faktorok változása is szükséges. Ez a stromális sejtek esetén is látszik, ahol kevésbé kifejezett DNS metilációs változás mellett is alacsony fehérjeszint figyelhető meg. Ezen kívül a NAT1 mintákban tapasztalható hámsejt hipermetiláció nem tükröződik a fehérjeszint változásában. Egy korábbi vizsgálatban a használt ellenanyag a fehérje N terminus felőli régiójának kifejeződését vizsgálta, a Septin 9 fehérjeszint csökkenése szintén jelentkezett a vastagbéldaganatok kialakulásával párhuzamosan [203].

A jelentős DNS metilációs változásokat mutató 3. CpG sziget mellett további régiók is metilálódhatnak különböző tumorok kialakulása során. Például emlődaganatban emelkedett össz SEPT9 mRNS szint mellett emelkedett fehérjeszint volt megfigyelhető az ép emlőszövetek mintákhoz képest. Emellett a 3. transzkripciós variáns és a hozzá kapcsolódó fehérjeszint csökkenését tapasztalták. A NAT1 és tumor mintákban

106

tapasztalt megemelkedett metiláció lehet felelős ezért a hatásért. Ez a régió viszont CpG szegény szakasz, a tv3 első exon-ja előtt helyezkedik el. Ez a mi vizsgálatunkban kb 3 kb upstream helyezkedik el a 3. amplikontól, amely a normál és tumoros minták közt csupán 12%-os metilációs eltérést mutatott, míg a CGI3 központi régiójában ez a különbség 80%-os volt. További vizsgálatok feladata választ adni arra a kérdésre, hogy a különböző daganattípusokban jelentkező DNS metilációs változások a SEPT9 mely régióját érintik.

A vizsgálatunkban talált karakterisztikus DNS metilációs változást mutató szakasz metilációs szintjét összehasonlítottuk nyilvánosan elérhető adatbázisok eredményeivel [212]. Új generációs szekvenálás technikával szintén erősen metiláltnak találtuk a terület hámsejtekben, míg stromális sejtekben eredményeinkhez hasonlóan alacsony DNS metilációs szintek voltak kimutathatóak.