A TNF szerepe RA-ban

A gyulladás kialakulásának egyik kulcseleme az emelkedett TNF, - amelyet mind RA-s betegek szérumában, mind a szinoviális folyadékból származó mintákban megfigyeltek (186)-, valamint a T-sejtek megnövekedett TNFR expressziója (187). A TNFα felszabadulása további gyulladásos citokinek felszabadulását okozza, mint például IL-6, IL-1 és GM-CSF, aminek következtében krónikus gyulladás alakul ki a szinoviumban (188). A TNF hatására akár szub-oszteoklasztogenikus mennyiségű RANKL jelenlétében is megindul az oszteoklaszt differenciálódás és aktiváció, amelynek következménye a betegségben megfigyelhető ízületi destrukció (189).

A TNF elsődleges szerepét a betegség kialakulásában jól mutatja, hogy napjainkban öt kereskedelmi forgalomban kapható TNF gátló készítmény létezik, amelyek ma az egyik leghatékonyabb terápiás lehetőséget jelentik RA-ban. A betegség korai stádiumában alkalmazott TNF blokkolók megelőzhetik a gyulladás és az ízületi destrukciók kialakulását. Ezen hatóanyagok (infliximab, etanercept, adalimumab, golimumab és certolizumab pegol) a szekretált, illetve a sejtfelszíni TNF-et kötik meg nagy affinitással, megakadályozva annak a receptorához való kötődését (190). RA-s betegekben a TNF blokkolása visszaállítja a fiziológiás T-sejt választ (191, 192).

32 1.4.2 A T-sejtek szerepe RA-ban

Az RA gyulladásos szöveti környezete nagyban különbözik a nem autoimmun eredetű gyulladásoktól: módosult pH viszonyok és oxidatív státusz jellemzi (193), továbbá domináns a makrofágok által termelt citokin környezet (194). RA szinoviális szövetekben a Th1 típusú T-sejt differenciálódás van túlsúlyban, amelynek eredménye a citokin termelés proinflammatórikus irányba történő eltolódása (195, 196). A Th1-es polarizáció ellenére azonban nem figyelhető meg konstitutív citokin termelés, például IL-2 felszabadulást vizsgálva (197), emellett a sejtek kevéssé reaktívak mitogén, antigén vagy anti-CD3 stimulációra (198). RA-ból származó szinoviális T-sejtek fenotípusára jellemző a csökkent válaszkészség (199), a CD3ζ-lánc alacsonyabb kifejeződése (200) és bizonyos sejtfelszíni antigének (CD69, RANK, β-integrinek) megváltozott megjelenése (201). RA szinoviális szöveteiben szignifikánsan növekedett a CD4+CD28- T-sejtek száma, amelyek in vitro autoreaktív potenciállal rendelkeznek (202). Csökkent a p36 foszfo-LAT mennyisége (203), alacsonyabb Ca²⁺-válasz figyelhető meg (204), ugyanakkor konstitutív NF-κB és MAPK aktiváció jellemzi őket (205, 206).

A redox egyensúlyban tapasztalható eltérések további fontos tényezői az RA-ban szenvedő betegek T-limfocitáinak alacsony válaszkészségének: a glutation intracelluláris szintje szignifikánsan csökkent szinoviális T-sejtekben (207), ugyanakkor a tioredoxin (208) és a nitrogén monoxid (209) szintje emelkedést mutat. A T-limfociták központ szerepére utal, hogy az RA terápiájában rendkívül hatékonynak bizonyulnak a T-sejt válasz gátlásán alapuló készítmények, mint például a forgalomban lévő rekombináns CTLA-4–IgG1 fúziós protein (abatacept) (210) vagy a klinikai kísérleti stádiumban lévő anti-ICAM-1, anti-CD80/86 és az LFA-3–IgG1 fúziós fehérje (211). A T-sejtek megnövekedett TNFR expressziója, amely ligandjával kolokalizálódva mutatható ki (212), illetve, hogy TNF transzgenikus egérben súlyos destruktív polyarthritis alakul ki (213), arra enged következtetni, hogy a TNF központi szerepet tölt be a kóros T-limfocita aktivációban.

Kísérletes állatmodellekben a szinoviális T-sejtekben megfigyelhető eltérések hasonlóak a primer sejteken és a sejtvonalakon in vitro TNF kezelés hatására kialakuló eltérésekhez (214).

33 1.4.3 A hízósejtek szerepe RA-ban

Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a hízósejt funkciók is érintettek az RA patomechanizmusában (215). Mind humán mintákban elemezve (216, 217), mind experimentális egérmodellben (218) számuk jelentősen emelkedett a szinoviális szövetekben. Felhalmozódásuk módjáról több elképzelés is létezik, amelyek feltehetően kiegészítik egymást: egyrészt a gyulladás helyszínén a membránról felszabaduló SCF korrelál a hízósejt hiperpláziával (219), másrészt az RA-s szinoviumban magasan expresszálódik a CXCL9 és a CXCL10, amelyek a hízósejteken RA-ban megjelenő CXCR3 ligandjai (220). Bizonyítottan bekövetkezik aktivációjuk és degranulációjuk is (221, 222), mivel RA szinoviális folyadékban, oszteoarthritishez (OA) viszonyítva, mind a triptáz (223), mind a hisztamin (224) szintje emelkedett, bár ez utóbbi nem minden esetben figyelhető meg.

Az RA-s szinoviális hízósejtek nagy mennyiségben expresszálják a nagy affinitású FcεRI-et és megjelenik rajtuk az aktiváló típusú FcγRIIa is, azonban nem találtak rajtuk FcγRI-et és III-at (225). A hízósejtek aktivációja széles körben tanulmányozott allergiás folyamatokban, azonban kevésbé tisztázott RA-ban. Egyik lehetséges mechanizmusként az allergiához hasonló, FcεRI-en keresztüli aktiváció merül fel. Az IgE izotípusú kollagén ellenes antitestek, valamint az ezek ellen termelődött RF jelen vannak (226, 227) a betegek egy részében. Ezen antitestek hízósejtekre gyakorolt degranulációs hatását is bizonyították in vitro, szérummal történő szenzitizáció után (228, 229). Mindezek ellenére kollagén indukált experimentális egérmodellben nem sikerült összefüggést találni a betegség aktivitása és ezen antitestek jelenléte között, sőt a hízósejtek által termelt IL-4-et inkább a remisszió kialakulásával hozták összefüggésbe (230). Felmerült az FcγRIIa-n, TLR-okon és C5a receptoron keresztüli aktiváció lehetősége is, azonban ezeket kevéssé vizsgálták. Szerepüket hangsúlyozza azonban, hogy az RA patomechanizmusában meghatározó szerepet játszó proinflammatórikus citokinek (IL-17, IL-1β és TNFα) jelentős része hízósejt aktiváció során szabadul fel (221, 231).

1.4.4 A mikroRNS-ek szerepe RA-ban

A mikroRNS-ek, mint legújabban felfedezett szabályozó molekulák szerepét egyre több publikációban vizsgálják RA-val összefüggésben (1. táblázat, (232)). Több

34

összefüggést találtak az RA patomechanizmusa és a megváltozott miRNS expresszió között (232), továbbá terápiás célpontként és diagnosztikus markerként való felhasználásuk lehetősége is felmerült (233). A legjobban tanulmányozott RA-ban résztvevő miRNS-eket a 1. táblázat foglalja össze.

MikroRNS Forrás Változás

szinoviocita csökkent CDK-2, MCP-1, IκBζ 1. táblázat: RA-ban érintett mikroRNS-ek összefoglalása (232).

35

A mir-146a expressziója szignifikánsan növekedett RA-s betegek szinoviális fibroblasztjaiban, ami tovább fokozható LPS és IL-1β hozzáadásával (234), illetve TNFα kezeléssel (235). Szintje emelkedett az RA-s szinoviális szövetben is, elsősorban makrofágokban, CD3+ sejtekben és B sejtekben (235), de ugyanez figyelhető meg RA-s betegek perifériás véréből izolált mononukleáris sejtekben (PBMC) is (236). Szinoviális szövet eredetű CD4+ T-sejteket vizsgálva szintén emelkedett mir-146a expresszió figyelhető meg, ami pozitívan korrelál a TNFα mennyiségével. Az emelkedett mir-146a nem korrelál a célpontjai között szereplő TRAF6 és IRAK-1 expressziójával, mivel ezek a kontrollokhoz hasonló kifejeződést mutatnak. Azonban az IRAK-1 3’UTR régiójának polimorfizmusa hajlamosít RA kialakulására (237), míg mesterséges csendesítése csökkenti a TNF termelését (236).

A mir-155 emelkedett expresszióját igazolták RA szinoviális szövetekben, szinoviális fibroblasztokban, szérum és plazma mintákban és PBMC sejtekben (234, 236). RA-s szinoviális eredetű és perifériás CD14+ sejtekben a magasabb mir-155 expresszió korrelál a gyulladási citokinek termelésével és a célpontjaként ismert SHP-1 foszfatáz alacsonyabb szintjével, amelyet a gyulladás kialakulását gátló molekulaként tartanak számon (238). Mir-155 génkiütött állatban nem fejlődik ki kollagén indukált experimentális arthrits (239), valamint K/BxN szérum-transzfer arthritis modellben a mir-155 kiütése csökkent csont destrukciót és oszteoklaszt generációt eredményez (239). RA-s betegek PBMC sejtjeiben és szinoviális folyadék mintáiban a mir-132 szintje emelkedett, azonban a plazmában található mennyisége szignifikánsan kevesebb, ami markerként is használható lehet a betegség követésében (236, 240).

36

2. Célkitűzések

A CD3ζ-lánc szabályozásának vizsgálata humán T-limfocitákban

1. A TNF hatásának vizsgálata a CD3ζ-lánc kifejeződésére:

a. A ζ-lánc expresszió mérése különböző koncentrációjú és időtartamú TNF kezelés mellett.

b. A ζ-lánc internalizáció vizsgálata.

c. A CD3 komplex egyéb láncainak vizsgálata TNF hatására.

d. A ζ-lánc mRNS expressziójának mérése.

e. A ζ-lánc foszforiláció vizsgálata.

2. A T-limfocita aktiváció vizsgálata TNF jelenlétében:

a. A Ca²⁺-válasz mérése.

b. Az IL-2 termelés meghatározása.

c. Proliferáció vizsgálata 3. A CD3ζ lebomlásának vizsgálata:

a. A bomlás helyszínének meghatározása.

b. A SLAP fehérje expressziójának vizsgálata TNF hatására.

c. A SLAP-CD3ζ kolokalizációjának vizsgálata.

d. A SLAP szerepének vizsgálata a CD3 ζ-lánc bomlásában.

4. A SLAP vizsgálata RA-s betegekben:

a. A SLAP expresszió mérése RA-s betegek és egészséges kontrollok T-limfocitáiban.

b. A SLAP expresszió mérése RA-ban szenvedő betegek T-limfocitáiban TNF hatására.

5. A SLAP szabályozásának vizsgálata.

MikroRNS-ek vizsgálata humán T-sejtekben és hízósejtekben

1. A mir-155, mir-181a és mir-146a vizsgálata TNF hatására T-limfocitákban.

2. A mir-132 vizsgálata hízósejtekben.

37

3. Módszerek

3.1 Sejtkultúrák

3.1.1 Jurkat humán T-sejtes limfóma fenntartása

A Jurkat T-sejteket (ATCC E6.1) gyárilag előkészített RPMI 1640, 10% FBS (foetal bovine serum), 2 mM glutamint tartalmazó tápoldatban (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) tartottuk fenn. A sejtkultúrák denzitását 1×10⁶ sejt/ml-re állítottuk be, és a tápoldatot minden második napon cseréltünk. A sejtek viabilitását a kísérletek előtt tripánkék festéssel vagy annexinV/propidium jodid (PI) jelöléssel, áramlási citometriával ellenőriztük.

3.1.2 Perifériás mononukleáris sejtek izolálása, fenntartása

A K2EDTA tartalmú vérvételi csövekben (BD Vacutainer, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ USA) levett, térfogatának az általánosan használt HBSS (Hank’s Buffered Salt Solution) oldattal kétszeresére hígított vért Ficoll-Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) oldatra rétegeztük, majd 30 percig 400×g nehézségi erővel, 25^o C-on centrifugáltuk. Ezt követően a mC-onC-onukleáris sejteket (PBMC) szérummentes RPMI 1640 folyadékban mostuk, és a vörösvértesteket ACK pufferrel (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHC0₃, 0,1 mM Na₂EDTA desztillált vízben oldva) lizáltuk, végül a fehérvérsejt szuszpenziót PBS oldattal mostuk. Az így kinyert sejteket használatra kész RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM glutamint tartalmazó tápoldatban (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) tenyésztettük.

3.1.3 CD4+ T-limfociták szeparálása

A CD4+ T-limfocitákat negatív szelekcióval, mágneses elven (MACS, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) történő izolálási technika segítségével nyertük ki. Ehhez a frissen izolált PBMC sejteket a gyártó által ajánlott pufferben (MACS puffer: 0,5% BSA, 2 mM EDTA PBS-ben oldva) szuszpendáltuk fel és a gyártó által javasolt protokoll szerint dolgoztunk. A sejteket használatra kész RPMI 1640, 10%

FBS, 2 mM glutamint tartalmazó tápoldatban (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) tenyésztettük.

38

A kísérletek során >90% tisztaságú populációkat használtunk, amit áramlási citometriával igazoltunk.

3.1.4 Humán hízósejtek differenciáltatása és fenntartása

A köldökzsinórból származó, RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) médiummal kétszeres térfogatra hígított vérből grádiens centrifugálással nyertük ki a mononukleáris sejteket Ficoll-Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) oldat felhasználásával. A megmaradt vörösvérsejteket hipotónikus lízissel távolítottuk el. A MACS-pufferben felszuszpendált sejteket mágneses gyöngyökkel konjugált anti-CD34 antitesttel (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) történő inkubációt követően két egymást követő alkalommal LS-oszlopon (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) átengedve szeparáltuk. Az így nyert sejtek tenyésztése 10% FBS-t, 2 mM L-glutamint és 0,1 mM nem esszenciális aminosav oldatot (Invitrogen, Gibco, Paisley, USA) tartalmazó DMEM-ben (Dulbecco's modified Eagle's medium, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) történt, 1×10⁶ sejt/ml koncentrációban, 100 ng/ml SCF, 50 ng/ml IL-6 (ImmunoTools GmbH, Friesoythe, Germany) és 3 μM lizofoszfatidsav (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) jelenlétében.

8 hetet követően, a differenciálódás mértékét áramlási citometriával ellenőriztük, és a CD34+, FcεRI+, CD117+ populációt tekintettük az éretlen hízósejteket reprezentáló populációnak (241) (3. ábra).

39

3. ábra: Hízósejt differenciáció ellenőrzése. A sejteket CD34-FITC, FcεRI-PE és CD117-APC (c-kit) festékkel jelöltük, majd áramlási citometriával mértük.

3.2 Humán minták

3.2.1 Rheumatoid arthritses betegek

Az RA diagnózisának felállítása az American College of Rheumatology által meghatározott klasszifikációs kritériumok (242) alapján történt. A vérmintákat (n=10) a Budai Irgalmasrendi Kórházban gondozott betegektől nyertük az etikai engedélyeknek megfelelően, miután minden beteg aláírta a vizsgálatra vonatkozó beleegyező nyilatkozatot. A betegek egy része TNF-blokkoló, míg másik része a betegség lefolyását módosító terápiában (DMARD) részesült. Korban és nemben illesztett egészséges donorok (n=7) mintáit használtunk kontrollként (2. táblázat).

40

sorszám nem születési idő terápia

1 Nő 1955 etanercept

2 Nő 1986 certolizumab pegol

3 Nő 1947 etanercept

4 Nő 1975 certolizumab pegol

5 Nő 1979 certolizumab pegol

6 Nő 1951 DMARD, glükokortikoid

7 Nő 1969 DMARD, glükokortikoid

8 Nő 1946 DMARD

9 Férfi 1957 DMARD

10 Férfi 1951 DMARD, glükokortikoid

1 Nő 1957 _

2 Nő 1983 _

3 Nő 1950 _

4 Nő 1964 _

5 Nő 1982 _

6 Férfi 1972? _

7 Férfi 1982 _

2. táblázat: A felhasznált betegminták és kontrollok nemre, korra és terápiára vonatkozó adatai. Átlagéletkor: 45,9±14,2, 13/17 nő.

3.2.2 Humán köldökzsinórvér minták

A mintagyűjtés a Semmelweis Egyetem I. számú Szülészeti- és Nőgyógyászati klinikáján történt egészséges anyák újszülött gyermekeiből származó köldökzsinórvér mintáinak felhasználásával, a megfelelő etikai szabályok és engedélyek mellett a páciensek beleegyezésével.

A mikroRNS mérésekhez egészséges, önkéntes donoroktól származó vérmintákat használtunk fel (n=4).

41 3.3 Sejtek aktiválása, kezelése

3.3.1 T-limfociták

Jurkat T-sejtvonal: a sejteket 1×10⁶ sejt/lyuk (24 lyukú tenyésztőedény, 2 cm²) denzitásban osztottuk szét, majd különböző koncentrációjú (5-80 ng/ml, 40 ng/ml ha külön nincs jelölve) rekombináns humán TNFα-val (BD Biosciences, San Jose, California, USA) kezeltük őket meghatározott ideig (4-24 óra). Gátlószeres kísérleteink esetében mind a lizoszóma- (NH4Cl, 10 mM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), mind a proteaszóma (MG-132, 100 nM, Calbiochem, San Diego, CA, USA) inhibitorral 2 órás előkezelést alkalmaztunk.

Munkánk során az NF-κB aktivitás mérésére használható β-galaktozidáz riporter enzimet tartalmazó Jurkat sejteket is használtunk (243). A galaktozidáz enzim szubsztrátjának hasítása (chlorophenol red-β-D-galactopyranoside, Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA), amely spektrofotometriával meghatározható, arányos az NF-κB aktivációval (244). Ezekbe a sejtekbe az NF-κB transzkrpiciós faktort gátló NBD peptidet (NEMO-Binding Domain Binding Peptide, Merck Millipore, New York, NJ, USA) juttatunk be (100, 200 μM) bizonyos kísérletekben. Az NBD peptid a sejtek membránján szabadon átjut, majd az NF-κB aktivációjában résztvevő regulátor fehérje, a NEMO (NF-κB essential modulator) IκK komplexhez való kötődésének megakadályozásával gátolja a citokinek által indukált NF-κB aktivációt és az általa közvetített génátíródást (245).

PBMC sejtek esetén a TNF kezelést 2 órás leukoagglutinin (PHA-L, 1 μg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) előkezelés előzte meg a TNFR1 expressziójának indukálása érdekében (emelkedés: 41%; 4A ábra). A TNFR2 expresszióját is meghatároztuk a CD4+ sejteken a kezelések előtt (4B ábra; ellenanyagok jellemzői: 4.

táblázat).

A mikroRNS-ek expressziójának meghatározásához a primer CD4+ limfocitákat TNF-fel kezeltünk 2 órán át, majd aktiválásukhoz anti-CD3/CD28-al konjugált gyöngyöket (Life Technologies, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmaztunk.

42

4. ábra: PBMC sejtek TNFR expressziójának mérése. (A) A sejteket 2 órás PHA stimulációt követően TNFRI-FITC festékkel jelöltük. (B) A sejteket TNFRII-PE konjugált festékkel jelöltük. Mindkét esetben áramlási citometriával mértünk.

3.3.2 Hízósejtek

A hízósejtek aktivációjához a sejteket egy éjszakán át mielóma eredetű IgE-vel (1µg/ml, Serotec, Düsseldorf, Germany) előszenzitizáltuk, majd tápfolyadékkal történő mosást

43

követően anti-humán IgE antitesttel (1,5 μg/ml, Dako Corp., Glostrup, Denmark) keresztkötöttük 2 órán keresztül 0.5% BSA DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tápoldatban.

3.4 Western blot

A kísérletek befejeztével a sejteket centrifugáltuk (400×g, 10 perc) és jéghideg PBS-ben (phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kétszer mostuk, majd 30-100 μl jéghideg lízis pufferben (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), foszfatáz- és proteáz gátló jelenlétében (Sigma-Aldrich) 30 percig jégen lizáltuk. Ezután a lizátumot 14000×g-vel 4^oC-on centrifugáltuk és a felülúszóval dolgoztunk tovább. A minták összfehérje tartalmát Lowry módszerrel mértük (Lowry micro protein kit, Peterson’s modification, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) vagy BCA micro kit-tel (Thermo Scientific, Pierce, Rockford, IL, USA) határoztuk meg. A futtatáshoz 10-50 μg fehérjét tartalmazó lizátumot egészítettünk ki vízzel, valamint redukáló loading pufferrel (Lane Marker Reducing Sample Buffer, Thermo Scientific, Pierce, Rockford, IL, USA), majd az így elkészített mintát 10 percig 100^oC-on, majd jégen inkubáltuk. A futtatáshoz 12%-os gyári géleket (Lonza, Basel, Switzerland) használtunk és az elektroforézist 35 mA-en végeztük, majd polivinil-difluorid membránra (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) blottoltunk. A membrán blokkolásához 5% zsírmentes tejpor TBS 0,05% Tween-20 oldatát használtunk szobahőn 1 órán át, majd a megfelelő antitesttel történő inkubációhoz (1 óra szobahőn vagy egy éjszakán át 4^oC-on) az oldatot 1%-osra hígítottuk. Egyes esetekben SuperSignal Western blot Enhancer-t (Thermo Scientific, Pierce, Rockford, IL, USA) használtunk a jelek felerősítése céljából. A membrán mosása (TBS 0,05% Tween-20, 5×10 perc) után, a membránt a kiválasztott tormaperoxidázzal (HRP) konjugált szekunder antitesttel 1 órán át szobahőn inkubáltunk. A mosási lépéseket követően, a fehérjéket enhanced chemiluminescence (ECL, ECL Plus reagent, Amersham Biosciences, Little Chalfont, U.K.) módszerrel standard röntgen filmen (Kodak) tettük láthatóvá. A jelek optikai denzitás értékét ImageJ program (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) segítségével

44

határoztuk meg. A diagramokon a specifikus sávok háztartási kontrollra (aktin vagy tubulin vagy Ponceau-festés (246)) és kezeletlen mintára normalizált értékei kerültek ábrázolásra.

A használt antitesteket az 3. táblázat foglalja össze.

Célfehérje Primer antitest Szekunder antitest

CD3ζ

3. táblázat: Western blot-hoz használt antitestek összefoglalása.

3.5 Áramlási citometria

A sejteket hideg 0,5% BSA PBS oldatban mostuk, majd 4˚C-on jelöltük a megfelelő antitestekkel 30 percig. Egyszeri mosást követően, a méréseket BD FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) áramlási citométerrel végeztük. Az eredményeket FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) program segítségével értékeltük ki. A hisztogramokon a különböző eseményszámok eloszlásának együttes megjelenítéséhez a

45

méréshez tartozó az egyes rekesztartományokban detektált események számát, a legmagasabb eseményszámot (azaz a legtöbb elemet) tartalmazó intervallumban található elemszámmal osztjuk el, így fluoreszcencia-intenzitás eloszlásai a "maximum"

százalékában kifejezve ábrázolhatóak (maximum %-a). Az áramlási citometria során felhasznált reagenseket a 4. táblázat foglalja össze.

3.5.1 Életképesség meghatározása

A sejteket annexin-kötő pufferben mostuk két alkalommal, majd Annexin V FITC festékkel jelöltük 30 percig szobahőn, szintén annexin-kötő pufferben. Mosás után a sejteket annexin-kötő pufferben mértük és a mérés előtt 5 perccel PI-ot adtunk a csövekhez.

3.5.2 Intracelluláris Ca²⁺ szint mérése

A sejteket RPMI 10% FBS-t tartalmazó tápoldatban egyszer mostuk, majd 1×10⁶/ml koncentrációban osztottuk szét és 1 μM Fluo-4 AM jelenlétében 30 percig inkubáltuk 37^oC-on. A feltöltött sejteket két alkalommal mostuk és tömény FBS oldatban további 20 percig 37^oC-on tartottuk. Újabb két mosási lépést követően tápoldatban vettük fel a sejteket. A mérés során az alapvonal rögzítését követően 1-5 μg/ml anti-CD3-at adtunk a sejtekhez, végül a maximális válasz meghatározásához 0,5 μg/ml ionomicint (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) adagoltunk a csövekhez.

3.5.3 Sejt proliferáció mérése

PBMC sejteket 0,1% BSA-t tartalmazó PBS oldatban szuszpendáltunk fel, és a sejtmembránon átjutni képes CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester) festéket (5 μM) adtunk hozzájuk. Fél óra 37˚C-os inkubáció után a sejteket centrifugáltuk és kétszer mostuk RPMI 10% FBS oldatban. Ezután tömény FBS oldatban tartottuk a sejteket további fél órán át 37˚C-on, majd újból megmostuk őket RPMI 10% FBS tartalmú tápban. 40 ng/ml TNF jelenlétében 2 órán át inkubáltuk a sejteket, ezután 5 μg/ml anti-CD3-mal aktiváluk őket.

46

Primer antitest/festék Gyártó

egér anti-CD3ε FITC (HIT3a) BD Biosciences (San Jose, California, USA)

anti-humán CD4 PerCP (SK3) BD Biosciences

anti-humán TNFRI FITC (55R-170) Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)

anti-humán TNFRII-PE BD Biosciences

anti-humán CD34-FITC BD Biosciences

anti-humán FcεRI-PE BD Biosciences

anti-humán CD117 APC (c-kit) BD Biosciences

Annexin V FITC BD Biosciences

Fluo-4 AM Invitrogen, Molecular Probes

(Carlsbad, CA, USA)

CFSE Invitrogen, Molecular Probes

4. táblázat: Az áramlási citometriához használt antitestek áttekintése.

3.6 Transzfekció

A Jurkat sejteket a gyártó által előírt protokollnak megfelelően traszfektáltuk Cell Line Nucleofector Kit V (Lonza, Basel, Switzerland) segítségével, Amaxa Nucleofector Device II (Lonza, Basel, Switzerland) elektroporátorral X-001 programon, majd éjszakán át 20% savót tartalmazó tápoldatban tartottuk őket a kezelések előtt.

3.6.1 Kis interferáló RNS (siRNS)

A SLAP csendesítéséhez a sejteket tranziensen transzfektáltuk vagy két különböző random szekvenciát tartalmazó siRNS-sel (300-300 nM) vagy két különböző a SLAP-ra specifikus siRNS-sel (300-300 nM) (mindegyik Life Technologies, Applied Biosciences, Carlsbad, CA, USA). A csendesítés hatékonyságát valós idejű RT PCR-rel és Western blottal is igazoltuk (5. ábra).

47

5. ábra: A transzfekció hatékonyságának ellenőrzése. (A) Jurkat sejteket két random szekvenciájú, két a GAPDH-ra, vagy két a SLAP-ra specifikus siRNS-sel transzfektáltuk, és éjszakán át 37^oC-on pihentettük őket. Ezután RNS-t izoláltunk és valós idejű PCR-rel vizsgáltuk a SLAP illetve a GAPDH expresszióját. (B) Jurkat sejteket vagy két random szekvenciájú vagy két a SLAP-ra specifikus siRNS-sel transzfektáltuk. Kontrollként nem transzfektált sejteket is vizsgálatunk. Az éjszakán át történő inkubációt követően fehérjét izoláltuk és Western blot rendszerben néztük a SLAP fehérje expresszióját.

3.6.2 DNS Vektorok

A sejteket vagy enhanced GFP (eGFP)–SLAP felhasználásra kész, teljes hosszúságú, nyitott leolvasási keretű cDNS vektorral vagy kontroll eGFP vektorral (mindkettő 10

48

μg; GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) transzfektáltuk, majd éjszakán át pihentettük őket. Az transzfekció hatékonyságát áramlási citometriával ellenőriztük.

3.7 Konfokális mikroszkópia

A Jurkat sejteket a kísérleteket követően PBS-sel mostuk, majd BD Cell-Tak^® (BD Biosciences, San Jose, California, USA) oldatban reszuszpendáltuk és 8 kamrás sejt tenyésztő edény (BD Biosciences, San Jose, California, USA) lyukaiba vittük fel 0,5×10⁶/lyuk koncentrációban, majd 1 órán át inkubáltuk 37^oC-on. A lyukakat egyszer mostuk hideg PBS-sel, majd Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, San Jose, California,

A Jurkat sejteket a kísérleteket követően PBS-sel mostuk, majd BD Cell-Tak^® (BD Biosciences, San Jose, California, USA) oldatban reszuszpendáltuk és 8 kamrás sejt tenyésztő edény (BD Biosciences, San Jose, California, USA) lyukaiba vittük fel 0,5×10⁶/lyuk koncentrációban, majd 1 órán át inkubáltuk 37^oC-on. A lyukakat egyszer mostuk hideg PBS-sel, majd Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, San Jose, California,

In document A T-limfociták aktivációjának és egyes mikroRNS-ek expressziójának vizsgálata (Pldal 32-0)