A ruténiumvörös mint K 2P csatorna gátlószer

Habár számos sejttípusban a nyugalmi membránpotenciál fontos meghatározói és szabályozói a K2P háttér K⁺ csatornák [12], igen hasonló makroszkópos áramuk farmakológiai elkülönítése még mindig nem teljesen megoldott [94]. Specifikus inhibitorok hiányában minden olyan módszer hasznos lehet, mely egyazon sejten belül képes megkülönböztetni az egyes K2P csatorna típusok áramát. Ezzel magyarázható az egyébként kevésbé specifikus ruténiumvörös széleskörű használata a gyakran egy helyen előforduló TASK-1 és TASK-3 áramok elkülönítésében. Munkánk folyamán újabb, a ruténiumvörös kísérletes farmakológiai célú felhasználását lehetővé tévő felfedezést tettünk: a polikationos festék a közeli rokon, nagyfokú szekvenciabeli identitást mutató TREK-1 és TREK-2 csatornák áramát is képes megkülönböztetni. A TREK-2 áramát ugyanis igen hatékonyan és gyorsan gátolja, a TREK-1 áramot viszont egyáltalán nem befolyásolja. Az eredmény váratlan és meglepő, hiszen a TREK csatornák aminosav-szekvenciája nagyon hasonló, és a jelenleg ismert szabályozási folyamataik többsége is megegyezik. Egy közelmúltban megjelent közleményben a szerzők előre feltételezték, hogy a TREK-2 sem érzékeny a ruténiumvörösre, mint ahogy a TREK-1 sem az [129]. Azonban a ruténiumvörös háttér K⁺ áramra kifejtett hatása alegységenként már egy aminosavnyi eltéréskor is megváltozhat, mint ahogy a TASK-1 és TASK-3 esetén, úgy a TREK-1 és TREK-2 csatornáknál is. A TREK-2 csatornában a negatív töltésű, 135-ös aszpartát a ruténiumvörös-érzékenység hordozója, míg az RR-rezisztens TREK-1 csatorna megfelelő 110-es pozíciójában a hidrofób izoleucin található.

A TWIK-1, TREK-1, TREK-2 és TRAAK [22-25] kristályszerkezetek alapján a csatornák pórusának extracelluláris bejáratát az ún. cap (sapka) domén fedi. Ezen halad keresztül egy viszonylag rövid, a plazmamembránnal párhuzamos alagútszerű csatorna, az extracelluláris ionút (EIP), mely ily módon az extracelluláris tér és a pórus bejárata között létesít kapcsolatot. Az EIP a pórussal egy T betűhöz hasonló alakzatot képez, ahol a T függőleges szára az ioncsatorna pórusának felel meg, a horizontális szár pedig az EIP-nek (25. ábra). A két alegységből felépülő TREK-2 D135 oldalláncai térben a pórus forgástengelyéhez viszonyítva szimmetrikusan, a szelektivitási filter felett a cap doménban helyezkednek el, és az EIP-t felülről és középtájon határolják.

25. ábra: A humán TREK-2 dimer alegységeinek D135 aminosava a szelektivitási filter felett az extracelluláris ionútban helyezkedik el. Az ábra a humán TREK-2 kristályszerkezete (PDB ID: 4BW5) alapján a MolAxis [255] és a VMD [256] szoftverek felhasználásával készült.

Az extracelluláris ion utat (extracellular ion pathway, EIP) kék gömbök töltik ki, alatta a csatorna függőleges pórusában a négy zöldesbarna gömb K⁺ ionokat reprezentál. A D135 (sárga ball-and-stick modell szerint ábrázolva, az oxigén- (piros) és nitrogénatomok (kék)) az EIP felső falán, a szelektivitási filter felett található. A csatorna két alegységét pirossal és zölddel, a szalag modell szerint ábrázoltuk. Az ábrázolás síkja nem pontosan merőleges az EIP irányára, hanem a függőleges tengely mentén kissé elfordított, hogy a két alegység 135-ös aszpartátjai külön-külön is láthatóak legyenek. (Az alegységek NSSN és NSSNNS szekvenciáit a felhasznált kristályszerkezeti modell nem oldja fel, de ez nem befolyásolja az EIP megjelenítését.) ([II]. anyagából módosítva.)

Kísérleteink alapján nagyon valószínű, hogy a D135 negatív töltésű aszpartátok az RR elsődleges interakciós partnerei. Az RR kötődése az EIP ezen részéhez elektrosztatikusan és/vagy sztérikusan gátolja a pozitív töltésű K⁺ ionok mozgását, vagyis a TREK-2 áramát. Szekvenciájukat összehasonlítva kiderült, hogy a szintén RR-érzékeny TASK-3 70-es, RR-szenzitivitásért felelős glutamátja (E70) és a TREK-2 D135 homológ pozícióban helyezkednek el az első extracelluláris hurokrégióban [229;257], habár a TASK-3 és TREK-2 szekvenciák hasonlósága ebben a régióban nem kifejezett (20./A ábra). A két RR-érzékeny K2P csatorna kérdéses aminosavainak az EIP-hez viszonyított térbeli helyzete a jelenlegi TASK-3 szerkezetmodell, illetve

TREK-2 kristályszerkezet alapján eltérőnek tűnik (vesd össze a 25. ábrát Gonzalez és mtsai. közleményének 1. ábrájával [257]). Természetesen a homológia modell megbízhatósága nem teljes, és a kristályosítási folyamatnak drasztikus hatásai lehetnek a csatorna konformációjára, mint ahogy azt a TRAAK különböző kristályszerkezeteit bemutató közleményekben is láthatjuk [23-24].

A TREK csatornák szabályozása igen összetett, de a TREK-1 és TREK-2 esetén a legtöbb ponton megegyezik. Mindkét csatorna mechanoszenzitív, hőmérséklet-érzékeny, aktiválódnak inhalációs anesztetikumokra, PUFA-kra vagy a sejten belüli savanyodásra, míg a PKA, a PKC és az AMP-aktivált protein kinázok gátlólag hatnak rájuk [12]. Néhány tulajdonságukban azonban eltérnek: az extracelluláris savanyodás a TREK-1 áramot gátolja, míg a TREK-2 áramra serkentőleg hat, melynek hátterében az első extracelluláris hurkon található konzervált hisztidin oldallánc és a szintén extracellulárisan, de nem az első hurkon található töltéssel rendelkező aminosavak állnak [153-154]. A két TREK egyedi csatorna vezetőképessége is eltérő, bár ez a megközelítés a mérési technikán felül további nehézségeket rejt magában, mivel a különböző alternatív transzlációs iniciációs variánsok is más-más vezetőképességgel rendelkeznek [116]. A TREK csatornák központi idegrendszerbeli és perifériás expressziója is különböző, tehát valószínűleg funkciójukban is vannak eltérések [119].

Eredményeink alapján a ruténiumvörös segítségével a TREK-1 és TREK-2 makroszkópos árama megkülönböztethető, így ez a farmakológiai ágens hasznos kiegészítője lehet a két áram szeparálását célzó jelenleg elérhető eszköztárnak. A TREK alcsalád harmadik tagja, a TREK-1 és TREK-2 csatornákhoz képest jelentősebb különbséggel bíró TRAAK áram is gátolható RR-rel, bár nem olyan hatékonyan, mint ahogy azt korábban közöltük [52]. Ugyanis annak ellenére, hogy az 1996-ban vásárolt RR preparátum kevesebb tiszta RR-t tartalmaz, mint a 2013-ban vásárolt készítmény, sokkal hatékonyabban gátolta a TRAAK áramot. Vizsgálatainknak köszönhetően kiderült, hogy a ruténiumibolya (RV) is hozzájárult a régi készítmény nagyobb hatékonyságához. A ruténiumibolya nem ritka szennyező komponense a kereskedelmi forgalomban elérhető, kevésbé tiszta RR készítményeknek. Az RR és RV TRAAK áramra kifejtett gátlásának dózis-hatás görbéjéből számított Hill koefficiensek eltérnek (22./B ábra). Ez nemcsak a TRAAK csatorna és a kétféle ruténium-vegyület eltérő affinitására utal, hanem különböző hatásmechanizmusra is. Valószínűleg a TRAAK

csatornán is EC-an elhelyezkedő negatív töltésű aminosavakon fejti ki hatását a két ruténium-vegyület, de ezen oldalláncok meghatározása nem tűnik könnyen kivitelezhetőnek. Tudniillik az egér TRAAK alegységenként tizennégy negatív töltésű (Asp vagy Glu) és öt hisztidin aminosavat tartalmaz az EC hurokrégióin, melyek közül se a kristályszerkezeti modell, se az összehasonlító szekvenciaanalízis alapján nem találtunk nagyobb valószínűséggel RR (és/vagy RV) interakciós partnerként szóba jövő oldalláncot. Habár számos pont- és duplamutáns egér TRAAK csatornát megvizsgáltunk (az eredményeket nem mutatom), de ezek alapján is nagyszabású vizsgálatsorozatra lesz szükség a TRAAK csatorna RR és RV érzékenységéért felelős aminosavainak azonosításához.

A hátsó gyöki ganglion (DRG) idegsejtjein számos K2P csatornát azonosítottak in situ hibridizációs módszerrel [120]. Az egyes háttér K⁺ áramok arányát a teljes K2P

áramon belül egyedi csatorna (single channel) mérésekkel határozták meg [78]. A háttér K⁺ áram döntő részét a TRESK áram adta 24 °C-on, míg a TREK-2, TREK-1 és TRAAK áramok előfordulása elhanyagolható volt. Magasabb hőmérsékleten, 37 °C-on a TREK-2 dominált, majd gyakoriságban a TRESK következett, végül a TREK-1 és a TRAAK csak ritkán volt megtalálható. Mivel eredményeink szerint a TREK-2 kifejezetten gátolható ruténiumvörössel, adódott a kérdés, hogy kimutatható-e 37 °C-on RR-érzékeny háttér K⁺ áram összetevő izolált DRG neuronokon, teljes-sejt patch clamp módszerrel.

Eredményeink alapján a nagyobb DRG neuronok viszonylag nagy háttér K⁺ áramában az RR-érzékeny összetevők (TREK-2, TRAAK és TASK-3) csak kisebb arányt képviselnek, míg a kisebb háttér K⁺ áramú idegsejtek aránylag nagy RR-érzékenységgel rendelkeznek. Ez összhangban van egy, a közelmúltban megjelent közleménnyel, melyben azt találták, hogy a kisebb átmérőjű, elsősorban C nociceptoroknak megfelelő DRG neuronok jelentős része TREK-2 immunoreaktivitást mutat [258].

Tehát a ruténiumvörös felhasználható a TREK-1 és TREK-2 áramok elkülönítésére heterológ rendszerben és natív sejten egyaránt. Elsőként mértünk patch clamp eljárással teljes-sejt konfigurációban DRG neuronon RR-érzékeny háttér, feltehetőleg TREK-2 K⁺ áramot.