szerző: Dr. Fodor Ferenc
3.6. A szén-dioxid megkötése és redukciója
3.6.4. A Rubisco-aktiváz
A Rubisco nem aktivált alapállapotban igen alacsony affinitású a CO2-hoz, egy magas Km(CO2)értékű enzim. A növekvő CO2koncentráció egy bizonyos mértékig növeli az aktiválás, és a reakció sebességét. Az aktiválás (lásd 3.6.3.2. fejezet) RuBP hiányában spontán végbemegy. Fiziológiás körülmények között a nem aktivált Rubisco
nagy hatékonysággal köti meg a RuBP-ot, ami megakadályozza az enzim aktivációját. Ugyanakkor bizonyos cukorfoszfátok igen erősen kötődnek a karbamilált (aktivált) enzimhez és így gátolják a működését (kompetitív inhibitorok, lásd 3.6.3.2. fejezet).
A CO2koncentráció [Kact(CO2)] általában alacsony a kloroplasztiszban és nem elégséges a Rubisco spontán aktiválásához, ill. a magas RuBP koncentráció is megakadályozza ezt a folyamatot. Ezzel szemben a CO2-megkötés in vivohatékonysága a maximális érték 70-100%-át is elérheti, telítési fényintenzitáson. Ennek hátterében egy enzim működése áll, a Rubisco-aktivázé, amely a Rubisco-t működőképes állapotban tartja. A Rubisco-aktiváz védi ki a cukorfoszfátok gátló hatását aktiválás előtt és után, valamint az alacsony CO2-koncentráció limitáló hatását az aktiválásra.
3.6.4.1. A Rubisco-aktiváz szerkezete és működése
Az enzim (41-46 kD) magban kódolt és a prekurzor polipeptid 58 aminosavból álló tranzitpeptiddel rendelkezik és így transzportálódik a kloroplasztiszba.
Az enzim működésének lényege, hogy elősegíti a RuBP és az egyéb gátló molekulák disszociációját az aktiválatlan, illetve aktivált Rubisco-ról és ezáltal szabaddá teszik a helyet az aktiválásra, illetve az enzim reakció számára (3.30. ábra). A Rubisco-aktiváz működése ADP/ATP arányfüggő, a reakció ATP-igényes. Ez az egyik regulációs kapocs a CO2-megkötés és a fényreakciók között, továbbá az enzim működése a ferredoxin-tioredoxin rendszer által is befolyásolt.
3.30. ábraA Rubisco-aktiváz működése
A Rubisco-aktiváz szubsztrátjai a Rubisco specifikus formái: RuBP-ot kötő nem-karbamilált és az aktivált, de cukorfoszfátot kötő enzim. Az enzim a működése során a kétféle pozícióban lévő cukorfoszfát-Rubisco kötődésének az erősségét csökkenti, amihez az ATP hidrolízise szükséges és ezt követően az inhibitor molekula ledisszociál.
A Rubisco-aktiváz aktivitásának szabályozásában pozitív effektor a sztróma pH-jának és a Mg2+ -ion koncentrációjának az emelkedése is. Sötétben a Rubisco alapvetően RuBP-ot, illetve CA1P-ot köt (inaktív), míg fényen a Rubisco-aktiváz aktiválódik.
A Rubisco aktivitását bár a Rubisco-aktiváz jelentősen befolyásolja, az aktív-inaktív egyensúly kialakításában a Rubisco-ról ledisszociált cukorfoszfátok metabolizációját végző enzimek aktivitása is felelős (3.29. ábra).
3.6.4.2. A Rubisco katalitikus tulajdonságai és jellemzése
A Rubisco kutatásának, annak kiemelkedő jelentősége, a kétféle enzimaktivitása, a „gyenge” teljesítménye és az alacsony hatásfoka miatt, nagy figyelmet szenteltek. Óhatatlanul felmerült a kérdés, vajon javítható-e az enzim katalitikus aktivitása [Kcat(CO2)], fejleszthető-e az enzim specifitása CO2-re vagy egyszerre mind a két paraméter, illetve kiküszöbölhető-e az enzim oxigenáz aktivitása? Természetesen felmerült az a kérdés is, hogy az evolúció során miért nem alakult ki ennek a kulcsfontosságú enzimnek egy jóval nagyobb hatékonyságú formája?
A Rubisco jellemezhető a két enzimaktivitás, a karboxiláció és az oxigenáció közötti megoszlással adott CO2és O2koncentrációnál:νCO2/νO2= τ [CO2]/ [O2],ahol aτ egy specifitási faktor, ami kifejezi az enzim kinetikai tulajdonságainak az arányát, azaz aVCO2KO2/VO2/KCO2-t, ahol AKa Michaelis konstans CO2-ra és O2-re, míg aVa két folyamat maximális sebessége. Aτspecifitási faktor mutatja a Rubisco két kompeticióban lévő szubsztrátja közötti megoszlást. A magasabbτérték jelzi a magasabb specifitást CO2-ra.
Az evolúció során aτértéke fokozatosan javult. Fotoszintetizáló baktériumoknál 10-15, cianobaktériumoknál 50, zöld algáknál 60 és a magasabb rendűeknél 80 körüli érték.
Számos kísérlet történt a Rubisco enzimatikus tulajdonságainak javítására: random és irányított mutagenezis („random and directed side-chain mutagenesis”), oldalláncok kémiai módosítása, elsősorban az aktív helyen, ill.
környékén, valamint az alegységek hibridizációja, z aktiválási folyamat során a fémion helyettesítése (Mg2+helyett Mn2+, Fe2+, Ca2+, Cu2+, Co2+, Ni2+), és a hőmérsékletváltoztatás.
Általában elmondható, hogy minden ilyen irányú beavatkozás szignifikánsan csökkentette az enzim specifitását.
Hasonló negatív hatással járt az L és az S alegységek közötti kapcsolatokban résztvevő oldalláncok módosítása is.
A fent említett beavatkozások nem jártak kecsegtető sikerrel, ami értelmezhető úgy is, hogy ha az evolúció során lett volna lehetőség egy fejlett, hatékonyan működő Rubisco szelekciójára, az meg is történt volna. Azaz a Rubisco kettős enzimaktivitása az enzim immanens sajátsága, nem küszöbölhető ki.
3.6.5. A fénylégzés
A Calvin-ciklus kulcsenzime, a Rubisco, a karboxiláz aktivitása mellett oxigenázként is működhet, amelynek következménye egy C2-es anyagcsere út, a fénylégzés (fotorespiráció) beindulása, amely folyamat befolyásolja a fotoszintetikus produkciót.
A fénylégzés folyamatában három sejtorganellum: a kloroplasztisz, a peroxiszóma és a mitokondrium vesz részt (3.31. ábra). A reakciósor folyamán több ponton O2használódik föl (Rubisco oxigenáció, glikolsav→glioxálsav átalakulás, glicin→szerin átalakulás) és CO2, valamint NH4+
szabadul föl. A folyamat ilyen formán egy légzési láncnak is felfogható.
3.31. ábraA fénylégzés folyamatai és azok kompartmentizációja
A fénylégzést a magas hőmérséklet fokozza, mert a CO2diffúziója gyorsabb a kloroplasztiszból, mint az O2 diffúziója és ezért a CO2/O2arány romlik, ami nem kedvez a karboxilációnak. Az emelkedő hőmérséklet hatására, a vízvesztés elkerülésére sztómazáródás következhet be, ami az intercellulárisok CO2koncentrációjának csökkenését okozza. Továbbá növeli a fénylégzés növekedését a magas fényintenzitás is, mivel a fotoszintetikus elektrontranszportlánc működése gyorsul és a melléktermék, az oxigén koncentrációja nő, tovább rontva a CO2/O2 arányt, ezáltal a karboxiláció esélyét.
A fénylégzés során szabaddá váló CO2értelemszerűen a már korábban asszimilált szén elvesztését jelenti. Így a fénylégzés csökkenti a nettó fotoszintetikus produkciót. Ez a veszteség a fénylégzésnek kedvező körülmények között akár az 50%-ot is elérheti. Emellett a fénylégzésnek bizonyos szabályozó szerep is tulajdonítható, miszerint a fényreakciók túlműködése során képződött primer fotoszintetikus termékek (ATP, NADPH) fölöslege ezen az úton „csorog” el.
A növényvilág evolúciója során a földi légkör átalakulásával nőtt az O2és ha nem is egyenletesen, de csökkent a CO2mennyisége. Ezek a változások, a Rubisco karboxiláz funkciójának „gyengeségét” is ismerve, szelekciós nyomást gyakorolt a C3-as növények CO2-megkötési folyamatára. A fénylégzést támogató tényezők erősödése többféle, a fénylégzés kivédését szolgáló mechanizmus kifejlesztését váltotta ki:
-Kézenfekvőnek tűnt ilyen körülmények között a Rubisco karboxiláz aktivitásának, enzimkinetikai paramétereinek fejlődése, javulása (CO2-affinitás, specifitás). Bár ilyen tendenciák megfigyelhetők a különböző evolúciós fejlettségű
növénycsoportok összehasonlításakor, de olyan végső megoldás, mint az oxigenáz aktivitás eliminálása, nem következett be.
Már az evolúció korai szakaszában megjelentek olyan széndioxid koncentráló mechanizmusok (CCMs -CO2Concentrating Mechanisms), amelyek közreműködésével kedvezőbb feltételeket, magasabb CO2 szintet lehetett teremteni a Rubisco környezetében. Ezek a mechanizmusok különféle változatokban mindmáig fennmaradtak és a folyamatokat alapvetően a szénsav-anhidráz enzimek (carbonicanhydrase -CA) vezénylik.
Későbbi időperiódusban, a különböző szelekciós nyomást kifejtő tényezők eltérő kombinációjának eredményeképpen genetikai és ennek megfelelő metabolikus módosításokkal olyan adaptációs mechanizmusok fejlődtek ki és rögzültek, amelyek a már meglévő C3-as út elé épülve, CO2-gyüjtő antennaként működve biztosították a Rubisco számára az optimális körülményeket, azaz a magas CO2koncentrációt. Ezek a mechanizmusok az időben előbb kialakult CAM (CrassulaceaeAcidMetabolism), majd a C4-es út voltak (lásd 3.6.7. és 3.6.8. fejezetek).