Az előző eredményünk megerősítésére kvantitatív fluorimetriás méréseket végeztünk az apoptózis/nekrózis mértékét vizsgálva. A mitkondriális membránpotenciál csökkenése az apoptózis korai jelei közé tartozik. A DilC1 egy olyan fluoreszcens festék, ami a mitokondriális membránpotenciál függvényében halmozódik fel a sejtek mitokondriumaiban, így az apoptotizáló sejtek az ép sejtekhez képest csökkent fluoreszcencia intenzitást adnak. A scrambled és az sh854 tenyészeteken mért értékeket tüntettük fel a nem transzfektált kontroll százalékában ábrázolva.
Megállapítottuk, hogy a RasGRP3 expresszió gátlása nem csökkenti a mitokondriális membránpotenciált, azaz nem indukál apoptózist (10. ábra). Az eredményeket ebben az esetben a kontrollhoz viszonyított fluoreszcencia egységek arányban adtuk meg.
MCF7 T-47D
scrambled kontroll
sh854 scrambled
kontroll
sh854
N=8, átlag±SE
képes átjutni, a nekrózist szenvedett sejtekbe azonban képes belépni, és ott a sejtmag DNS-éhez kötődni. Ilyen módon a festék fluoreszcenciájának fokozódása a nekrotikus sejtek arányának a növekedését jelzi. Látható, hogy a RasGRP3 expresszió csökkentése nem fokozta a sejtekben a festék akkumulációját, így nem történt nekrózis (11. ábra).
A RasGRP3 géncsendesítése tehát nem okozott apoptózist, sem nekrózist egyik sejtvonal esetében sem.
Apoptózis/DilC1 (5)
10. ábra: A RasGRP3 géncsendesítés hatása a mitokondriális membránpotenciálra
A RasGRP3 expresszió gátlása nem csökkenti a mitokondriális membránpotenciált egyik tenyészet esetén sem, azaz nem indukál apoptózist.
Nekrózis/Sytox Green
11. ábra: A RasGRP3 géncsendesítés hatása a nekrotikus folyamatokra
MCF7 T-47D
MCF7 T-47D
scrambled kontroll
sh854 scrambled
kontroll
sh854
N=8, átlag±SE
N=8, átlag±SE scrambled
kontroll
sh854 scrambled
kontroll
sh854
MEGBESZÉLÉS
Vizsgálataink középpontjában a RasGRP3 fehérje állt, mely a RasGRP család tagjaként a Ras jelátviteli fehérje guanin nukleotid cserélő faktoraként funkcionál. A RasGRP3 aktiválni képes a Ras fehérjét, így számos jelátviteli útvonal mozgósításában központi szerepet játszik.
Számos irodalmi adat utal arra, hogy különböző humán daganatokban a Ras jelátviteli útvonal kulcsfontosságú szerepet tölt be. Maga a Ras egy olyan kapcsolófehérje, amely aktív GTP kötött és egy inaktív GDP kötött állapot között váltakozik. A Ras aktiválódása során több jelátviteli útvonalat képes mozgósítani, így képes aktiválni a RalGDS (Ral nukleotid cserélő faktor) jelátviteli útvonalat, az ERK/mitogén-aktivált protein kináz kaszkádot (MAPK kaszkád), valamint a foszfoinozitid 3-kináz (PI3K) és a foszfoinozitid – specifikus foszfolipáz Cε (PLCε) útvonalakat (White J. és mtsai, 2009; Gunzburg J., 1999; Katz ME. és McCormick, 1997; Cullen PJ. és Lockyer PJ., 2002; Krishna M. és Narang H., 2008)
A RasGRP3 fehérjéről kevés információ áll a rendelkezésünkre, lehetséges funkcióját elsők között prosztatarákon írták le (Yang és mtsai, 2010). Kimutatták, hogy a RasGRP3 expressziója fokozódik humán prosztata daganatokban, magas szinten expresszálódik androgén független PC3 és DU145 prosztata sejtvonalakon, ugyanakkor nincs jelen az androgén függő LNCaP sejtvonalon. Bebizonyosodott, hogy a RasGRP3 LNCaP sejtekbe történő overexpressziójának hatására a sejtek elvesztették androgénfüggőségüket, illetve mind hím, mind nőstény egerekben tumort indukáltak. A RasGRP3 expresszió gátlása csökkentette mind az Akt, mind az ERK1/2 foszforilációját. Ezen eredmények azt sugallják, hogy a RasGRP3 szerepet játszhat a malignus prosztata rákok kialakulásában.
Ezekből az adatokból kiindulva kezdtük el vizsgálni a RasGRP3 kifejeződését elmő-eredetű ductalis adenocarcinomából származó humán szöveti mintákon és sejtkultúrákon.
Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a RasGRP3 mind mRNS mind fehérje szinten egyaránt kifejeződik humán ép és daganatos, eltérő grádusból származó emlő szöveti mintákban, hasonlóan a humán melanóma szövetekhez (Yang és mtsai, 2011). Kimutattuk, hogy a RasGRP3 fehérje expressziója (4/B ábra) magasabb a tumoros szövetekben, a kontrollhoz képest.
A tumoros szöveti metszeteken immunfestés segítségével azt is megállapítottuk, hogy a RasGRP3 sejten belüli lokalizációja jellemzően a citoplazmában helyezkedik el, míg a fehérje aktív formája a foszfoRasGRP3 nukleáris-perinukleáris festődést mutat (5. ábra).
Kísérleteink következő szakaszában in vitro körülmények között 6 emlő-eredetű tumoros sejtvonalon vizsgáltuk a RasGRP3 kifejeződését (primer: B474; metasztatikus: MCF7, T-47D, SK-BR-3, MDA-MB-453, JIMT-1). A Q-PCR-ral kapott eredményeink azt mutatják, hogy a metasztatikus sejtvonalakban a RasGRP3 kifejeződése magasabb (6/A ábra) (kivéve az MDA-MB-453 metasztatikus sejtvonal), mint a primer sejtkultúra esetében. Ezen megállapításainkat alátámasztották a Western blottal (6/B ábra) és immuncitokémiával (6/C ábra) kapott eredményeink is. Mindezek alapján feltételezhető, hogy a RasGRP3-nak szerepe lehet az emlő-eredetű metasztázisok kialakulásában.
A RasGRP3 biológiai funkcióinak vizsgálatához két metasztatikus sejtvonalon (MCF7 és T-47D) siRNS technikával géncsendesítést végeztünk.
A géncsendesítést követően életképességi és proliferációs assay-t, illetve apoptózis és citotoxicitás vizsgálatokat hajtottunk végre. A sejtek életképességének vizsgálatánál megállapítottuk, hogy sem a scrambled kontrollal, sem pedig az shRNS-sel transzfektált sejteknél nem történt jelentős változás, azaz a RasGRP3 kifejeződésének csökkenése sem az MCF7, sem a T-47D sejteknél nem okozott életképesség változást a kontrollhoz képest (9.
ábra). Ugyanakkor CyQUANT assay segítségével kimutattuk, hogy a scrambled szekvencia nincs hatással a sejtek proliferációjára, ugyanakkor a RasGRP3 expressziójának gátlása a proliferáció mértékének szignifikáns csökkenését okozta mindkét sejtvonal esetében (8.
ábra).
Kísérleteink során DilC1/SytoxGreen assay-ekkel azt is megállapíthattuk, hogy az shRNS-sel transzfektált sejtek esetében sem apoptózis, sem nekrózis folyamata nem alakult ki (10. és 11. ábra) Ezen eredményeink azt sugallják, hogy a RasGRP3 fehérje MCF7 és T-47D sejteken történő géncsendesítése ugyan csökkenti a sejtek proliferációját, de ezen hatását nem a sejtek életképességének változásán, azaz nem a sejtek apoptotikus és nekrotikus folyamatainak szabályozása révén váltja ki.
Mivel a RasGRP3 fehérje aktivitása szerepet játszhat az emlő-eredetű metasztázisok kialakításában és a sejtek növekedésének szabályozásában, felvetődhet a lehetősége, hogy a fehérje potenciális célpont lehet az emlődaganat esetleges terápiájában.
A RasGRP3 fehérjéről alkotott kép teljessége érdekében további kísérletek elvégzését látjuk szükségesnek. A felmerülő kérdések megválaszolása érdekében a transzfektált
IRODALOMJEGYZÉK
Aiba Y, Oh-hora M, Kiyonaka S, Kimura Y, Hijikata A, Mori Y, Kurosaki T., (2004) Activation of RasGRP3 by phosphorylation of Thr-133 is required for B cell receptor-mediated Ras activation. Proc Natl Acad Sci U S A, 101(47):16612-7.
Alshamsan A., (2011) Paradoxical signaling pathways in developing thymocytes. J Pharm Pharm Sci. 14(3):378-86.
Ádám Veronika: Orvosi Biokémia, 3. kiadás, Budapest, Medicina Könyvkiadó Zrt, 2006;
488-490 o.
Cullen PJ, Lockyer PJ., (2002) Integration of calcium and Ras signalling. Nat Rev MolCell Biol. (5):339-48.
Dr. Szalai Krisztián: Általános és részletes pathológia, Kaposvár, Corvina Nyomda Kft., 2008; 44-55 o.
Geyer FC, Rodrigues DN, Weigelt B, Reis-Filho JS., (2012) Molecular classification of estrogen receptor-positive/luminal breast cancers. Adv Anat Pathol. 19(1):39-53.
Green D. R. és Reed J. C. (1998) Mitochondria and apoptosis. Science 281:1309–1312.
Gunzburg J., (1999) Proteins of the Ras pathway as novel potential anticancertherapeutic targets. Cell Biol Toxicol. 15(6):345-58
Irie K, Masuda A, Shindo M, Nakagawa Y, Ohigashi H., (2004) Tumor promoter binding of the protein kinase C C1 homology domain peptides of RasGRPs, chimaerins, and Unc13s.
Bioorg Med Chem. 12(17):4575-83.
Johnson JE, Goulding RE, Ding Z, Partovi A, Anthony KV, Beaulieu N, Tazmini G,
Katz ME, McCormick F., (1997) Signal transduction from multiple Ras effectors. CurrOpin Genet Dev. 7(1):75-9
Krishna M, Narang H., (2008) The complexity of mitogen-activated protein kinases(MAPKs) made simple. Cell Mol Life Sci. 65(22):3525-44
Kumar. Abbas, Fausto, Mitchell: Robbins Basic Pathology, 8th Edition, Philadelphia, Saunders Elseiver, 2007, 743-749
Laemmli UK., (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227(5259):680-5
Lambert QT, Reuther GW., (2006) Activation of Ras proteins by Ras guanine nucleotide releasing protein family members. Methods Enzymol. 407:82-98.
Reuther GW, Lambert QT, Rebhun JF, Caligiuri MA, Quilliam LA, Der CJ., (2002) RasGRP4 is a novel Ras activator isolated from acute myeloid leukemia. J Biol Chem.
277(34):30508-14.
Stone JC., (2006) Regulation of Ras in lymphocytes: get a GRP. Biochem Soc Trans. 34(Pt 5):858-61.
Stone JC., (2011) Regulation and Function of the RasGRP Family of Ras Activators in Blood Cells. Genes Cancer. 2(3):320-34.
Susin S. A., Zamzami N. és Kroemer G. (1998) Mitochondria as regulators of apoptosis:
doubt no more. Biochem. Biophys. Acta 1366:151–165.
Szamałek M, Baer-Dubowska W., (2007) RasGRP proteins--Ras-activating factors. Postepy Biochem. 53(2):112-20.
Yang D, Kedei N, Li L, Tao J, Velasquez JF, Michalowski AM, Tóth BI, Marincsák R, Varga A, Bíró T, Yuspa SH, Blumberg PM., (2010) RasGRP3 contributes to formation andmaintenance of the prostate cancer phenotype. Cancer Res. 70(20):7905-17
Yang D, Tao J, Li L, Kedei N, Tóth ZE, Czap A, Velasquez JF, Mihova D,Michalowski AM, Yuspa SH, Blumberg PM., (2011) RasGRP3, a Ras activator, contributes tosignaling and the tumorigenic phenotype in human melanoma. Oncogene. 30(45):4590-600.
Whyte J, Bergin O, Bianchi A, McNally S, Martin F., (2009) Key signalling nodes inmammary gland development and cancer. Mitogen-activated protein kinase signalling in experimental models of breast cancer progression and in mammary glanddevelopment. Breast Cancer Res. 11(5):209
www.cancer.org
Zheng Y, Liu H, Coughlin J, Zheng J, Li L, Stone JC., (2005) Phosphorylation of RasGRP3 on threonine 133 provides a mechanistic link between PKC and Ras signaling systems in B cells. Blood 105(9):3648-54.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik segítették munkámat, és hozzájárultak ezen dolgozat létrejöttéhez.
Mindenek előtt köszönöm Nagy Zsuzsanna doktorjelöltnek és Czifra Gabriellának a szakmai fejlődésemhez nyújtott önzetlen segítségüket és a felém tanúsított türelmüket.
Köszönöm Dr. Bíró Tamásnak, DE-MTA „Lendület” Sejtélettani Kutatócsoport Sejt- és Molekuláris Élettani Laboratórium vezetőjének, hogy megteremtette a munkámhoz szükséges feltételeket, illetve a labor összes dolgozójának, hogy bármikor számíthattam a segítségükre.
Külön köszönet illeti Dr. Kovács Ilonát és Dr. Török Miklóst a Debreceni Kenézy Gyula Kórház Pathológiai osztályának munkatársait, illetve Dr. Tóth Dezsőt a Sebészeti Osztály munkatársát, akik a humán emlőminták gyűjtésében segítségünkre voltak.
FÜGGELÉK
TDK munkám során az emlő-eredetű tumoros sejtvonalak tenyésztését (tápoldat-készítés, passzálás, sejtszám-meghatározás, szükség esetén fagyasztás), a kísérletekhez való előkészítését (96 lyukú tenyésztőedénybe történő szélesztés), az életképesség (MTT-assay), a sejthalál (DilC1(5)-SYTOX Green assay), a proliferáció (CyQUANT-assay) vizsgálatát, valamint a különböző génexpressziós vizsgálatokat (RT-QPCR) önállóan hajtottam végre.
A kísérletek megtervezését, az immunfestéseket (Immunhisztokémia, Immuncitokémia), a RasGRP3 fehérje-szintű kimutatását (Western blot), a RasGRP3 géncsendesített tenyészetek létrehozását, a kapott eredmények kiértékelését, valamint a pályamunka megírását témavezetőim segítségével végeztem.
TÁMOGATÓ
A kutatás a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése konvergencia program” című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.