A PXDN ismert működéseinek szerkezeti feltételei

A PXDN egy, az ECM fehérjékre jellemző motívumainak köszönhetően adhezív tulajdonságokkal is bíró peroxidáz enzim, amely a sejten kívüli térbe szekretálódva látja el eddigi egyetlen ismert fiziológiás feladatát, a kollagén IV protomerek NC1 doménjeinek keresztkötését. Annak érdekében, hogy jobban megértsük a PXDN összetett szerkezete és működése közötti összefüggéseket, klasszikus struktúra-funkció analízist végeztünk, melynek keretében a rendelkezésünkre álló vad típusú és módosított szerkezetű rekombináns PXDN konstruktok viselkedését különböző tesztrendszerekben hasonlítottuk össze.

A PXDN szekréciójához szükséges molekularészletek felderítésének céljából a sejttenyésztő médiumban vizsgáltuk a heterológ expressziós rendszerben kifejezett rekombináns fehérjék megjelenését, melyek minden egyéb szerkezeti jellemzőjüktől függetlenül detektálhatóak voltak a sejtek felülúszójában, ha N-terminális végükön megőriztük az eredeti PXDN szekvencia első 26 aminosavából álló peptidszakaszt.

Predikciós szoftverek elemzése alapján ez a régió erős szekréciós szignál szekvenciaként irányítja a PXDN-t az endoplazmás retikulumon és szekréciós vezikulákon keresztül a

105

sejten kívüli kompartmentbe. A PXDN szekréciójának vizsgálatára választott kísérleti felállásban csak az apikális irányú fehérjetranszportot detektáltuk, de feltételezhetően a bazolaterális membránon keresztüli szekréciónak is szükséges és elégséges feltétele az N-terminális szignál peptid jelenléte. A PXDN apikális irányú szekréciójának lehetősége polarizált sejttípusokban in vivo körülmények között is lényeges kérdés lehet. Egy korábbi közleményében a PXDN-t vaszkuláris peroxidáz 1-ként (VPO1) azonosító munkacsoport feltehetően az érendotélből származó, enzimatikusan aktív PXDN monomereket mutatott ki humán, egér és borjú vérplazmában,⁸⁶ aminek később mind lehetséges antimikrobiális hatását, mind a plazmalipidek oxidatív módosításában játszott potenciális szerepét felvetette,¹⁰¹ laborunk azonban már a kiindulási megfigyelést sem tudta megerősíteni. A szekréció iránya befolyásolhatja az ECM fehérjéire gyakorta jellemző és működésüket alapvetően befolyásoló esetleges poszttranszlációs fehérjeprocesszálási lépések lehetőségét, hiszen az azokat kivitelező enzimek, többek között a limitált proteolízist végző proprotein konvertázok egy része eltérő megoszlást mutat a polarizált sejtek apikális és bazolaterális membránjában.^183-185

Habár munkacsoportunk érdeklődésének középpontjában elsősorban a PXDN kollagén IV-gyel és ezidáig ismeretlen fiziológiás szubsztrátjaival kialakított interakcióinak felderítése áll, a fehérje biokémiai jellegzetességeit tárgyaló közleményeknek köszönhetően számos, különböző kémiai tulajdonságokkal bíró molekula irányában mutatott in vitro peroxidázaktivitásáról rendelkezünk információval.^44,76,81 Vizsgálatunkhoz mi a H2O2 és aktív peroxidáz jelenlétében fluoreszcens oxidációs termékké alakuló Amplex Red peroxidáz szubsztrátot választottuk. A folyamatban keletkező rezorufint érzékeny fluorimetriás méréssel detektáltuk, így tájékoztató képet kaptunk az egyes rekombináns konstruktok katalitikus aktivitásáról. A PXDNL aminosavsorrendjében a többi hem-peroxidáz hemkötéséért felelős konzervált reziduumok helyén található aminosavakat a PXDN szekvenciájába átültetve enzimaktivitás-hiányos mutánst nyertünk, ami indirekten igazolta a természetesen kialakult mutációk oki szerepét a PXDNL peroxidázaktivitásának elvesztésében. A mérés során a trimer és monomer PXDN forma esetében kapott megegyező fluoreszcenciaértékek arra utaltak, hogy a komplex negyedleges szerkezet nem befolyásolta a fehérje peroxidáz doménjének hozzáférését a kisméretű mesterséges szubsztráthoz. Amíg a C-terminális vWF C domén hiánya nem módosította a PXDN in

106

vitro enzimaktivitását, a peroxidáz doméntől N-terminálisan elhelyezkedő molekularészleteké megszüntette azt. Az utóbbi rekombináns konstrukt létrehozásához a PXDN korábban leírt rövid izoformájának tanulmányozása során nyert cDNS-t használtuk fel,⁷⁷ amelynek 5’ vége egybeesik a peroxidáz domént kódoló DNS szekvencia kezdeti szakaszával. Feltételezéseink szerint a konstrukt hiányzó katalitikus aktivitásának hátterében az átíródó protein hibás feltekeredése állhat, ami az N-terminális irányban található linker régió jelentőségére utal a domén megfelelő szerkezetének kialakítása során. A rövid PXDN izoformát leíró közleményben a fehérje apoptózis során megnövekedő expressziójának a folyamatra szintén jellemző oxidatív stressz kialakításában tulajdonítottak szerepet,⁷⁷ ami a rekombináns fehérje hiányzó peroxidázaktivitását kimutató eredményeink fényében megkérdőjelezhetőnek tűnik. Ezt a konstruktot a harmadlagos szerkezet feltételezett anomáliája miatt több funkcionális assay-ben nem teszteltük, emiatt azonban a peroxidáz doméntől N-terminálisan elhelyezkedő molekulafél kollagén IV keresztkötést és lokalizációt befolyásoló szerepét nem tudtuk felderíteni. Mivel az itt található domének fontos szerepet játszhatnak a PXDN ezidáig ismeretlen molekulapartnereihez, azon belül is esetleges sejtfelszíni receptoraihoz történő kapcsolódásában, a továbbiakban megkerülhetetlen feladat lesz új, az LRR és Ig C2 domének külön-külön delécióját hordozó, illetve a peroxidáz domént megelőző linker régiót még tartalmazó N-terminálisan trunkált rekombináns PXDN forma klónozása és bemutatott tesztrendszereinkben történő szisztematikus vizsgálata.

Az ismert fiziológiás működést modellező kollagén IV keresztkötési vizsgálatban PXDN-hiányos MEF sejteket használtunk fel, amelyek a génkiütés következtében hiányzó fehérje kivételével a kollagén IV hálózat szintéziséhez szükséges összes molekuláris résztvevővel rendelkeznek. A nehezen transzfektálható primer sejtekbe sikerült hatékonyan bejuttatnunk a rekombináns PXDN konstruktokat, majd az endogén PXDN vizsgálata során is alkalmazott protokoll szerinti hipotóniás lízist és kollagenáz enzimmel történő emésztést követően a kollagén IV NC1 doménjeit felismerő érzékeny antitesttel detektáltuk a keresztkötött dimerek megjelenését. Az enzimaktivitás-hiányos PXDN mutáns funkciómentő „rescue” kísérletekben tapasztalt hatástalansága az endogén fehérje esetében phloroglucinol peroxidáz-gátlószer alkalmazásával kapott eredmény új megerősítését is jelentette, mely szerint a kollagén IV keresztkötéshez az emlős PXDN enzimaktivitása elengedhetetlen tényező. Az N-terminálisan trunkált konstruktot az

107

Amplex Red peroxidáz mérésben kimutatott hiányzó enzimaktivitása miatt ebben a felállásban nem teszteltük, a vWF C doménhiányos fehérje azonban a vad típusú rekombináns formával azonos hatékonysággal állította vissza az NC1 domének vad típusú MEF sejtekben tapasztalt keresztkötöttségi mintázatát. A monomer szerkezetű PXDN ugyan megtartotta kollagén IV keresztkötési képességét, a másik két hatékony konstrukthoz viszonyítva azonban konzisztensen kisebb mennyiségű NC1 dimer kialakulását katalizálta. Ennek hátterében a két konstrukt kétféle heterológ expressziós rendszerben is megerősített lokalizációbeli különbségének oki szerepét feltételeztük. A vad típusú fehérje a tranziensen transzfektált Cos7 és MEF sejtek esetében is kettős, az endoplazmás retikulum mellett membrán menti extracelluláris struktúrákra is kiterjedő elhelyezkedést mutatott, amíg a monomer forma esetében az utóbbi megjelenés nem volt megfigyelhető.

Amíg az oligomer forma kialakulása sem a fehérje szekrécióját, sem in vitro peroxidázaktivitását nem befolyásolta, az előzőeknél jóval összetettebb kollagén IV keresztkötési folyamat optimális hatékonyságához elengedhetetlennek bizonyult a PXDN trimerképzése, aminek részben magyarázatául szolgálhat a fehérje sejtfelszíni asszociációjának az intakt negyedleges szerkezet megtartottságával mutatott összefüggése. A NC1 domének közötti szulfiliminkötések létrehozásához a PXDN homotrimer és a kollagén IV protomerek megfelelő pozicionálásán kívül Br^- és H2O2

jelenléte is szükséges. A keresztkötési reakció Br^- igényének mértékéről, illetve az ion sejten kívüli térben való megoszlásáról – részben a nyomelem biológiai jelentőségének nemrégiben történt felismerése okán – egyelőre kevés ismerettel rendelkezünk, bár a közelmúltban publikált adatok alapján az ion valószínűleg a szövetek nagy hányadában megjelenik.¹⁸⁶ Az ezidáig tisztázatlan forrásból származó H2O2 elérhetősége a katalitikus folyamat szempontjából meghatározó jelentőségű lehet. A H2O2 extracelluláris térben történő termelődéséért több különböző enzimfehérje, köztük egyes NADPH-oxidázok működése is felelőssé tehető, azonban a sejtek metabolizmusának melléktermékeként intracellulárisan keletkező ROS szabályozatlan kicsorgása is hozzájárul a sejten kívüli tér H2O2 tartalmához.^7,28 A kollagén IV keresztkötésnek a bazális membrán stabilizálásán túl az ECM-ből kiinduló szignalizációs útvonalak modulálását is magában foglaló, összetett biológiai jelentősége alapján feltételezhető, hogy az térben és időben is precízen regulált folyamat, amelynek követelményeit egy szabályozott H2O2 forrás feltehetően jobban

108

kielégítené. Az állati hem-peroxidáz család egyéb tagjainak esetében szoros funkcionális együttműködés igazolható bizonyos NADPH-oxidázokkal, ami felveti az enzimcsalád képviselőinek potenciális szerepét a PXDN működéséhez szükséges oxigéntartalmú intermedierek előállításában. Habár a PXDN ubikviter szöveti megjelenése⁸⁰ egy szintén általános előfordulású ROS forrást feltételez, az egyes NADPH-oxidázok expressziós mintázatával kapcsolatban napi szinten változó ismereteink²⁹ alapján a PXDN-nel való funkcionális kapcsolatuk nem zárható ki pusztán elméleti alapon, így a kérdés genetikai kontrollokkal történő részletes vizsgálata munkacsoportunk további kísérleteinek fontos szegmensét jelenti.

Eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy a korábban nem ismert, sejtfelszínen megjelenő, PXDN-ben gazdag struktúrák a kollagén IV keresztkötés „forró pontjaiként” a folyamat fiziológiás helyét jelentik, melyek a H2O2 ezidáig ismeretlen, de minden bizonnyal sejtekhez köthető forrásához kapcsolhatják a reakció további résztvevőit. A rekombináns PXDN esetében pontszerűen festődő képletek emellett adhezív funkciót is betölthetnek, amire a peroxidázaktivitás-hiányos mutáns konstruktunk, valamint a PXDNL rekombináns formájának azonos elhelyezkedése is utalhat. A vad típusú rekombináns PXDN sejtfelszíni lokalizációjának igazolását két különböző antitesttel is elvégeztük, azonban mind a PXDN-specifikus poliklonális nyúl, mind a V5-öt felismerő monoklonális egér antitest a fehérjekonstrukt C-terminális szegmensét ismeri fel. Hogy az említett régió korlátozott hozzáférhetősége vagy esetleges processzálódása ne vezethessen minket hibás következtetésekre az egyes rekombináns konstruktok lokalizációjának értékelése során, a későbbiekben a PXDN más pozíciójában található epitóp kimutatásával is érdemes lehet megerősítenünk a kapott eredményeket.

Az endogén PXDN vizsgálatával, valamint a rekombináns forma struktúra-funkció analízisével nyert eredményeink alapján alkottuk meg a fehérje kollagén IV keresztkötési működéséről felállított modellünket, melyet a 38. ábra mutat be. A PXDN intakt negyedleges struktúrájának és fiziológiás működésének szoros kapcsoltsága felveti annak elméleti lehetőségét, hogy a fehérje oligomerizációját megzavaró szerkezeti módosulások annak definitív degradációja nélkül is könnyen vezethetnek a NC1 keresztkötési reakció deficitjéhez vagy más, a homotrimer PXDN ezidáig ismeretlen fehérjepartnereinek közreműködésével kialakuló funkcionális következményekhez.

Munkánk, bár sok lényeges és ezidáig nem ismert részletet fedett fel a PXDN

109

működésével kapcsolatban, jelen tudásunk mellett sem tekinthető teljesnek.

Feltételezhető, hogy az ECM más komponensei is módosulhatnak a PXDN katalitikus működése során, valamint az adhéziós doménekkel kialakított molekuláris interakcióknak is fontos szerepük lehet a fehérje funkciójának szabályozásában, melyeket az ismertetett technikai okokból egyelőre csak igen kis részben sikerült feltérképeznünk.

Vizsgálatunk egyik igen érdekes eredménye volt, hogy a ciszteinekben gazdag vWF C domén egyetlen tesztelt funkcióban sem bírt érdemi jelentőséggel, ami arra utal, hogy ez a molekularészlet eltérő folyamatok mediálásában vehet részt. Ezek felderítése a domén jellegéből adódó potenciális biológiai szerepek ismeretében érdekes kérdés. A PXDN ECM fehérjék többségére nem jellemző endoplazmás retikulumban megfigyelt dúsulása az erősen oxidatív közeget képviselő sejtorganellumra lokalizált enzimhatások lehetőségét is felveti, amelyek vizsgálatában a rekombináns PXDN ER-retenciós szignállal ellátott formájának létrehozása, majd annak segítségével rezidens molekulapartnerek azonosítása nyújthat segítséget.

38. ábra: A PXDN trimerizációjának és kollagén IV keresztkötési reakciójának modellje. A rekombináns konstruktok vizsgálata alapján felállított modellünk szerint a PXDN 736. és 1315. pozícióban található cisztein reziduumain keresztül homotrimer formát alakít ki az endoplazmás retikulum lumenében, majd szekrécióját követően a kollagén IV keresztkötési reakció helyét biztosító sejtfelszíni adherens struktúrákba rendeződik.

PXDN lokalizáció

endoplazmás retikulum sejtfelszíni adherens struktúrák

homotrimerképzés konzervált ciszteineken keresztül kollagén IV keresztkötés

110