Diffusion MRI Measured White Matter Microstructure as a Biomarker of Neurodegeneration in preclinical Huntington’s Disease.
Kincses ZT, Szabó N, Tóth E, Zádori D, Faragó P, Németh D, Janacsek K, Babos M, Klivényi P, Vécsei L
Ideggyogy Sz. 2013 Nov 30;66(11-12):399-405
4.6.1. Bevezetés
A Huntington-kór gyógyíthatatlan, trinukleotid expanzióval járó neurodegenera-tív betegség. A CAG repeat-ek száma meghatározza a betegség lefolyását [Quarrell et al., 2007]. Évtizedekkel a motoros és kognitív tünetek megjelenése előtt a neuro-degeneráció már folyamatban van, ennek jeleként az agy strukturális elváltozásai is észlelhetőek [Della Nave et al., 2010, Rosas et al., 2006]. Elméletileg egy potenciális neuroprotektív kezelés indításának ideális ideje ezen tünetmentes időszakban lenne.
A kezelés hatékonyságának monitorizálására in vivo biomarkerek feltétlenül szüksége-sek [Paulsen et al., 2010,Puri et al., 2008,Tabrizi et al., 2011]. Több neurokémiai [Hu et al., 2011, Long et al., 2012] kognitív [Papp et al., 2011, Vaccarino et al., 2011] és imaging [Majid et al., 2011,Puri et al., 2008] marker lehetséges szerepe felmerült. Az egyik ilyen markert, mely klinikai vizsgálatokban is surrogate marker-ként szerepel-het a képalkotó módszerek szolgáltatják [Paulsen et al., 2010,Puri et al., 2008,Tabrizi et al., 2011].
A voxel-alapú morphometria vizsgálatok a betegség csaknem összes stádiumában atrophiát talált. A teljes szürkeállományi térfogat csökken Huntington-kórban [Bo-hanna et al., 2011, Paulsen et al., 2010]. Longitudinális MRI vizsgálatok azt mutat-ták, hogy a Huntington-betegek atrophiarátája gyorsabb mint az egészséges kontrol-loké [Aylward et al., 2011, Tabrizi et al., 2011]. Egy VBM analízis a striatum dorso-ventralis atrophiáját írta le [Gárdián and Vécsei, 2004] ami hasonlít a szövettani vizs-gálatok eredményeihez [Gutekunst et al., 1999]. A striatalis atrophia olyan marker, amit már több tanulmány is leírt Huntington-kórban [Douaud et al., 2006,Kassubek et al., 2004, Mühlau et al., 2007a, Paulsen et al., 2010, Reading et al., 2005]. Az is ismert, hogy a magasabb CAG repeat szám gyorsabb atrophiával van összefüggés-ben [Henley et al., 2009b,Ruocco et al., 2006].
A fehérállományi dezintegrációt is több tanulmány vizsgálta Huntington-kórban, különböző módszerekkel. A corpus callosumban regionálisan specifikus FA csökke-nést találtak preszimptomatikus Huntington-kórban [Rosas et al., 2006, Rosas et al., 2010]. A symptomás betegekben ezek az elváltozások sokkal kifejezettebbek voltak.
Azt is megmutatták, hogy az FA változása már egy éves perióduson belül is mérhető nagyságú [Weaver et al., 2009]. Egy VBM analízis az FA diffúz csökkenését találta Huntington-betegek fehérállományában [Reading et al., 2005]. A közelmúltban egy support vector machine multivariáns analízis regionálisan specifikus FA eltéréseket talált preklinikai Huntington-kóros betegek és egészséges kontrollok között [Klöppel et al., 2008].
A fenti vizsgálatok elvitathatatlan érdeme ellenére a specificitáson még javítani kell. A ROI és traktográfia alapú vizsgálatoknak a térbeli lokalizációs ereje alacsony.
A VBM stílusú analízisek gyengesége a regisztrációs hibákban áll, mely a fehérállo-mányban különösen nagy lehet. A pálya alapú térbeli statisztikai módszer (TBSS) a közelmúltban vált elérhetővé a neurodegenerációhoz kötődő fehérállományi dezinteg-ráció vizsgálatához. A módszer a regisztdezinteg-rációs hibák lehetőségét csökkenti azzal, hogy a fehérállományi rostok közepét vizsgálja, mely a gyakorlatban a lokális FA maximu-mot jelenti [Smith et al., 2006]. Ezzel a módszerrel már több kutatócsoport is talált diffúziós eltéréseket preszimptomatikus és szimptomatikus Huntington-kórban [Bo-hanna et al., 2011, Della Nave et al., 2010, Stoffers et al., 2010, Weaver et al., 2009].
Mindazonáltal egyik tanulmány sem talált összefüggést a neurodegenerációt leíró pa-raméterekkel. Mivel Huntington-kórban a neurodegeneráció tempója függ a CAG repeat számtól és attól, hogy a neuronok mióta vannak kitéve neurotoxikus hatás-nak [Gárdián and Vécsei, 2004], a neurodegenerációt mérő paraméter lehet a CAG repeat szám és az életkor egyszerű szorzata.
Vizsgálatunkban azt tűztük ki célul, hogy Huntington-kór fehérállományi dezin-tegrációját vizsgáljuk diffúzió tenzor képalkotással. Azt szerettük volna megvizsgálni, hogy a mikrostrukturális eltérések hogyan korrelálnak a neurodegenerációval, melyet a CAG repeat szám és az életkor szorzatával jellemeztünk.
4.6.2. Módszertan
4.6.2.1. Alanyok
A vizsgálatban hét preszimptomatikus, mutációt hordozó beteg és 10 kontroll sze-mély vett részt. A betegeknek nem volt motoros tünetük (ezt a Unified Huntington
Beteg Kontroll
N 7 10
Életkor (átlag±SD) 36.57±10.33 37.10±9.23
Nem (férfi) 4 4
CAG átlag (range) 42.29 (37-50) N.A.
YTO* átlag (range) 19.81 (9.7-35.53) N.A.
UHDRS 0 N.A.
4.2. táblázat. Az alanyok demográfiai adatai és klinikai jellemzői. UHDRS: Unified Hung-ington Disease Rating Scale, YTO: Years to Onset: a tünetek várható megjelenése előtti idő [Langbehn et al., 2004].
Teszt Átlag Terjedelem
MMSE 29.5 28-30
Digit Span 6.57 5-8
Backward Digit Span 4.86 3-7 Listening Span 3.38 2.66-5 Semantic fluency 25 20-31.5
4.3. táblázat. A betegek kognitív teljesítménye. Minden érték a normál tartományban volt.
Disease Rating Scale-en mértük) (4.2 táblázat). A betegek kognitív teljesítményét a MMSE teszttel, a Digit Span teszttel, a backward Digit Span teszttel, Listening Span Task teszttel és Semantic Fluency teszttel vizsgáltuk (4.3 táblázat). Ezek alapján a betegek nem szenvedtek lényeges kognitív diszfunkcióban. A betegek nem szedtek rendszeresen gyógyszert. A kontrolloknak nem volt semmilyen neurológiai vagy pszi-chiátriai betegségük. A vizsgálatban résztvevők elmondásuk szerint nem fogyasztottak rendszeresen nagyobb mennyiségű alkoholt és drogokat sem használtak. A vizsgálatot a helyi etikai bizottság engedélyezte és az alanyok aláírták a beleegyező nyilatkozatot (etikai engedély szám: 86/2009).
4.6.2.2. Képalkotás
Az MR felvételek egy 1.5 T GE Signa Excite HDxt MR készülékkel készültek. Min-den résztvevőről 3D FSPGR felvételek (TE: 4.1 ms, TR: 10.276 ms, matrix: 256x256, FOV: 25x25 cm, flip angle: 15◦, “in-plane”-felbontás: 1x1 mm, szelet vastagság: 1 mm), FLAIR felvétel (TE: 4.1 ms, TR: 10.276 ms, matrix: 256x256, FOV: 25x25 cm, Dőlésszög: 15 fok, “in-plane”-felbontás: 1x1 mm, szeletvastagság: 1 mm) és 60 irányú diffúzió súlyozott felvétel 6 nem diffúzió súlyozott referencia felvétellel (TE: 93.8 ms, TR: 16000 ms, matrix: 96x96, FOV: 23x23 cm, flip angle: 90◦, “in-plane”-felbontás:
2.4x2.4 mm szeletvastagság: 2.4 mm, b: 1000 s/mm2, NEX: 2, ASSET) készült.
4.6.2.3. A diffúziós felvételek értékelése
A diffúziós felvételekben először korrigáltuk az eddy-áramokból származó műter-mékeket egy 12 szabadsági fokú lineáris regisztrációval az első nem-diffúziósúlyozott felvételhez [Jenkinson and Smith, 2001]. A diffúziós tenzorokat mindenegyes voxelre az FSL szoftvercsomag diffúziós programjával számítottuk ki (FSL v. 4.0; www.fmrib.
ox.ac.uk/fsl, [Smith et al., 2004]). Az egész agyra voxelenként kiszámítottuk az FA-t az MD-t, a fő diffúziós iránnyal parallel (λ1) és az arra merőleges ((λ2+λ3)/2) diffúziót.
A regisztrációs hibák elkerülésének érdekében a TBSS algoritmust használtuk ( [Smith et al., 2006] és A.4.7 fejezet): Minden alany FA adatát egy közös térbe re-gisztráltuk (FMRIB58_FA) egy nemlineáris regisztrációval [Andersson et al., 2007], ami egy b-spline reprezentációját használja a warp fieldnek [Rueckert et al., 1999].
Az átlagos FA képet küszöbölésével (FA=0,2) egy skeletont hoztunk létre, mely a pályarendszerek közepét reprezentálja. Erre az átlagos skeletonra projektáltuk az ala-nyok FA adatát. Az így létrejött skeletonizált, és így pontosan egymáshoz regisztrált adatokon végeztük el a voxelenkénti statisztikát. A statisztikai elemzéshez standard GLM módszert használtunk. A model a csoport-hovatartozást valamint a neurode-generációs pont (CAG repeat szám és az életkor szorzata) kódolta. A statisztikai következtetést permutációs teszttel végeztük (5000 permutáció) ahogy azt az FSL programcsomagban kódolták [Nichols and Holmes, 2002]. A küszöbölésre a TFCE módszert használtuk [Smith and Nichols, 2009], küszöbnek p<0,05-öt választottunk, az eredményeket a többszörös összehasonlításokra korrigáltuk. Hasonló analízist vé-geztünk az átlagos, axialis és radialis diffúzivitásra.
4.6.3. Eredmények
A fehérállományi rostrendszerek közepén a voxelenkénti összehasonlítás csökkent FA-t talált a corpus callosumban (p<0,003, korrigált, maximum t-érték = 5,15, stan-dard tér koordináták: x=18mm, y=-16mm, z=36mm) preszimptomatikus betegek ese-tében. Magasabb FA-t nem találtunk. Az átlagos diffúzivitás és a radialis diffúzivitás magasabb volt a mutációt hordozó alanyokban gyakorlatilag mindenütt a fehérállo-mányban (p<0,04, korrigált). Az axialis diffúzivitás szintén magasabb volt bal oldalon a splenium és genu corporis callosiban, a capsula internában és externában, a radiatio thalamicában és a temporalis lebenyi fehérállományban (p<0,02, korrigált).
z=37mm z=27mm z=17mm z=7mm z=-3mm
FA 5.15
0
L1 5.02
0
(L2+L3)/2 6.00
0 6.01
0
MD
4.16. ábra. A preklinikai Huntington-betegekben észlelhető fehérállományi diffúziós eltérések.
Az FA különbségeket az első sorban ábrázoltuk. A különbségeket kivastagítottuk a jobb lát-hatóságért (zöld) és a megfelelő t-értékeket erre vetítettük rá (piros-sárga skála). A második sorban az axialis diffúzivitást, a harmadik sorban a radialis diffúzivitást ábrázoltuk. Az utolsó sor az átlagos diffúzivitás eltéréseit mutatja. A különbségeket p<0,05 szinten küszöböltük. A színskálák t-értékeket jelölnek.
Controls preHD
4.17. ábra. A corpus callosum diffúziós paraméterei a két csoportban. Az átlagos diffúziós pa-ramétereket a skeleton középső sagittalis síkjának megfelelően a corpus callosumban számol-tuk. A különbségek a két csoport között szignifikánsak voltak az FA és az átlagos diffúzivitás esetében (p<0,001, korrigált).
A kumulatív neurodegenerációs pont, melyet a CAG repeat szám és az életkor szorzataként számoltunk korrelációt mutatott az FA értékkel a bal frontalis fehérál-lományban a precentralis gyrusban, a superior corona radiatában és a capsula ex-ternában p<0,04, korrigált). Az átlagos diffúzivitás nem mutatott korrelációt a ne-urodegenerációs ponttal (p>0,1). A CAG repeat számmal nem találtunk korrelációt (p>0.05).
4.6.4. Megbeszélés
Vizsgálatunkban a fehérállomány mikrostruktúráját jellemző diffúziós paraméte-rek eltéréseit találtuk tünetmentes Huntington-kóros betegekben. A neurodegeneráció fokát leíró pontszám (CAG repeat szám és az életkor szorzata) korrelált a bal frontalis fehérállomány mikrostruktúráját leíró diffúziós paraméterekkel.
A fehérállományban a víz anizotropikus diffúzióját meghatározó ultrastruktúra nem pontosan ismert. Legvalószínűbb, hogy a periaxonalis myelinhüvely valamint az intraaxonalis struktúrák (pl. neurofilamentek) és az axonmembrán lehet felelős a víz diffúziójának korlátozásáért. Az általunk vizsgált diffúziós paraméterek közül a FA bár szenzitív, de szövettani szempontból nem specifikus marker. A longitudinális diffúzivitás változását a axonok számával hozzák összefüggésbe, míg a perpendicularis diffúzivitás feltehetőleg a myelinhüvely állapotát jellemzi [Kim et al., 2006b,Sun et al., 2006].
Megváltozott diffúziós paramétereket (mint csökkent FA megnövekedett axialis és radialis diffúzivitás) gyakran mérnek Huntington-kórban. A betegség különböző sza-kaszában mért különböző kiterjedésű elváltozások oka leginkább a különböző mód-szertanban rejlik. Mascalchi a mutációt hordozók vizsgálatakor emelkedett ADC-t mért a striatumban és a periventricularis fehérállományban [Mascalchi et al., 2004].
Egy ezt követő vizsgálat megváltozott diffúziós paramétereket (csökkent FA és meg-növekedett radialis és axialis diffúzivitás) talált a corpus callosum ROI-ban. Ez utóbbi eredmények regionálisan és időben is specifikusak voltak és jól korreláltak a betegek motoros és kognitív teljesítményével [Rosas et al., 2006, Rosas et al., 2010, Sritharan et al., 2010, Weaver et al., 2009]. Egy VBM analízis, mely már nem csak az előre kijelölt területekre koncentrál, azt találta, hogy a fehérállományban kiterjedt elvál-tozások vannak [Reading et al., 2005]. Továbbfejlesztett módszertannal, a mi TBSS analízisünkhöz hasonlóan, Della Nave és Bohanna is megmutatta a fehérállományi dezintegráció valódi kiterjedését [Bohanna et al., 2011, Della Nave et al., 2010]. A
0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 1000
1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000
FA
CAGxAge
0.59
0
4.18. ábra. Az FA és a kumulatív neurodegenerációs pont korrelációja. A szignifikáns kor-relációkat kivastagítottuk (zöld), melyekre a megfelelő t-értékeket vetítettük (piros-sárga). A grafikonon az átlagos FA és a neurodegenerációs pont összefüggését ábrázolja.
nagyobb fehérállományi pályarendszerek, úgy mint a corpus callosum, capsula inter-na, capsula exterinter-na, radiatio thalamica és a frontalis occipitalis és parietalis régiókat összekötő hosszú asszociációs rostok mind érintettek voltak.
Az imaging biomarkereknek főleg a betegség kezdeti fázisában lehet szerepük, amikor tünetek még nem jelentkeznek. Egy ilyen marker potenciális neuroprotektív gyógyszerek hatásának utánkövetésében kaphat szerepet. Vizsgálatunkban megmu-tattuk, hogy a diffúziós paraméterek már a betegség korai fázisában, a klinikai vagy kognitív tünetek megjelenése előtt kiterjedt eltéréseket mutatnak. Ezek az eredmé-nyek beleillenek az irodalomban eddig közölt eredméeredmé-nyek sorába: Rosas csökkent FA-t talált a corpus callosumban, a capsula internában és ezek a preklinikai stádiumban ki-sebbek voltak, mint a tüneteket mutató betegeknél [Rosas et al., 2006]. Egy következő vizsgálatban a szerzők azt is megmutatták, hogy a corpus callosum területén talált eltérések annál enyhébbek, minél távolabb van a beteg a tünetek várható kezdeté-től [Rosas et al., 2010]. Egy VBM analízis is megmutatta, hogy a preszimptomatikus betegek esetében is van fehérállományi FA csökkenés a centralis és frontalis területe-ken [Reading et al., 2005]. Support vector machine módszerrel tünetmentes betegek esetében szintén FA csökkenést találtak a frontalis corpus callosumban [Klöppel et al., 2008]. TBSS módszerrel Waever és kollégái valamint Stoffers és kollégái találtak csök-kent FA-t tünetmentes betegekben, hasonló elrendeződésben, mint a korábbi vizsgála-tok [Stoffers et al., 2010,Weaver et al., 2009]. Ami talán még fontosabb, hogy a szerzők egy év utánkövetés során is találtak FA csökkenést a frontalis fehérállományban [We-aver et al., 2009]. Bár a tünetmentes betegek esetén az FA változás kissé lassabb volt, mint a tünetes betegek esetében, a különbség nem volt szignifikáns. Ez különösen ak-kor érdekes, ha tudjuk, hogy a nucleus caudatus és a putamen atrophiája 9-11 évvel a tünetek kialalkulása előtt felgyorsul [Aylward et al., 2004]. Weaver tanulmányában a tünetek kialakulásáig számított idő átlaga 13 év volt, ami a mi vizsgálatunkban még több (19.81±10.24 év). Ezek az eredmények talán azt jelezhetik, hogy a diffúziós paraméterek az atrophiánál is szenzitívebb biomarkerek lehetnek.
Vizsgálatunkban a CAG repeat szám és az életkor egyszerű szorzatát használtuk a neurodegeneráció leírására. Két alternatív lehetőséggel szemben választottuk ezt a módszert: (i) CAG repeat szám, (ii) a tünetek megjelenéséig számított idő (years-to-onset). A Huntington pathomechanizmusának egyik lehetséges háttere, hogy a mutált IT15 gén és a polyglutamine expanzió a huntingtin protein toxikus hatását hozza lét-re [Gárdián and Vécsei, 2004]. Egy kelét-resztmetszeti vizsgálatban a kumulatív neuro-degenerációt lehet mérni, viszont a CAG repeat szám önmagában csak a progresszió
sebességét szabhatja meg és ezt egy longitudinális vizsgálatban lehetne jól mérni. Ta-lán ez lehet annak a magyarázata, hogy korábbi keresztmetszeti DTI tanulmányok nem találtak összefüggést a CAG repeat számmal [Bohanna et al., 2011, Della Nave et al., 2010,Klöppel et al., 2008,Reading et al., 2005,Stoffers et al., 2010]. Másik lehe-tőségként a tünetek megjelenéséig tartó időt (years-to-onset) lehetne használni. Ezzel az a gond, hogy több faktor is befolyásolhatja. Ismert, hogy a tünetek megjelenésének az idejét a CAG repeat szám határozza meg legnagyobbrészt, de ez is összességében csak a variabilitás 73%-ért felelős [Snell et al., 1993]. A maradék variabilitást további genetikai [Arning et al., 2010, Coppedè et al., 2010, Taherzadeh-Fard et al., 2010] és környezeti faktorok határozzák meg. Ezek közül vannak olyanok, melyek potenciálisan az agy struktúráját is megváltoztatják, míg mások feltehetőleg nincsenek rá hatás-sal. Ennek megfelelően azt gondoljuk, hogy van értelme a toxikus faktor erősségét és a hatás idejének hosszát figyelembe venni, amikor a kumulatív neurodegenerációt mérjük.