A pirokatechin-oxidáz enzim

O

O OH

OH 18

Az enzimkatalizált reakció mechanizmusát vizsgálva azt feltételezték,¹⁹ hogy a dioxigén molekula oxigén atomjainak beépülését követően, a szerves szubsztrátumban egy négytagú dioxetán gyűrű (18) keletkezik, melyből az O-O kötés homolitikus felhasadásával vezethető le a mukonsav (2) keletkezése (9).

(9)

2.2.2.2. A pirokatechin-oxidáz enzim

A pirokatechin-oxidáz az oxidoreduktázok csoportjába tartozó kétmagvú rézcentrummal rendelkező metalloenzim. A réztartalmú enzimeknek alapvetően három különböző csoportját szokás megkülönböztetni:³³ az első csoportot az aktív centrumukban egy rézatomot tartalmazó, ún. „kék rézcentrumú”, vagy „1-típusú” réz(II)-iont tartalmazó enzimek alkotják, funkciójukat tekintve elektron-transzfer reakciókat katalizálnak. A második csoportba soroljuk a „nem kék rézcentrumú” vagy „2-típusú” réz(II)-iont tartalmazó enzimeket, melyek szintén egy rézatomot tartalmaznak aktív centrumukban, de a réz mellett más fématom is jelen lehet a szerkezetben, ilyen például a Cu és Zn tartalmú szuperoxid-dizmutáz. Általában oxidáz és oxigenáz hatással rendelkező enzimek. Az utolsó csoportot a „3-típusú” réz(II)-iont tartalmazó enzimek alkotják, melyek kétmagvú rézcentrummal rendelkeznek. Általában oxigenáz/oxidáz aktivitással rendelkeznek, de dioxigénvivő szerepet is betölthetnek.³⁴ Az utolsó csoport három legfontosabb képviselője a hemocianin, a tirozináz és a pirokatechin-oxidáz enzimek.

A pirokatechin-oxidáz, a pirokatechinek (o-difenolok) oxidatív dehidrogéneződését katalizálja o-kinonokká, melléktermékként vizet, vagy hidrogén-peroxidot szolgáltatva (10). A fent említett reakciónak fontos szerepe van az orvosi diagnosztikában az adrenalin, noradrenalin, valamint a dopa kimutatásában.³⁵ A pirokatechin-oxidáz növényi szövetekben, rovarokban valamint egyes rákfélékben fordul elő. Az enzimkatalizált reakció termékeként képződő reaktív kinonok polimerizációjának következtében, barna színű melanin származékok keletkeznek, melyek a sérült növények barnás elszíneződését okozzák, így tartva távol a kártevőket a sérült részektől.³⁶

OH OH 1

+ O₂

O O 19

+ H₂O vagy H₂O₂ (10)

A pirokatechin-oxidázokat 1937-es első elkülönítésük óta³⁷ számos növényből és gyümölcsből (burgonya, spenót, alma, szőlő, licsi) sikerült kinyerni. A kivont enzim tisztasága az izoenzimek nagy száma miatt nem volt minden esetben kielégítő. Krebs és munkatársainak sikerült a burgonyából kivont enzim röntgendiffrackiós szerkezetét elsőként meghatározniuk (3. ábra).³⁸

A réz-centrum spektroszkópiai sajátságai

Alapállapotban (met-forma) az aktív centrumban található {Cu(II)-Cu(II)}

fémionok közötti kis távolság (2,90 Å) következményeként antiferromágneses kölcsönhatás alaukl ki a rézcentrumban (-2J > 600 cm^-1) ami ESR inaktívitást eredményez (S = 0). UV-Vis spektrumukban 290 és 690 nm-nél találtak jellemző abszorpciós sávokat, utóbbi a Cu(II)-ion d-d átmeneteihez rendelhető.

A kék színű oxi-forma {Cu(II)-O22--Cu(II)} dioxigén vagy hidrogén-peroxid megkötődésével alakul ki a met-formából. Az oxi-forma látható-ultraibolya spektroszkópiás vizsgálatakor két jellegzetes elnyelési sávot találtak egy intenzív sávot 343 (ε = 6500 cm^-1M^-1) és egy gyengébb intenzitásút 580 nm-nél (ε = 450 cm^-1M^-1).³⁹ Az előbbi O22- (πσ*) → Cu(II) töltésátviteli sávhoz, míg az utóbbi a O22- (πν*) → Cu(II) átmenethez rendelhető. A pirokatechin-oxidáz enzim oxi-formájának Raman-spektrumában 749 cm^-1-nél jelentkező sáv a peroxo-csoport µ-η²-η² hídligandumként történő koordinációjára utal.

Az enzim röntgenszerkezete

Az enzim met-formájának molekulatömege 39 kDa, ellipszoid alakú, mérete hozzávetőlegesen 55 x 45 x 45 Å. A fehérje másodlagos szerkezetét hat α-hélix építi fel, amelyek által kialakított kavitásban helyezkedik el az aktív centrum (3. ábra). Az aktív centrumban található Cu(II)-ionok mindegyikéhez három hisztidin molekula koordinálódik nitrogén donoratomokkal mint ahogy az az EXAFS mérések alapján várható volt.

A szerkezet különlegessége, hogy kovalens tioéter-kötéssel kapcsolódik egy cisztein

molekula (Cys92) az egyik réz koordinációs övezetében található hisztidin molekulához (His109). Hasonló jelenséget más oxidáz enzim-szerkezetekben is találtak (hemocianin, tirozináz),^40,41,42 de ez idáig nem sikerült ennek a kötésnek a szerepét tisztázni, feltehetőleg a katalitikus aktivitásban nincsen komoly szerepe.

3. ábra. A pirokatechin-oxidáz enzim röntgenszerkezete.

A met-forma jellemzése

Az enzim alapállapotában a két réz(II)-ion 2,90 Å távolságra van egymástól, koordinációs övezetükben egyenként három hisztidin molekula koordinálódik, a két réz(II)-iont hídligandumként egy hidroxil-csoport kapcsolja össze (4. ábra). Íly módon mindegyik réz körül trigonális bipiramisos koordinációs övezet alakul ki.

4. ábra. A met-forma aktív centrumában kialakuló koordinációs övezet.

A deoxi-forma jellemzése

A deoxi-forma az enzim redukciójának következtében alakul ki, mindkét rézion +1-es oxidációs állapotban van. A Cu(I)-ionok koordinációs szférája a met-formához viszonyítva megváltozik, a réz-ionok közötti távolság megnő (4,40 Å) és megváltozik a koordinációs szám is. Az egyik réz (CuA) körül három hisztidin és egy víz molekula található torzult trigonális piramisos koordinációs szférát kialakítva, míg a másik réz(I)-ionhoz (CuB) három hisztidin molekula kapcsolódik síknégyzetes geometriát teremtve.

Inhibitor komplex

Az enzim-szubsztrátum komplex kialakulásának modellezése érdekében Krebsék az enzim oxi-formáját fenil-tiokarbaziddal (PTU) reagáltatták, majd vizsgálták a kialakult komplex szerkezetét.

5. ábra. Az aktív centrum konformációváltozása PTU hatására.

Az aktív centrumban jelentős változások mentek végbe. A koordinálódó PTU hatására, a met-forma hidroxo-hídligandumja kicserélődött a PTU kénatomjával aminek következtében a Cu(II)-Cu(II) távolság 4,20 Å-re növekedett meg. A rézionok koordinációs szférájában nem történt változás az alapállapothoz viszonyítva, de az aktív centrum konformációs változásokon ment keresztül. Úgy tűnik, hogy a szubsztrátum aktív centrumhoz való hozzáférését, az itt elhelyezkedő F261 (fenil-alanin) aminosav aromás gyűrűjének elfordulása teszi lehetővé. A PTU koordinálódása során a F261 fenilgyűrűje és

a H244 (hisztidin) imidazolgyűrűje elfordul, így kölcsönhatás alakulhat ki az aminosavak és az inhibitor aromás gyűrűi között (5. ábra).

Az enzimkatalízis feltételezett mechanizmusa⁴⁰

A katalitikus reakció a szubsztrátum molekula és az oxidált met-forma közötti reakcióval indul. A keletkező enzim-szubsztrátum komplexben a pirokatechin molekula egyszeresen deprotonált formában kapcsolódik egyfogú ligandumként a CuB(II)-ionhoz (20).

Egy ezt követő redoxi lépésben a szubsztrátum kinonná oxidálódik, míg az enzim rézcentruma redukálódik (deoxi-forma). A katalitikus ciklus ezen lépését az támasztja alá, hogy a vizsgálatok során kinon keletkezése abban az esetben is kimutatható volt, ha a folyamatokat anaerob körülmények mellett vizsgálták, másfelől az enzim oxi-formáját csak H2O2 hozzáadására sikerült előállítani a met-formából és stabilitása sem volt nagy.

(11)

A PTU-val végzett kísérletek, valamint más modelleken elvégzett spektroszkópiás vizsgálatok alapján,³⁵ a dioxigén és a szubsztrátum egyidejű kötődését a rézcentrumhoz a deoxi-formából vezethetjük le. Az oxi-forma Raman spektroszkópiás vizsgálatai alapján valószínűsíthető, hogy a komplexben a dioxigén µ-η²-η² hídligandumként koordinálódik a rézionokhoz. A kialakuló terner komplexben (21) a szubsztrátum két elektront ad át a peroxidnak, megtörténik az O-O kötés felhasadása és végtermékként víz és o-benzokinon keletkeznek. A második szubsztrátum molekula ily módon bekövetkező oxidációját és a víz kihasadását követően a rézcentrum visszaalakul a met-formába, így újabb szubsztrátum átalakítására lesz képes egy következő katalitikus ciklusban (11).