A PACAP neuroprotektív hatása MSG indukálta retinadegenerációban

Rutin szövettani vizsgálatok

A retina hisztológiai értékelése azt mutatta, hogy az egyszeri MSG adás csak minimális, ezzel szemben a háromszoros és az ötszörös kezelések egyformán súlyos degenerációt idéztek elő. Mivel azonban az ötszöri kezelésnél igen nagy mortalitást tapasztaltunk (több, mint 50%-a az állatoknak elpusztult), ezért a későbbiekben csak a háromszori kezelést alkalmaztuk. A 3xMSG-kezelt állatok retinájának ILM-OLM távolsága megközelítőleg fele akkora volt (79,7±4,5μm), mint a kezeletlen állatokban mért távolság (163,7±5,4μm). A károsító hatások leginkább a retina belső rétegeit érintették. A MSG-kezelt állatoknál a fotoreceptor, a külső sejtes és rostos rétegben szignifikáns elváltozást nem találtunk, de a belső sejtes réteg és a ganglionsejtek rétege teljesen összeolvadt. Ezen rétegek vastagsága több mint felére csökkent, a köztük elhelyezkedő belső rostos réteg eltűnt. A kezelés hatására számos szöveti és sejtdegenerációt jelző elváltozás (szövethézagok, piknotikus sejtek) is megfigyelhető volt (III.3.1. ábra).

III.3.1. ábra. A retina szövettani képe egy reprezentatív kezeletlen (normál) (A) és egy 3x MSG-kezelt állat (B) retinájából. A nyilak degenerált struktúrákat mutatnak. Rövidítések: PE: photoreceptor réteg, OS:

outer segment, IS: inner segment (photoreceptorok külső és belső szegmense), ONL és INL: outer és inner nuclear layer (külső és belső magvas réteg), OPL és IPL: outer és inner plexiform layer (külső és belső plexiform réteg), GCL: ganglionsejtek rétege.

Az MSG kezelés mellett intravitreálisan 1pmol PACAP-pal kezelt állatok retinája nem különbözött a csak MSG-vel kezelt állatok retinájának szerkezetétől, a szisztémás

PACAP kezelés pedig csak kismértékű javulást eredményezett. Ezzel szemben a 100pmol dózisban adott lokális PACAP szignifikánsan csökkentette az MSG indukálta retina károsodást. A fent említett 3x alkalmazott MSG-kezeléssel egyidőben, egyszer, kétszer vagy háromszor 100pmol PACAP-pal kezeltük az állatok jobb szemét. Egyszeri PACAP kezelés hatására nem tapasztaltunk jelentős változást az MSG-vel kezelt retinához képest (III.3.2.A. ábra). A rétegek vastagsága nem változott, a fúzió okozta torzulás megmaradt, csupán néhány preparátumban figyeltünk meg enyhe javulást. Kétszer (III.3.2.B. ábra), illetve háromszor (III.3.2.C. ábra) alkalmazott PACAP szignifikánsan csökkentette az MSG-indukálta károsodást. A retina mindhárom belső rétege jól elkülönült egymástól, az IPL egyértelműen látható maradt, az INL megtartotta 2-4 sejtsorát. A belső rétegek szignifikánsan vastagabbak voltak, mint az MSG-kezelt állatoknál (III.3.2.D. ábra). A GCL-ben található sejtek száma a normál retinához volt viszonyítható (III.3.2.E. ábra).

III.3.2. ábra. Egyszeres (A), kétszeres (B), illetve háromszoros (C) PACAP hatása az MSG-indukálta retinadegenerációban. A retina egyes rétegeinek összehasonlítása (D) és a ganglionsejtek rétegében található sejtek száma/100 µm (E) normál kontroll, MSG, illetve MSG+PACAP-pal kezelt állatokon.

*P<0,05; **P<0,01 vs normál kontroll, ^#P<0,05 vs MSG kezelés. Aránymérték: 20µm.

A PACAP38 és a PACAP27, valamint a PACAP6-38 és a PACAP6-27 hatásának összehasonlítása MSG-okozta degenerációban

Kísérleteink során megállapítottuk, hogy a PACAP szervezetben előforduló rövidebb változata, a PACAP27 is retinoprotektív hatással rendelkezik. A PACAP antagonistái, a PACAP6-38 és PACAP6-27 pedig az MSG-okozta károsodást súlyosbították (III.3.3.

ábra). Az ONL-ben jóval több degenerált duzzadt sejtet, illetve több szövethézagot figyeltünk meg, mint a csak MSG-kezelt állatokban. Ezt a morfometriai analízis is alátámasztotta (Atlasz et al., 2009). Mindez arra utal, hogy a PACAP endogén körülmények között is fontos retinoprotektív hatást fejt ki károsító behatások esetén.

III.3.3. ábra. A retina szövettani képe reprezentatív normál kontroll (A), MSG-kezelt (B), MSG+PACAP38 (C), MSG+PACAP6-38 (D), MSG+PACAP27 (E) és MSG+PACAP6-27 (F) állatokból. Rövidítések: GCL:

ganglionsejt réteg, INL: belső magvas réteg, IPL: belső rostos réteg, ONL: külső magvas réteg, OPL: külső rostos réteg. Aránymérték: 20 µm.

Immunhisztokémiai vizsgálatok

Az OPL-ben elsősorban a fotoreceptor sejtek, míg az IPL-ben a bipoláris sejtek terminálisai jelölődtek VGLUT-1 antiszérummal (III.3.4.A. ábra), korábbi leírásokkal egybehangzóan (Gong et al., 2006; Johnson et al., 2003). Háromszori MSG (III.3.4.B.

ábra) kezelés hatására látványosan csökkent az immunjelölés erőssége és kiterjedése az IPL-ben, ami a bipoláris sejtvégződések nagymértékű károsodására utal. A PACAP-pal kezelt retinában az immunjelölés erőssége nagyobbnak mutatkozott a degenerált

retinában látottakkal szemben (III.3.4.C. ábra). Korábbi eredményekkel (Johnson et al., 2003) megegyezően VGAT immunjelölést láttunk a külső és a belső plexiform rétegekben. Glutamát okozta excitotoxikus károsodásban a VGAT immunreaktivitás jelentősen redukálódott. A PACAP hatására a VGAT immunpozitivitás csökkenése kisebb mértékűnek, míg az IPL jelölődése kifejezettebbnek bizonyult.

Ismert, hogy a horizontális és a dopaminerg amakrin sejtek calbindint (Hamano et al., 1990), a kolinerg amakrin sejtek calretinint (Gábriel és Witkovsky, 1998), míg a glicinerg AII-es amakrin sejtek parvalbumint (Wassle et al., 1993) és calbindint (Ishimoto et al., 1989) egyaránt expresszálnak. Normál retinában erőteljes calretinin jelölés volt látható az INL-ben és a GCL-ben, ami kolinerg amakrin sejtek jelenlétére utal.

Háromszori MSG kezelés hatására jelentősen csökkent az immunreaktivitás mértéke és a jelölt sejtek száma a normál retinához képest. Ez a jelenség a belső sejtrétegben található struktúrák pusztulásával magyarázható. Intravitreálisan alkalmazott PACAP hatására az amakrin sejtek túlélési aránya jelentős mértékben megnőtt. A calbindin a horizontális és egyes amakrin sejtek sejttestjeiben és a nyúlványaiban található (III.3.5.A. ábra). MSG alkalmazás során csak minimális változás következett be az immunjelölés erősségében, mely alapján arra következtetünk, hogy a horizontális sejtek nem károsodnak jelentős mértékben (III.3.5.B. ábra). PACAP hatására normál immunreaktivitási mintázatot kaptunk (III.3.5.C. ábra).

Patkány retinában korábbi tanulmányokkal megegyezően (Endo et al., 1986) parvalbumin immunreaktivitás az INL proximális részében látható. Innen indulnak azok a nyúlványok, melyek az IPL-ben végződnek. Normál retinában erőteljes parvalbumin pozitivitás figyelhető meg az AII glicinerg amakrin sejtekben. Az MSG kezelésen átesett retinán a jel erőssége kismértékben csökkent, a sejtek nyúlványai nagy százalékban elpusztultak. PACAP alkalmazása ellensúlyozta az MSG neurotoxicitását: a parvalbumin immunexpresszivitási mintázat a normálhoz hasonló volt. Normál körülmények között 3 hetes állatokban a retina Müller-sejtjeiben gyenge GFAP-pozitivitás mutatható ki, főleg a végtalpak területén. MSG okozta károsodás után a GFAP szintjének masszív emelkedése figyelhető meg, melynek következményeként a Müller-sejtek erős immunpozitivitást mutattak a retina teljes területén. PACAP hatására a retina rétegei elkülönültek, azonban a GFAP jelerősség csökkent maradt.

Kontroll állapotban kirajzolódott a belső sejtes rétegben található pálcika bipoláris sejtek erőteljes PKC aktivitása (III.3.6.A. ábra). MSG hatására a bipoláris sejtek axonjai jelentősen megrövidültek (III.3.6.B. ábra). Az INL vastagsága jelentősen redukálódott, az IPL szinte teljesen eltűnt. A PACAP kezelést követően a PKC tartalmú sejtpopuláció immunreaktivitása még mindig csökkent szintet mutatott, ám morfológiája a kontrolléhoz nagymértékben hasonló maradt (III.3.6.C. ábra).