3. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
3.10. A dDAAM szerepe az adult központi idegrendszerben
Gombos Rita nem közölt eredményei alapján
Háttér: A teljes átalakulással fejlődő rovarok közé tartozó ecetmuslicák egyedfejlődésére jellemző, hogy a felnőtt állatok szöveteinek többsége de novo alakul ki a lárvális imágó korongokból, míg néhány más szövet, mint pl. a központi idegrendszer, alapvetően embrionális eredetű, de a bábállapot során ezek a szövetek is átalakulásokon mennek keresztül. Ez azt jelenti, hogy az adult állatok agyában található sejtek egy része már az embrióban neuronná differenciálódott, míg más adult idegsejtek a lárvális és báb stádiumok során keletkeznek és illeszkednek be a neuronális hálózatokba [292]. Az előző fejezetben bemutatott eredményeink alapján azt találtuk, hogy a dDAAM szerepet játszik az embrionális idegkötegek kialakulásában. Következő lépésben meg akartuk vizsgálni, hogy mennyire
általános jelentőségű ez a dDAAM funkció, szükség van-e a dDAAM génre az adult idegrendszerben újonnan képződő neuronok fejlődése során is?
Eredmények: Az adult idegrendszert érintő vizsgálataink kezdetén elsőként arra voltunk kíváncsiak milyen a dDAAM kifejeződési mintája az adult agyban. Immunfestéseink alapján a dDAAM fehérje az embrionális KIR-hez hasonlóan magas szinten fejeződik ki az adult idegrendszerben is (74. ábra). Az agyban a dDAAM jól kimutatható a teljes neuripil régióban (74. ábra), melyet az idegsejtek nyúlványai és a gliasejtek alkotnak, ami szintén jól megfeleltethető az embrionális KIR-ben detektálható mintának. Az is szembetűnő volt az első festéseken, hogy a dDAAM festés jól kijelöli a gombatestek (MB) axonjait (74. ábra B,C). A gombatest fontos szerepet játszik az adult állatok szaglással összefüggő tanulási és memória folyamataiban [293,294,295]. A Drosophila adult agyban ez az egyik legjobban jellemzett agyterület, és ismert, hogy a gombatestben található idegsejtek és nyúlványaik többsége nem az embrióban jön létre, hanem a lárvális, ill. pupális élet során keletkezik [296]. Ezen előnyös tulajdonságok miatt részletesebb vizsgálatainkra a gombatestet választottuk.
74. ábra: dDAAM kifejeződés az adult agyban. (A) dDAAM (piros) és Elav (zöld) festés adult agyban, konfokális metszet. Az idegsejt specifikus Elav a sejtmagokban halmozódik fel, míg a dDAAM a neuropile régióban található. (B) Egy másik síkban készült konfokális metszeten jól látható, hogy a dDAAM (piros) felhalmozódik a gombatest (zöld pöttyökkel határolt terület, kinagyítva a C panelen) axon kötegeiben.
A gombatestet felépítő ún. Kenyon sejtek axonjai jól definiált pályák mentén haladnak, melyek a felnőtt agyban öt jól elkülönülő lebenyt alkotnak, ezek az /’, /’ és
75. ábra: A gombatest felépítése.
(A) Az adult gombatest egyik fele -FasII ellenanyaggal (piros) festve. Jól látszanak az erősen festődő és
lebenyek (75. ábra) [296,297]. A lebenyeket alkotó axonok egy az L1-es lárva stádiumtól a bábállapot végéig tartó jól jellemzett fejlődési folyamat során alakulnak ki és érik el végső target területüket (75. ábra) [297]. Kimutattuk, hogy a dDAAM protein az L1-es stádiumtól kezdődően a báb stádiumokon keresztül a fiatal adultakig kimutatható az MB-ben (76. ábra), később az adult MB-ben mennyisége fokozatosan csökken. Azt is detektálni tudtuk, hogy a fejlődő lebenyeken belül a centrális elhelyezkedésű, frissen képződő axonokban sokkal
76. ábra: dDAAM expresszió a gombatestben L1-es lárva stádiumtól adultig. (A-A”) A dDAAM expresszió (zöld) már az L1-es stádium során létrejövő γ lebenyekben megfigyelhető. A lebenyek belő részén futó nyúlványokban erősebb keletkezése során is végig megfigyelhető a báb stádiumokban. (D-F) Frissen kikelt egyedekben a felhalmozódás még néhány napig erős, majd idővel eltűnik. (D) Néhány órás, (E) egy napos (F) két napos állat agyának dDAAM festése. A FasII festés a γ lebenyt és az α/β lebenyeket jelöli ki (piros csatorna az A’-C” paneleken).
jobban felhalmozódik a fehérje, mint a már korábban keletkezett perifériális helyzetű axonokban (77. ábra) [298], ami azt sugallta, hogy az intenzív axon növekedés helye korrelál a dDAAM protein lokalizációjával.
77. ábra: dDAAM felhalmozódás az újonnan létrejövő, centrális nyúlványokban. A gombatest lebenyeiről készült keresztmetszeti képeken jól látszik, hogy a dDAAM kifejeződés (zöld) mind az α (A-A’) , mind a β (B-B’) lebenyekben a központi részen futó nyúlványokban a legerősebb. (C-C’) A nyél esetében az újonnan létrejövő nyúlványok két elkülönített kötegben futnak, melyben szintén jól követhető a központi felhalmozódás. A α és a β nyúlványokat FasII festés (piros) jelöli. (D) Az A-C paneleken bemutatott ábrák metszési síkját különböző színű szaggatott vonalak jelölik a gombatest elölnézeti képén.
Tekintve, hogy a dDAAM null mutánsok legkésőbb a 3. lárvális stádiumban elpusztulnak, adult életképes dDAAMEx1 hipomorf mutánsok vizsgálatával próbáltunk megállapítani, hogy befolyásolja-e a dDAAM a gombatestek fejlődését. Immunhisztokémiai és Western-blot kísérleteink alapján ezekben a mutánsokban erősen lecsökken a dDAAM fehérje szintje (78. ábra), ami jelezte, hogy alkalmasak lehetnek kísérleti céljainkra. Az és axonok lefutását nagyszámú dDAAMEx1 mutáns állatban részletesen analizálva arra a következtetésre jutottunk, hogy a dDAAM szükséges a gombatest axonok növekedéséhez, mert változatos nyúlványnövekedési defektusokat tudtunk kimutatni a mutánsok kb. 30-60%-
78. ábra: A dDAAM mennyisége Ex1 mutáns állatokban. A dDAAM fehérje erősen redukált mennyiségben van jelen a felnőtt dDAAMEx1 (Ex1) mutáns állatok agyában a vad típushoz (WT) képest. Ez jól kimutatható mind immunhisztokémiai festéssel (jobb oldal), mind blot-tal (bal oldal). A Western-blot-on a dDAAM fehérjét a 130 kDa–nál lévő sáv jelöli. Belső kontrolként a 100 kDa-nál futó glikogén-foszforiláz-t (p94) használtuk.
ában (az állatok nemétől, a hőmérséklettől és a lebeny típusától függően) (79. és 80. ábra).
Ezt a fenotípust majdnem tökéletes hatékonysággal menekíteni lehetett az UAS-FL-DAAM transzgénnel (80. ábra), ezért eredményeink arra utaltak, hogy a dDAAM nem csupán az embrionális axonok növekedését segíti elő, hanem az egyedfejlődés során később kialakuló nyúlványok képződésében is szerepet játszik.
79. ábra: dDAAMEx1 mutánsok gombatestén megfigyelhető fenotípus kategóriák. A dDAAMEx1 mutánsok gombatestének α és β lebenyein megfigyelhető különböző típusú nyúlvány-növekedési és projekciós hibák bemutatása FasII festés alapján. A fölső panel a vad típust mutatja, míg az alsó panelek az α és β lebenyekben detektálható fenotípus kategóriákat reprezentálják.
80. ábra: A dDAAMEx1 mutánsok gombatestén megfigyelhető axon növekedési hibák számszerűsítése. A dDAAMEx1 mutánsok gombatestének lebenyein megfigyelhető nyúlvány-növekedési és projekciós hibák aránya az α (fölső grafikon) és a β (alsó grafikon) lebenyek esetében. A mutáns fenotípust az UAS-FL-DAAM transzgén tökéletesen, míg az UAS-mDaam1 konstrukció részlegesen képes menekíteni. A vizsgált fenotípus kategóriák a jobb oldali négyszögben vannak jelölve.
A dDAAMEx1 mutánsokban megfigyelhető MB fenotípus közepesen erős jellege ebben az esetben is lehetőséget adott genetikai interakciós partnerek azonosítására. Mindezidáig elsősorban azokat a jelölt géneket vizsgáltuk amelyek az embrionális KIR-ben is kölcsönható partnernek bizonyultak. Megállapítottuk, hogy amíg a RhoA mutánsok részlegesen szupresszálják, a Rac mutánsok jelentősen erősítik a dDAAMEx1 fenotipikus hatását (81.
ábra), ami erősíti azt az elképzelést, hogy a központi idegrendszerben a Rac GTPázok a dDAAM fő aktiváló faktorai. Az általunk tesztelt ena és chic (profilin) mutánsok közül csak a chic mutatott domináns genetikai kölcsönhatást ebben a szövetben (81. ábra), de mindkét fehérje erősen átfedő kifejeződési mintát mutat a dDAAM-mal a gombatest területén (82.
ábra). A profilin tehát itt is együttműködő partner lehet, míg az interakció hiánya az ena-val arra utalhat, hogy ebben a szövetben az Ena fehérje mennyisége nem limitált olyan mértékben, hogy a géndózis maximum felére történő csökkentése érzékelhető fenotipikus hatással járna. Elképzelhető ugyanakkor az is, hogy a gombatestben a dDAAM más fehérjék közreműködését igényli, mint az embrionális KIR-ben, ezért további kísérleteket tervezünk a kérdés tisztázása érdekében.
81. ábra: A dDAAMEx1 genetikai kölcsönhatásai a gombatestben. A dDAAMEx1 mutánsok gombatestének lebenyeiben megfigyelhető axon növekedési hibák aránya chic/+ és Rac mutáns háttereken növekszik, míg az ena mutánsok nem befolyásolják azt. A számszerűsítés alapjául szolgáló fenotípus kategóriákat a jobb oldalon láthatjuk.
82. ábra: A dDAAM kolokalizációja a profilin és az Ena fehérjével. (A-A”) A dDAAM (piros) kolokalizációt mutat a profilin fehérjével (zöld) néhány órás adultak gombatestében a centrális részen futó újonnan képződött nyúlványokban. (B-B”) Hasonló kolokalizációt lehet megfigyelni a dDAAM és az Ena viszonylatában is.
Következtetések: A dDAAM adult idegrendszeri funkciójának vizsgálata tisztázta, hogy az embrionális KIR-en kívül a dDAAM a felnőtt agyban található idesejtek fejlődését is befolyásolja. Szintén csak az embrióban tapasztaltakhoz hasonlóan, a dDAAM mutánsok fenotípusa arra utal, hogy a fehérje legfontosabb funkciója az axon növekedés elősegítése.
Ezek alapján tehát a neuron nyúlványok kialakításában betöltött szerep egy általános dDAAM funkciónak tekinthető, a dDAAM valószínűleg az egyedfejlődés minden stádiumában részt vesz az axonok növekedésében és ezzel az idegkötegek kialakulásában. Ezen túlmenően az adult idegrendszert érintő vizsgálataink megerősítették, hogy a dDAAM fehérje legfontosabb aktivátorai a központi idegrendszerben a Rac családba tartozó GTPázok, amelyek mutánsai az adult agyban erős, dózis függő genetikai kölcsönhatást mutatnak a dDAAMEx1 hipomorf mutánssal.
3.11. A forminok DAAM alcsaládja evolúciósan konzervált szerepet játszik az axon