A megfelelő mennyiségű és minőségű élelmiszerek előállításában - a világ rohamosan növekvő népességének egyre nagyobb élelmiszerigénye mellett – a növényvédő szerek okszerű felhasználásának jelentős szerepe van.
A kémiai növényvédelem mellett egyre kiemeltebb szerepet kap a biológiai és fizikai növényvédelem, mert a termésveszteséget okozó károsítók ellen a környezet kímélése érdekében lépünk fel. A növényvédő szerek, bár szükséges anyagok, potenciális mérgek, ezért kedvező hatásaik mellett esetleges káros hatásokkal is számolnunk kell. Ezek a káros hatások az élő szervezetekre sokféleképpen érvényesülhetnek. Mivel a környezetbe juttatjuk ki a peszticideket, mérgeződhet a környezet (talaj, víz, levegő), illetve az itt élő nem-célszervezetek (méh, hal, vad, rovar, háziállat), valamint a táplálékláncban feldúsulva végső fogyasztóként az ember is. Felhasználás során szintén mérgeződhet az ember, mint aki kijuttatja, alkalmazza a szereket. A kijuttatást végző személy testfelszínére kerülve helyi, illetve általános mérgezés alakulhat ki. A szerek különböző mértékű szem- és bőrkárosodást okozhatnak irritatív hatásuktól függően. A szembe jutott mérgező anyagok az enyhe, reverzibilis kötőhártya gyulladástól kezdve súlyos és maradandó szemkárosodást, szaruhártyahomályt, végső esetben vakságot és egyéb életveszélyes károsodást is okozhatnak (Bordás, 1971).
Célom az volt a vizsgálataim során, hogy Magyarországon Budai (2002) és Tavaszi (2012) után újabb növényvédő szerekkel és módszerekkel bővítsem ki a különböző in vitro vizsgálatok összehasonlítását a primer szemirritációban elismert in vivo szemirritációs teszttel, valamint, hogy megállapíthassam az alternatív módszerek együttes vagy külön-külön való alkalmazhatóságát elővizsgálati vagy kiváltási módszerként. Célom elérése érdekében 25 (MTT-nél 15) növényvédő szer irritációs potenciálját határoztam meg a HET-CAM, az MTT és az ICE teszttel, majd vetettem azokat össze az in vivo szemirritációs teszt irodalomból (toxikológiai értékelő jelentések) származó adataival.
Az in vivo adatokat (Toxicological studies on the Plant Protection Product, Annex III A, Section 3, Tier II – Summary: Toxicological studies) a Nemzeti Élelmiszerlánc-biztonsági Hivatal Növény-, Talaj- és Agrárkörnyezet-védelmi Igazgatóság Növényvédő szer és Termésnövelő anyag Engedélyezési Osztálya bocsátotta rendelkezésemre.
A HET-CAM tesztet az Invittox Protocol 47. száma (1990) alapján végeztem el. A vizsgálati anyagokat 100%-os töménységben alkalmaztam. A vizsgálathoz magas termékenységi mutatóval rendelkező (White Leghorn) tyúktojásokat használtam, amelyeket lámpázás után 10
99
napig keltettem 37 ˚C-on, 60-70 %-os páratartalomnál. A 10. napon a tojáshéj felnyitásával szabaddá váló chorioallantois membránra cseppentettem a vizsgálati anyagot, melyet 5 percig figyeltem meg. A membránon vérzés, véredény lízis vagy koaguláció jelentkezhet, melyek jelentkezésének idejét másodperc pontossággal rögzítettem, majd ezekből irritációs indexet számoltam. Vizsgálati anyagonként 6 db tojást alkalmaztam 4 ismétlésben.
Az ICE tesztet az OECD 438 irányelv alapján végeztem el. A vizsgálathoz használt csirkeszemek a vágástól számított két órán belül az izolált körülményeket biztosító szuperfúziós készülékbe kerültek. A vizsgálókamrákba helyezett szemek alkalmasságát a szaruhártyahomály és a 2 v/v%-os fluoreszein-oldat megtartásának mértékével ellenőriztem. A nem megfelelő szemek kicserélésre kerültek, majd megmértem a szaruhártya-vastagságot minden szem esetében. 45-60 perces akklimatizációt követően, de még a kezelés előtt szintén meghatároztam a szaruhártya-vastagságot, a szaruhártyahomályt és a fluoreszein-megtartást mindegyik szemnél (referencia értékek). A kezelést követő mosás utáni 30., 75., 120., 180., 240. percben végzett megfigyelések során rögzített paramétereket a referenciaértékekkel összehasonlítva meghatározható volt a vizsgált vegyi anyag szaruhártyára gyakorolt károsító hatása az adott időpontban. A kezelési térfogat 30 µl, az expozíciós idő pedig 10 másodperc volt minden egyes szem esetében, amelynek lejárta után a tesztanyagot szobahőmérsékletű fiziológiás sóoldat segítségével távolítottam el a szaruhártya felszínéről (kb. 20 ml/szem). A csirkeszemek elváltozásainak mértékét százalékban fejeztem ki, majd a három mérésből származó végpontból határoztam meg a vizsgálati anyag szemirritációs potenciálját. Vizsgált anyagonként három szemet vontam kísérletbe.
Az MTT vizsgálatot patkányból kinyert epithelsejteken végeztem, amelyeket 24 órával a vizsgálat megkezdése előtt az előzőleg elkészített szuszpenzióban (Hank-oldat), megfelelő hígításban 96 lyukú lemezre vittem fel. Másnap a tápoldatot kiöntöttem, és friss tápoldatra cseréltem, amely a vizsgálati anyag különböző mértékben hígított oldatát tartalmazta. 24 órás expozíció után 2 órán át 1 mg/ml MTT oldattal inkubáltam a sejteket, majd a keletkezett formazán kristályokat DMSO-val oldottam. Az oldat fényelnyelését 540 nm hullámhosszon mértem. Az azonos hígítások fényelnyelési adataiból (3 mérés) átlagot számoltam, majd ezt a kezeletlen sejtek (24 mérés) átlagához viszonyítva kiszámítottam a %-os sejtpusztulást. A kezelt oldat fényelnyelését a kezeletlenhez viszonyítva határoztam meg az élő sejtek %-os arányát. A vizsgálati minták minden hígításával három párhuzamos mérést végeztem.
Kontrollként kezeletlen sejteket használtam.
100
Az általam elvégzett vizsgálatok alapján megállapítható, hogy összességében mindhárom alternatív módszernél jó a közelítés az in vivo adatok irányába (18. táblázat), de a kísérletbe vont növényvédő szerek alapján a HET-CAM teszt mutatta a legjobb eredményeket.
Kísérleteim alapján elmondhatom, hogy az általam vizsgált tesztek in vitro tesztrendszerben együttesen több módszer felhasználásával alkalmasak lehetnek az in vivo teszt teljes irritációs potenciálját lefedő kiváltásra. A teljes irritációs potenciál lefedéséhez többlépcsős megközelítésben in vitro tesztrendszer szükséges, amelyhez ajánlom mind a HET-CAM, mind az ICE módszerek bevonását az OECD 405-ös szabvány szerinti in vivo vizsgálat elvégzése előtt.
101