Ízeltlábúak terjesztette vírusok vizsgálata .1 Krími-kongói vérzéses láz vírusa (KKVLV)

Kutatásunk egyik kiemelt jelentőségű témája a KKVLV előfordulásának igazolása (vagy cáfolása) volt. Az első vizsgálatok a vírussal hazánkban az 1970-es évek végén, illetve az 1980-as évek elején történtek, de azóta komolyabb, átfogóbb vizsgálat nem volt a vírus tényleges jelenlétére és esetleges közegészségügyi szerepére nézve.

Kutatásaink első lépéseként, a vírus vizsgálatára alkalmas módszertant kellett kidolgozni, aminek megfelelően két különböző szerológiai vizsgálati tesztet fejlesztettünk és optimalizáltunk. Ezek egy ELISA és egy IFA vizsgálat volt, mindkettő esetében antigénként KKVLV rNP alkalmazásával (a vizsgálatok időpontjában még nem rendelkeztünk BSL-4 laboratóriummal). Az rNP expresszálásának (1448 bp) teljes folyamata megegyezett a hantavírus (DOBV és PUUV) NP fehérjék termeltetésének eljárásával (15. ábra). A másik vizsgálati módszerünk egy transzgenikus CHO-KKVLV sejtvonal létrehozása volt, amit IFA vizsgálathoz használtunk.

15. ábra. A tisztított KKVLV rNP antigén WB analízise. A rNP vizsgálata humán anti-KKVLV IgG antitesttel (A), protein marker (M) (BioRad).

A szakirodalomból ismert, hogy a vírus gyakran fertőz mezei nyulakat, ami elsősorban valószínűleg a nyúl és kullancs gyakori találkozásából adódhat. Egyértelmű bizonyíték azonban még nincs erre. A mezei nyulakat fő rezervoárjaként azonosították a KKVLV-nek a Szovjetunióban, Bulgáriában és Afrikában; azonban egy albániai tanulmány arról számolt be, hogy nem sikerült kimutatni a KKVLV elleni antitesteket ebben a gazdaszervezetben (Hoogstraal, 1979; Papa és mtsai. 2009). Vizsgálatainkat így mezei nyúl vérmintáinak (Lepus europaeus) szerológiai tesztelésével kezdtük. A Dévaványa falu környékéről (47 ° 05'N, 20 ° 56'E) származó (Dr. Gyuranecz Miklós gyűjtése), összesen 198 mezei nyúl szérum mintát teszteltünk paralel módon ELISA és IFA vizsgálatokkal. A mintákból először (hígítás: 1: 100) az anti-KKVLV IgG antitestek jelenlétét szerettük volna bizonyítani rNP alapú ELISA alkalmazásával. A következőkben ugyanezen mintákat az előzetesen előállított rNP KKVLV-CHO alkalmazásával IFA módszerrel is teszteltük. Eredményeink értékelésekor mind az ELISA, mind pedig az IFA tesztek eredményét figyelembe vettük. A 198 mintából mindkét vizsgálati módszerrel 12 (6%) adott pozitív eredményt (6. táblázat). Négy minta volt pozitív csak IFA teszttel (16. ábra), egy szérum volt pozitív csak ELISA vizsgálattal. Meg kell jegyeznünk, hogy az ELISA egy objektív, mérhető kimutatási módszer, míg az IFA sokkal szubjektívebb, nagymértékben függ a vizsgálatot végző személy rutinjától.

M A

16. ábra: KKVLV IgG pozitív minták IFA képe CHO-KKVLV transzgenikus sejtvonalon.

6. táblázat: Anti-KKVLV IgG antitestek kimutatása Lepus europaeus vérmintáiból, ELISA és IFA vizsgálatokkal hazánkban.

Eredményeink szépen kiegészítik azt a történelmi megfigyelést, hogy a KKVLV endemikus gócai jelen vannak Magyarországon, azonban a rezervoár fajok, vektorok és amplifikáló gazdák teljes spektrumának felderítéséhez még további vizsgálatok szükségesek.

A KKVLV magyarországi előfordulásáról szóló ismereteink korlátozottak és főként történelmi megfigyeléseken alapulnak. Az 1960-as évek végén elvégzett szerológiai vizsgálatok juhok, szarvasmarhák és a humán szérumok esetében 31%, 0,9%, illetve 2,9%

szeropozitivitást mutattak KKVLV esetében. Ebben a tanulmányban agar gél diffúziós precipitációs módszert alkalmaztak (Horváth, 1975; Horváth, 1976). Bár az Ixodes ricinus kullancs szokatlan faj a KKVLV fertőzés számára, két törzset izoláltak szopós egerekben az 1970-es évek elején, az arbovírusok országos felmérésének részeként (Molnár, 1982).

Legjobb tudásunk szerint azonban ezek az izolátumok megsemmisültek, így sem pontos típusuk, sem szekvenciájuk nem ismert.

KKVLV fertőzésekre vonatkozó szerológiai bizonyítékok kézzelfoghatóak, azonban sok felderítendő terület maradt ahhoz, hogy megismerjük és megállapítások közegészségügyi vonatkozásait. Hazánkban az évente jelentett vírusos vérzéses láz esetek száma 2000-től

IFA Pozitív Negatív

ELISA Pozitív 12 1

Negatív 4 181

átlagosan 10-15 (évente: 3-21), de a legtöbb eset természetesen hantavírus fertőzésekhez kapcsolódott. Ennek ellenére előfordulnak nem diagnosztizált esetek, ahol még a virális eredet sem bizonyított. Így egyértelmű, hogy Magyarországon fontos lehet az ismeretlen etiológiájú vérzéses lázak további komplex vizsgálata, akár modern molekuláris biológiai, metagenomikai vizsgálatok alkalmazásával. KKVLV pozitív eredményt ezidáig hazánkban nem sikerült azonosítani akut fertőzésből. Az, hogy klinikai mintából ezidáig nem sikerült KKVLV-t kimutatni több okra vezethető vissza: (i) Az egyik lehetőség, hogy Magyarországon nem cirkulál magas fertőzőképességű KKVLV törzs, így az emberi KKVLV fertőzések kevésbé súlyosak, vagy akár teljesen tünetmentesek lehetnek. Ebben az esetben ezek a fertőzések nem kerülnek felderítésre, a klinikusok nem is gondolnak a KKVLV etiológiai szerepére. Mivel a humán diagnosztikai célú vizsgálatokat kizárólag csak az NNK referencia laboratóriuma végezhet, így az akut betegminták felderítése egy kutató laboratóriumban nem megoldható. Az esetleges fertőzések igazolására átfogó szeroepidemiológiai vizsgálatokra lenne szükség, hogy a KKVLV ellen termelődött IgG antitestek jelenlétét utólag igazolni lehessen. A nem magasan patogén törzs jelenlétének hipotézistét az AP92 törzs példája is alátámaszthatja. Az AP92 KKVLV törzset a Rhipicephalus bursa kullancsokban mutatták ki Görögországban. Ez a törzs apatogénnek bizonyult, illetve a bejelentett esetekben, Törökországban alacsony patogenitást mutatott (Papadopoulos és mtsai., 1980; Midilli és mtsai., 2009). Bár a Hyalomma fajok Magyarországon nem tekinthetők elsődleges vírusvektornak, más kullancsfajok, például a Rhipicephalus fajok és az Ixodes fajok vélhető vektorokként szolgálhatnak az országban.

Kérdéses, hogy az Ixodes ricinus fajok szerepet játszhatnak-e az AP92-szerű törzsek vagy más, KKVLV apatogén törzsének transzmissziójában. Ennek igazolására átfogó, szisztematikus molekuláris vizsgálatot tervezünk a hazai Ixodes sp. fajok vizsgálatával.

Minden esetben a legfontosabb a vírus tényleges molekuláris biológiai igazolása lenne.

Kutatócsoportunk a szeropozitív nyulak területéről gyűjtött kullancsokban (1359 db) próbálta a vírus jelenlétét kimutatni saját fejlesztésű, univerzális, minden ismert KKVLV törzs kimutatására alkalmas TaqMan RT-PCR módszerrel, azonban ezidáig minden teszt negatív eredményt adott. A KKVLV jelenlétének molekuláris igazolása ezidáig nem volt sikeres. (ii) A KKVLV-nek nincs humán expozíciója. Ha a szerológiai adatokat vesszük figyelembe, a KKVLV hazai jelenléte vad- és haszonállatokban igazolt. Ebben az esetben azonban a humán expozíció elmaradásának esélye csekély. (iii) Nem maga a vírus, hanem egy KKVLV-szerű vírus cirkulál az országban, amely vadállatokat fertőz (akár tünetmentesen is), szerológiai keresztreakciót ad a KKVLV törzsével, de a humán megbetegedésekben nincs szerepe.

4.2.2 Kullancsenkefalitisz vírus (KEV)

A kullancsenkefalitisz vírussal (KEV) végzett vizsgálatainkban mind a hordozó rágcsáló fajok, mind pedig a kullancs vektor vizsgálataira fókuszáltunk. Igazolni szerettük volna a kisemlősök szerepét a vírus terjesztésében, vizsgáltuk a kullancsok átfertőzöttségét, valamint a vírus genetikai állományát.

A vírus kullancsokból történő kimutatása céljából összesen 2731 (261 csoportba gyűjtve) kullancsot (616 lárva, 1621 nimfa, 494 felnőtt) vizsgáltunk, melyeket 2009 and 2012 között gyűjtöttek az MTA, ATK, ÁOTI munkatársai (Dr. Gyuranecz Miklós és kollégáinak segítségével). Az állatok vizsgálatát közösen, együttműködés keretén belül végeztük el. 2300 (84,2%) (206 csoportba gyűjtve) kullancsot közvetlenül a növényzetről, 436 állatot (15,8%) (55 csoportba gyűjtve) kisemlősökről gyűjtöttek.

Az Ixodes ricinus faj volt a leggyakoribb faj (80,4%; n=2196), amit a Haemaphysalis concinna (17,8%; n=489) és a Dermacentor marginatus (1,7%; n=46) követett. A kisemlősök esetén AFL-ról, AAG-ról és MAR-ról történtek a gyűjtések.

* Minimum kimutatási ráta: pozitív csoportok száma /összes vizsgálat kullancsok száma

7. táblázat: KEV vizsgálatokhoz gyűjtött kullancsok számának és a vizsgálatok eredményeinek táblázatos összefoglalása.

Az általunk gyűjtött kullancsfajok közül csak az Ixodes ricinus-ból tudtuk igazolni a vírus jelenlétét (7. táblázat). A KEV pozitív mintákon belül egyetlen tartalmazott nimfákat

(0,9%) és négy pedig lárvákat (9,3%). A KEV pozitív nimfákat tartalmazó csoport egyedeit (5 egyed/csoport) növényzetről, míg a lárvákat (1, 2, 5, és 8 egyed/csoport) rágcsálókról gyűjtöttük (három csoport egyedei AAG-ról és egy csoport egyedei MAR-ról). A vírus minimális detekciós rátája (feltételezve minimum egy fertőzött kullancsot csoportonként) 0,08% volt a nimfák és 0,77% pedig a lárvák esetében. Az elvégzett filogenetikai elemzés (11. ábra) is igazolta, hogy az általunk azonosított KEV törzsek az európai altípushoz tartozó KEV törzsekkel csoportosulnak.

11. ábra: Kullancsokból azonosított KEV filogenetikai analízise.

Kumlinge_25-03 Kumlinge_A52

KrM_213 KrM_93

Salem Est3476

AS33 Joutseno Hypr Toro-2003

TBEV/Dv/179Ir/09 TBEV/Dv/84Ir/09 TBEV/Dv/181Ir/09 TBEV/Dv/180Ir/09 TBEV/Dv/177Ir/09 Zausaev

Cht-653 Latvia-1-96 EK-328

Est54 Primorye-1153 Dalnegorsk Oshima_5-10 Primorye-86

Glubinnoe/2004 WNV 76

73 77

64 94

95 66

61

0.05

KEV-SzibériaKEV-Európa KEV-Távol-Kelet

A kisemlősök körében végzett kutatásunk során 8 különböző fajtól származó 405 rágcsáló májmintát vizsgáltunk a KEV fertőzés igazolása céljából. A vizsgált kisemlősök a következők voltak: 55 AAG, 100 AFL, 11 Apodemus sylvaticus (ASY), 48 MAR, 2 Microtus agrestis (MAG), 8 Microtus oeconomus (MOE), 31 Microtus subterraneus (MSU) és 150 MGL. Összesen 17 mintában (4,2%) sikerült kimutatni a vírus RNS jelenlétét. A vírust négy rágcsáló fajban írtuk le: AAG (7,3%), MAR (6,2%), AFL (4,0%), és MGL (4,0%). A filogenetikai elemzés során a KEV törzsek szintén a vírus európai altípusához tartozó törzsekhez csoportosultak (11. ábra A / B).

TBEV/Gor/32Mgl/05 TBEV/Gyek/49Mar/05 TBEV/Pecs/a115Aag/08 TBEV/Gor/17Mar/05 TBEV/Pecs/a109Afl/08 TBEV/Gyek/132Mgl/06 TBEV/Pecs/a113Afl/10 TBEV/Gyek/194Mgl/07 TBEV/Gor/57Mar/05 TBEV/Pecs/a179Mgl/06 TBEV/Gor/38Aag/05 TBEV/Gyod/201Aag/06 TBEV/Gyek/130Mgl/06 TBEV/Matty/a122Aag/07 Toro-2003

Est3476 KrM_213

KrM_93 Kumlinge_25-03 Kunlinge-A52

Hypr Salem

Ljubljana AS33

Joutseno Neudoerfl

99

55

0.005 94

12. ábra / A: Rágcsálókból azonosított KEV filogenetikai analízise.

KEV-Európa

TBEV/Gor/32Mgl/05

Az elmúlt évtizedek során Európában nőtt a diagnosztizált KEV fertőzések száma beleértve olyan országokat is, ahol ezidáig nem volt jellemző a KEV vírushoz köthető megbetegedés. Jelenleg a vírus jelenléte abundánsnak számít számos európai országban, különösen Észak- és Kelet-Európában endemikus (Süss, 2005; Süss, 2008; Kuncz, 2003, Lindgren, 1998). A vírust hazánkban 1952-ben azonosították először (Fornosi and Molnár, 1954). Magyarországon előforduló esetek száma 1996-tól jelentősen csökkent, amelynek valószínűsíthető oka a vírus elleni védőoltás megjelenése lehet. Figyelmbe kell azonban venni, hogy ezekre az évekre tehető a diagnosztikai tesztek jelentős árnövekedése is, ami szintén okozhatta a vizsgálatok számának csökkenő tendenciáját (Süss, 2003).

A KEV endemikus területeken az I. ricinus és I. persulcatus kullancsfajok számítanak elsődleges vektornak, habár számos tanulmány eredményei szerint a potenciális vektorfajok száma bővebb (Ko és mtsai., 2010). A rendelkezésünkre álló irodalmi adatokkal összhangban az általunk gyűjtött kullancsfajok közül csak az I. ricinus fajt tartalmazó minták mutattak KEV pozitivitást. Pozitív mintákat azonosítottunk a kisemlősökről gyűjtött kullancsok körében is. Az említett jelenség a kisemlősök rezervoár szervezetként betöltött szerepére lehet ismét bizonyíték (Hubálek és Rudolf, 2012). A kisemlősök tulajdonságai számos szempontból hozzájárulnak és segítik a KEV terjedését. Először is az endemikus területeken magas egyedszámmal fordulnak elő, ahol kullancsok által erősen parazitáltak, másodszor a kisemlősök biztosítják a vírus nem virémiás átvitelét a fertőzött és nem fertőzött kullancsok között táplálkozás közben (Labuda és mtsai., 1997; Kiffner és mtsai., 2011). Vizsgálatunk során nem tudtuk pontosan meghatározni, hogy a vizsgált kullancs maga vagy a kisemlős, amelyről a kullancsot eltávolítottuk volt eredetileg fertőzött a vírussal.

A rágcsálókkal végzett vizsgálatunk során az AAG, AFL, MAR és MGL fajokat azonosítottuk, mint gazdaszervezetek. Európában a legjelentősebb KEV rágcsáló gazdaszervezetek az Apodemus és Myodes fajok közé sorolhatók, habár más rágcsálók (Microtus, Mus, Micromy, Pitymys, Arvicola, Sciurus és Citellus) és rovarevők (Sorex, Talpa és Erinaceus) rendjébe tartozó fajok is részt vehetnek a vírus természetes átviteli ciklusában (Labuda és mtsai., 1997). Eredményeinkhez hasonlóan egy korábbi magyarországi tanulmány során is az AFL és MGL fajokat azonosították, mint elsődleges KEV gazdaszervezet az országban (Molnár és mtsai., 1982), habár jelen tanulmány igazolta a vírus jelenlétét AAG és MAR fajokban is. Számos európai országban mutatták ki a vírust kisemlősökből, noha az előfordulás gyakorisága országonként eltérő volt. Szlovákia KEV endemikus nyugati részén AFL és MGL fajok alkotják a kisemlős populáció 75%-át és az egyedek kb. 15%-ban mutatható ki KEV elleni antitest (Kozuch és mtsai., 1990). Egy német tanulmány során

befogott állatok 10%-a bizonyult KEV pozitívnak RT-PCR vizsgálat során (Achazi és mtsai., 2011), míg egy finnországi tanulmányban a begyűjtött kisemlősök szerveinek RT-nested PCR alapú KEV szűrése hozzávetőlegesen 12% pozitivitást mutatott (Tonteri és mtsai., 2011).

Eredményeinket figyelembe véve, valamint más kutatók eredményeivel egyetértésben kijelenthetjük, hogy a kisemlősök fontos szerepet töltenek be a KEV életciklusában, ezért az említett állatok rendszeres monitorozása jó prognosztikai adatokat szolgáltathat a KEV aktivitásról az ország endemikus régióin belül.

4.2.3 Nyugat-nílusi vírus (WNV)

Kutatásaink fontos témája a Nyugat-nílusi vírus (WNV) vizsgálata volt. A kórokozó egyre nagyobb mértékű elterjedése jó példa a szúnyogok által terjesztett vírusos megbetegedések térhódítására napjainkban. A vírus régiós szintű vizsgálata nemcsak virológiai szempontból érdekes, de hasznos információkat szolgáltathat mind a humán-, mind pedig az állategészségügy és közegészségügy számára is.

Szerb kollégákkal (Bosilijka Kritinic és Vesna Milankov) végzett tanulmányunk során összesen 6369 nőstény szúnyogot (180 csoportba gyűjtve) vizsgáltunk, melyek 11 fajból származtak (8. táblázat). A 180 tesztelt csoportból 10 (5,5%) bizonyult WNV pozitívnak (minimum infekciós ráta [MIR] érték: 1,57), melyek közül 9 származott Culex pipiens (MIR érték: 1,61; 95% konfidencia intervallum: 0,70 – 3,10) és egy pedig Anopheles maculipennis fajból (MIR érték: 45; 95% konfidencia intervallum: 1,20 – 228,40). A WNV pozitív szúnyogokat júliusban és augusztusban gyűjtöttük Kikinda, Novi Sad és Srpski Krstur területeken.

8. táblázat: WNV felmérés eredményeinek összefoglalása (Vojvodina tartomány, Szerbia, 2013)

Faj Gyűjtött szúnyogok

száma Tesztelt és (pozitív) csoportok száma

Culex pipiens 5568 115 (9)

Aedes vexans 405 19

Anopheles maculipennis 22 11 (1)

Culiseta longiareolata 1 1

Coquillettidia richiardii 34 7

Anopheles hyrcanus 3 1

Culiseta annulata 2 2

Ochlerotatus caspius 195 13

Ochlerotatus sticticus 120 7

Ochlerotatus geniculatus 18 3

Aedes rossicus 1 1

ÖSSZESEN 6369 180 (10)

A tanulmány során kiemelkedően magas fertőzöttségi arányt mutattunk ki a C. pipiens és A. maculipennis szúnyogokban Szerbia Vojvodina tartományában. Az említett két szúnyog faj esetében korábban már bizonyították, hogy Európában alkalmasak a WNV terjesztésére.

Az összességében kapott 5,5% WNV pozitivitás arányaiban magasabb, mint az eddigi Európában végzett szúnyog szűrővizsgálatok eredménye (Savage és mtsai., 1999; Engler és mtsai., 2013). Mindemellett, a WNV jelenlétének igazolása szerbiai A. maculipennis szúnyogokban fontos megfigyelésnek számít, habár nem példa nélküli Európában (Balenghien és mtsai., 2006). Az említett faj WNV terjesztésében betöltött szerepének vizsgálata fontos cél a jövőbeli kutatások számára. A vírus figyelemre méltó aktivitását jól példázza a 2013 során igazolt számos humán eset, valamint a szúnyogok magas fertőzöttségi aránya ugyanazon vizsgálati évben. A WNV pozitív mintavételi területek közül kettő közel helyezkedett el Magyarország és Románia határaihoz, amely humánegészségügyi kockázattal járhatott a szomszédos országok számára, tekintettel, hogy a szúnyog populációk kedvező ökológiai feltételei is biztosítottak voltak. Az általunk azonosított WNV törzsek filogenetikai alapú azonosításához az NS3 gén 670 bázispár hosszúságú szakaszát sokszoroztuk és elemeztük. Az előzetes filogenetikai vizsgálathoz a különböző területeken kimutatott vírusok egy-egy reprezentatív törzsét használtuk, összesen 4 törzset analizáltunk (GenBank referencia számok: KJ652314 - KJ652317). A filogenetikai fán (13. ábra) jól látszik, hogy a szerbiai WNV törzsek egyértelműen a 2-es genetikai variánshoz tartoznak, valamint jelentős eltérést mutatnak az országon belüli földrajzi területek szerint is (Kikinda, Srpski Krstur and Novi Sad). A 2013-as szerbiai WNV törzsek egyértelműen közelebbi rokonságot mutatnak a 2012-es olaszországi és a 2010-2012-es görögországi WNV törzsekkel (98-100% és 98-99%) (14. ábra).

Más kutatócsoportok által végzett előzetes vizsgálatok szerint a WNV 2-es genetikai variánsának legalább két különböző genetikai csoportja cirkulált egyidejűleg 2012-ben Szerbiában, felvetve annak a lehetőségét, hogy a vírust két eltérő esemény során hurcolták be az országba (Petrović és mtsai., 2013). Vizsgálataink során feldolgozott szúnyogokból származó WNV törzsekkel végzett filogenetikai vizsgálatok is egy független bejutási, terjedési eseményét igazolnak. Feltételezhetően a vírus Olaszországból, Görögországból, vagy Afrikából érkezhetett (esetleg vándorló madarakon keresztül), ahol a WNV 2-es genetikai variánsa hosszú ideje enzoonótikus.

KJ652317

KJ652317 Szerbia / Srpski Krstur / 2013 Olaszország / 2012

A vírussal végzett további vizsgálatainkban az általunk kimutatott törzsek teljes genom alapú, komplex molekuláris biológiai és filogenetikai analízisét végeztük el. Mind a 6 törzs esetében sikerült a teljes genomot szekvenálni és de novo összeépíteni. Összesen 10948 nukleotidot határoztunk meg hat WNV törzsből (GenBank referencia számok: KT757318 - KT757323), amelyek így a vírus teljes kódoló régióját (3434 aminosav) lefedték. Az általunk azonosított szerbiai törzsek a Nea Santa-Greece-2010 törzzsel mutatták a legmagasabb nukleotid azonosságot (99%). Vizsgálatunk során összesen hat aminosav változást találtunk különböző pozíciókban a polipeptid kódoló régión belül, amelyek között a WNV megváltozott patogenitására és virulenciájára vonatkozó számos, korábban már leírt, aminosav-szubsztitúciót is azonosítottunk. Ilyen például a Proline (Pro) az NS1250P pozícióban, az aszparagin (Asp) változások az N-kapcsolt glikozilációs helyek NS1130N, NS1175N, NS1207N és E153/154N pozícióiban (Whitemann és mtsai., 2011; Samuel és mtsai., 2006; Moudy és mtsai., 2011). Még érdekesebb, hogy az NS3 régió 249-es pozíciójában (NS3249P) a Pro aminosav-szubsztitúció is mind a hat törzs esetében kimutatható volt. Ezt a mutációt korábban a megnövekedett neuropatogenitás potenciális markereként írták le.

Továbbá, párhuzamos mutációt mutattunk ki az NS3 fehérje helikáz doménje és az NS4B TM fehérjéje között, habár az NS4B TM fehérje mutációit korábban Papa és munkatársai egy 2011-es tanulmányukban már említi, de a párhuzamos mutáció és az NS3249P / H lókusz lehetséges funkcionális kapcsolatát nem erősítették meg. Az NS3249H (His) szubsztitúcióval rendelkező törzsek párhuzamos NS4B14S (Ser) és NS4B49T (Thr) mutációkkal rendelkeznek, míg az NS3249P aminosav mutációval rendelkezők pedig NS4B14G (Gly) és NS4B49A (Ala) mutációt tartalmaznak (9 és 10. táblázatok). A teljes kódoló régió filogenetikai és szekvencia analízise is megerősítette, hogy a 2013-as szerbiai törzsek a WNV 2-es genetikai variánsának csoportjához tartoznak. Hasonlóan az NS3 alapú filogenetikai elemzéshez, a teljes kódoló régión alapuló filogenetikai fa is egyértelműen jelzi, hogy a szerbiai WNV törzsek egyetlen monofiletikus csoportot alkotnak, amely a 2010-ben és 2013-ban leírt NS3249P mutációt hordozó görög törzsekkel csoportosulnak (15. ábra). Az olaszországi NS3249P mutációval rendelkező WNV szekvenciák hiánya miatt csak egy részleges NS3 szekvencia áll rendelkezésre, amely bizonyítékot szolgáltat az NS3249P törzsek jelenlétére Olaszországban is (16. ábra). Ez is igazolja azt a megfigyelést, miszerint a különböző szerbiai WNV törzsek eltérő európai területekről történő többszöri behurcolások eredményeként kerülhettek az országba. A teljes kódoló szekvencia (és a részleges NS3 filogenetikai) analízis alapján elmondhatjuk, hogy az NS3249P mutációval rendelkező törzsek az egyéb európai törzsekkel szembeni különálló csoportosulása figyelhető meg.

Fehérje és aminosav pozíciók

E NS1 NS3 NS4B

154 130 175 207 250 249 14 23 32 49

WNV törzs Ország GB ref. szám Év

Nea Santa-Greece-2010 Görögország HQ537483 2010 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Asn Ala

Greece/2013/Xanthi_3 Görögország KJ883345 2013 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Asn Ala

Greece/2013/Thessaloniki_4 Görögország KJ883346 2013 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Asn Ala

Italy-2012 Olaszország JX878386 2012 - - - - - Pro - - - -

Serbia/2013/Vojvodina-1 Szerbia KT7573718 2013 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Asn Ala Serbia/2013/Vojvodina-2 Szerbia KT7573719 2013 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Asn Ala Serbia/2013/Vojvodina-3 Szerbia KT7573720 2013 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Ser Ala Serbia/2013/Vojvodina-4 Szerbia KT7573721 2013 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Asn Ala Serbia/2013/Vojvodina-5 Szerbia KT7573722 2013 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Asn Ala Serbia/2013/Vojvodina-6 Szerbia KT7573723 2013 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Gly Thr Asn Ala

- DRC HM147824 1958 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Ala Ser Thr

SA93/01 Dél-afrikai közt. EF429198 2001 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Ala Ser Thr

Goshawk-Hungary/04 Magyarország DQ116961 2004 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Thr Asn Thr

Austria/2008_gh Ausztria KF179640 2008 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Thr Asn Thr

Novi Sad-2010 Szerbia KC496016 2010 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Thr Asn Thr

Cz 13-502 Csehország KM203863 2013 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Thr Asn Thr

Cz 13-329 Csehország KM203861 2013 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Thr Asn Thr

Italy/2013/Rovigo/32.1 Olaszország KF588365 2013 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Thr Asn Thr 9. táblázat: Előzetes tanulmányokban leírt, a 2-es genetikai variánsú WNV törzsek fertőzésekor (patogenitás, virulencia) jegyzett fontosabb aminosav pozíciók

Italy/2013/Rovigo/32.1 Olaszország KF588365 2013 Asn Asn Asn Asn Pro His Ser Thr Asn Thr 9. táblázat: Előzetes tanulmányokban leírt, a 2-es genetikai variánsú WNV törzsek fertőzésekor (patogenitás, virulencia) jegyzett fontosabb aminosav pozíciók

In document DR. JAKAB FERENC (Pldal 66-91)