(A.1., A.2. ultrahang frekvencia generátor és erősítő, A.3. ultrahang rezonátor, A.4.
vízfürdő, A.5. analitikai mérleg, B. kísérleti minta, hangtér, C.1. analóg kavitációs zajelemző egység).
Az oszcilloszkóp képernyőjén kísérhettük figyelemmel a jelintenzitást és hullámformát. Ha a vizsgálat előtt kalibrációt végeztünk és kijelöltük a monitoron a kavitációmentes háttérzaj és a kavitációs zaj jelszintjét, ezzel a kialakuló, vagy megszűnő kavitációt objektíven követhettük.
Az állóhullámot és az akusztikai áramlást vizuálisan vizsgáltuk a hangtérben, mivel többek között Saad és Williams (1985) is rámutattak, hogy ultrahang által kiváltott kavitáció miatt folyadékban vizuálisan megfigyelhető akusztikai áramlások alakulnak ki.
Wathmough et al. (1990) szintén akusztikai áramlás miatti folyadékkeveredést tapasztaltak a hangtérben. Church és Miller (1983) kísérletében pedig azt tapasztalta, hogy az állóhullám eredményeként a sejtek és a buborékok egymástól elkülönülten rétegződtek. Ezáltal a kavitáció, az akusztikai áramlás és az állóhullám vizuálisan megfigyelhető jelenségek.
3.4.4. KAVITÁCIÓS HATÁRKONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA
3.4.4.1. KAVITÁCIÓS HATÁRKONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSÁNAK ALAPMÓDSZERE
A 25ml, ½-1órán keresztül pihentetett csapvizet töltöttünk be a kezelőedénybe. A hangteret folyamatosan 20ºC hőmérsékleten tartottuk, állandó hőmérsékletű vízköpeny segítségével. Analitikai mérlegen bemérő kanálra, a mintából 0,5-1g mennyiséget mértünk be ±0,001g pontossággal. Bekapcsoltuk a hangtér jelenségeit elemző
A.3.
A.1., A.2. A.5.
B.
A.4.
C.1.
- 54 -
berendezéseket. Sugárzófejre kapcsoltuk az ultrahangot, a tiszta vízben megindult a kavitáció, vizsgálhatóvá vált a kavitációs zaj. A bemérő kanál segítségével elkezdtük beadagolni a szuszpendálandó szemcséket. A beadagolás addig tartott, amíg a műszeresen elemzett kavitációs zaj meg nem szűnt. Ez a kavitációs határkoncentráció. A kavitációs határkoncentráció meghatározásához, a fogyott anyagmennyiséget analitikai mérlegen
±0,001g pontossággal visszamértük. A kísérleteket minden mintánál, minden teljesítményszinten négyszer megismételtük.
3.4.4.2. KIEGÉSZÍTŐ MÓDSZER KAVITÁCIÓS HATÁRKONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSÁRA
Alkalmazásának célja, hogy az alapmódszer kavitációs küszöb eredményeit tovább pontosítsuk közelítő módszer segítségével. Az alapmódszer segítségével kapott kavitációs határkoncentráció alatti és feletti tömegbeméréssel megközelítettük a kavitációs határkoncentrációt. Ha három, egymástól maximum 2mg-ban különböző szuszpendált minta közül a középső minta esetében, az ultrahang bekapcsolása után 2 másodpercen belül beindult a kavitáció, az alatta lévő tömegnél azonnal, a felette lévőnél jóval később, akkor ismertnek tekintettük a kavitációs határkoncentrációt a középső és alsó mintatömeg átlagára vonatkozóan.
3.4.5. KAVITÁCIÓ KIALAKULÁSI IDŐINTERVALLUM VIZSGÁLATA
A hangtérbe 25ml 20ºC-os pihentetett csapvizet töltöttünk. A különböző típusú szemcsék esetében, a kavitáció kialakulási időintervallumot, minden egyes kezelési teljesítmény szinten a kiegészítő módszer segítségével mért kavitációs határkoncentráció értékek 1,5-szeres mennyiségének hangtérbe adagolásával vizsgáltuk. E mennyiség alkalmazásánál azt követtük, hogy mivel új megfigyelés és módszer kidolgozása történt, ne távolodjunk el túlzottan az ismert kavitációs határkoncentrációtól, mivel ekkor nagy lenne annak a kockázata, hogy nem tudnánk, mi történik a két távoli koncentráció között az akusztikai jelenségek alakulásával. A szemcséket tehát az aktuális kiegészítő vizsgálatból származó kavitációs határkoncentrációra mért értéknek 1,5-szeres mennyiségében, a hangtérben előszuszpendáltattuk, majd a keverő hangtérből való eltávolítása után az aktuális kavitációs határkoncentrációnál alkalmazott teljesítménnyel
- 55 -
megegyező teljesítményt kapcsoltuk a sugárzófejre. Az ultrahang bekapcsolásától a kavitáció kialakulási időpillanatig eltelt időintervallum a kavitáció kialakulási időintervallum. A vizsgálatokat négy ismétléssel végeztük.
3.4.6. KÍSÉRLETI TERV
1,117MHz frekvencián meghatároztuk a különböző szuszpendált szemcsékre vonatkozó „kavitációs határkoncentráció” értékeket, g/25ml és ebből g/l koncentrációra, 3, 6, 9 és 12W/cm2 teljesítmény mellett, 20°C hőmérsékleten, az alap majd a kiegészítő módszer segítségével. A kiegészítő vizsgálatból kapott határkoncentráció 1,5-szeres mennyiségének felhasználásával a „kavitáció kialakulási időintervallum” vizsgálatát végeztük.
3.5. PUSZTULÁSI DINAMIKA MEGHATÁROZÁSA AZ AKUSZTIKAI JELENSÉGEK FÜGGVÉNYÉBEN
3.5.1. KEZELŐ BERENDEZÉSEK
Az ultrahangkezelést ugyanazzal a berendezéssel végeztük, mint amit a 3.3. és 3.4. fejezetben alkalmaztunk (Lőrincz, 2004a).
3.5.2. SZUSZPENZIÓ
Szuszpendáló szerként ½-1órán keresztül pihentetett, 20ºC hőmérsékletű csapvizet használtunk. Szuszpendált anyagként háztartási liofilizált Saccharomyces cerevisiae pékélesztőgombát alkalmaztunk.
3.5.3. AZ AKUSZTIKAI JELENSÉGEK ÉS A SEJTBIOLÓGIAI HATÁSOK VIZSGÁLATA
A vizsgálatok alatt a kavitációs zajt, a 3.4.3. fejezetben ismertetett módon, kondenzátormikrofon, erősítő és oszcilloszkóp segítségével vizsgáltuk. A vizuális módon a megfigyelhető akusztikai jelenségeket, az állóhullámot, az akusztikai áramlást és a folyadéksugár kialakulását a kezelési idő függvényében folyamatosan nyomon kísértük.
Az élesztő kezelés alatti életképesség változását metilénkék vitálisfestéssel vizsgáltuk, a képeket biológiai mikroszkópra szerelt CCD kamerán keresztül számítógéppel rögzítettük.
- 56 -
3.5.4. KÍSÉRLETI TERVA biológiai hatás és akusztikai jelenség vizsgálatokhoz a liofilizált élesztőre előzetesen a 3.4. fejezet szerint 1,117MHz frekvencián, 9W/cm2 teljesítmény mellett, 20°C hőmérsékleten, kiegészítő módszer segítségével meghatározott, kavitációs határkoncentráció eredményeit használtuk fel.
A kiegészítő vizsgálatból kapott kavitációs határkoncentráció többszörös (1; 1,5;
1,7; 2,2; 3.) mennyiségeinek felhasználásával került sor az „állóhullám kialakulási időpillanat”, a „kavitáció kialakulási időpillanat”, és a biológiai hatások vizsgálatára, szimultán módon.
3.5.5. VITÁLIS SEJTSZÁM ÉS A HANGTÉR AKUSZTIKAI JELENSÉGEINEK SZIMULTÁN VIZSGÁLATA
Az ultrahang sejtroncsoló hatásai a szakirodalom szerint azonnal jelentkeznek a sejteken. A hangtérbe, a kísérleti tervben meghatározott koncentráció elérése érdekében, 25ml mennyiségű szuszpendáló szerbe megfelelő mennyiségű biológiai anyagot szuszpendáltunk bekeveréssel, majd a keverőt eltávolítottuk onnan. Ezután három csepp 1% töménységű metilénkék oldatot cseppentettünk a hangtérbe. Az ultrahang bekapcsolásának pillanatában egy mintázó órával mérni kezdtük; majd 15 másodpercenként 0,05ml mennyiségű mintákat vettünk a kezelt szuszpenzióból, ebből vizsgáltuk a relatív élősejtszámot a látóterenkénti világos és festődött sejtek számarányának meghatározásával, minden minta esetében a megfelelő konfidencia intervallum elérése érdekében legalább mintánkénti 15 látótér leszámolásával és átlagolásával. A mintavételeket a hangtér akusztikai hullámjelenségeinek állandósult állapotáig végeztük.
Stopperórával, mértük a kísérletek beindításától az állóhullám kialakulásáig, illetve a kavitáció kialakulásáig, vagyis a műszeresen vizsgálható kavitációs hang megjelenéséig eltelt időt.
Deák (1997) szerint meghatároztuk a „D” tizedelési időintervallum és a „k”
fajlagos pusztulási sebesség értékeket, az egyes kísérletek különböző akusztikai jelenségszakaszaira, majd ábrázoltuk a túlélési görbéket.
- 57 -
3.6. SEJTANALITIKAI ELJÁRÁSOKA sejtanalitikai eljárásaink analóg és digitális elvet követnek. A vizsgálatok alapja, a teljesítmény, a frekvencia, a kísérleti felépítmény, az alkalmazott sejtkoncentráció megegyezik 3.5. fejezetben leírtakkal.
A kezelt szuszpenzióból folyamatosan mintát vettünk, majd a mintát detektor egységbe vittük és a detektorból érkező jelet műszeresen analizáltuk, analóg, vagy digitális módon.
3.6.1. ANALÓG SEJTANALÍZIS
Az analóg sejtanalitikai rendszer, a 3.5. fejezetnél is alkalmazott kezelőedényben lévő szuszpenzióból áll, amiből egy kivezető folyadékágon keresztül perisztaltikus szivattyú segítségével állandó áramlási sebesség mellett folyadékot szivattyúztunk ki, illetve az analízis után azt egy másik ágon folyamatosan visszavezettük (15. ábra).