Nach oben pdf Porcine Circoviruses and Xenotransplantation

Porcine Circoviruses and Xenotransplantation

Porcine Circoviruses and Xenotransplantation

Abstract: Allotransplantation and xenotransplantation may be associated with the transmission of pathogens from the donor to the recipient. Whereas in the case of allotransplantation the transmitted microorganisms and their pathogenic effect are well characterized, the possible influence of porcine microorganisms on humans is mostly unknown. Porcine circoviruses (PCVs) are common in pig breeds and they belong to porcine microorganisms that still have not been fully addressed in terms of evaluating the potential risk of xenotransplantation using pig cells, tissues, and organs. Two types of PCVs are known: porcine circovirus (PCV) 1 and PCV2. Whereas PCV1 is apathogenic in pigs, PCV2 may induce severe pig diseases. Although most pigs are subclinically infected, we do not know whether this infection impairs pig transplant functionality, particularly because PCV2 is immunosuppressive. In addition, vaccination against PCV2 is able to prevent diseases, but in most cases not transmission of the virus. Therefore, PCV2 has to be eliminated to obtain xenotransplants from uninfected healthy animals. Although there is evidence that PCV2 does not infect—at least immunocompetent—humans, animals should be screened using sensitive methods to ensure virus elimination by selection, Cesarean delivery, vaccination, or embryo transfer.
Mehr anzeigen

13 Mehr lesen

Xenotransplantation — A special case of One Health

Xenotransplantation — A special case of One Health

Human pathogens that can be transmitted by allotransplantation are in most cases well characterised, for example HIV-1, HEV, rabies virus, and sensitive detection methods are generally available. However, in the case of xenotransplantation, the potentially zoonotic microorgan- isms remain partially unknown and sensitive detection methods are under development. There are indeed a lot of veterinary diagnostic lab- oratories with assays for infectious disease monitoring in pig herds, however their assays are usually monitoring pig diseases with high im- pact on meat production. Based on early findings showing that some de- tection methods are not sensitive enough [20] , new and improved methods for potentially zoonotic microorganisms are under develop- ment. There is evidence that some porcine viruses are able to infect human cells in vitro or humans in vivo, e.g., HEV. Whereas the microor- ganisms transmitted after allotransplantation are adapted to humans, many porcine microorganisms fail to infect humans due to the innate and adaptive immune response, due to the absence of suitable receptors on human cells or due to human intracellular restriction factors. Restriction factors are cellular proteins that inhibit viral replication and represent a first line of defense against viral pathogens [21] . They show an enormous structural and functional diversity and target nearly every step if the viral replication cycle. Examples of such restriction fac- tors are APOBEC3 (apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide 3), which induces hypermutation by deamination, or tetherin, which prevents virus release by tethering budding progeny vi- rions to the plasma membrane of the infected cell [21] . Bacteria, fungi, parasites and viruses are potentially zoonotic porcine microorganisms. Whereas bacteria and fungi can be treated and eliminated by antibiotics and antifungals, treating viral infections with antivirals is more compli- cated and it seems that therefore viruses represent a greater risk. Among the potentially zoonotic viruses, porcine endogenous retrovi- ruses (PERVs), porcine cytomegalovirus (PCMV), HEV genotype 3, por- cine lymphotropic herpesviruses (PLHV), and porcine circoviruses (PCV) are the best characterised ( Table 1 ). Whereas PCMV, HEV, PLHV, PCV as well as bacteria and fungi may be eliminated from pigs
Mehr anzeigen

6 Mehr lesen

Transmission of Porcine Circovirus 3 (PCV3) by Xenotransplantation of Pig Hearts into Baboons

Transmission of Porcine Circovirus 3 (PCV3) by Xenotransplantation of Pig Hearts into Baboons

Porcine circoviruses (PCV) belong to the genus Circovirus of the family Circoviridae [ 1 ]. Circoviruses are non-enveloped spherical particles with a single-stranded circular small DNA genome, they are the smallest viruses found to be replicating in mammalian cells and two types of PCV have been well characterized in the past, PCV1 and PCV2 [ 2 ]. PCV1 was isolated from a pig kidney cell culture (PK15 cells) and found to be apathogenic in pigs, whereas PCV2 was found to be associated with a complex of diseases called PCV-associated disease (PCVAD) or PCVD. Previously the most severe PCVD was called postweaning multisystemic wasting syndrome (PWMS), now called PCV2-systemic disease (PCV2-SD). In addition, PCV2 is associated with PCV2-subclinical infection (PCV2-SI), PCV2-reproductive disease (PCV2-RD), and porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS). The finding of PCV2 in subclinical infections suggests that co-factors such as co-infection with other viruses, for example porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), are required for the induction of diseases. Since both PCV1 and PCV2 can infect human cells [ 3 , 4 ] they may pose a risk when PCV-positive pig organs are used in xenotransplantation [ 5 ]. Organs from PCV2 infected pigs may be not fully functional even if the pig is not diseased.
Mehr anzeigen

11 Mehr lesen

Detektion und Kultivierung neuartiger porciner  Gammaherpesviren als Beitrag zur virologischen  Sicherheit bei der Xenotransplantation

Detektion und Kultivierung neuartiger porciner Gammaherpesviren als Beitrag zur virologischen Sicherheit bei der Xenotransplantation

wäre. Grundsätzlich sind Gammaherpesviren sehr häufig an der Entstehung von Tumoren, insbesondere Lymphomen, beteiligt [41, 74-76], was bei den im Alter von ca. sechs Monaten zu schlachtenden Schweinen schwierig zu beobachten sein wird. Aber auch bei älteren Schweinen ist das Auftreten von Lymphomen oder anderen Tumoren selten ([77]; persönliche Mitteilung von Dr. Georg Appel). Bei Miniatur- schweinen wurde jedoch nach dem Durchlaufen einer allogenen Blutstammzell- transplantation eine PTLD-ähnliche Erkrankung beschrieben, an deren Entstehung PLHV vermutlich beteiligt ist. Es wurde in den massiv vergrößerten Lymphknoten der betroffenen Tiere eine hohe Kopienzahl eines porcinen Gammaherpesvirus nachge- wiesen [33], welches als PLHV-1 identifiziert werden konnte [42]. Da PLHV-3 eng mit PLHV-1 verwandt ist, kann spekuliert werden, dass auch dieses Virus wie PLHV-1 zumindest im Schwein ein PTLD-ähnliches Krankheitsbild verursachen könnte. In den bis dato sequenzierten Genomabschnitten beider Viren (ca. 62 kbp) ist kein Unterschied in der Genomorganisation nachzuweisen, und die Gene weisen eine recht hohe Homologie zueinander auf [78]. Sollte sich dies in dem noch nicht sequenzierten Teil des Genoms fortsetzen, so kann von einer vielleicht nicht identischen, sicherlich aber sehr ähnlichen Biologie der beiden Viren ausgegangen werden. Sollten die PLH-Viren in der Lage sein, im Rahmen einer Xenotransplan- tation humane Lymphozyten zu infizieren, so ist es grundsätzlich denkbar, dass der Organrezipient dadurch eine Erkrankung entwickelt, die dem EBV-assoziierten PTLD ähnlich ist. McInnes et al. berichten von dem Auftreten von PTLD bei xeno- wie auch allotransplantierten Makaken. Die xenotransplantierten Tiere erhielten dabei Schweineorgane, die in der Mehrzahl der Fälle transgenen Tieren (CD55 [human decay-accelerating factor, hDAF]) entnommen worden waren. In beiden Gruppen (xeno: 245 Tiere; allo: 231 Tiere) war das Auftreten von PTLD bei etwa 4% der Affen zu beobachten. Es ist zu bemerken, dass in der xenotransplantierten Gruppe nicht bei allen Tieren das von den Autoren als Auslöser für die Erkrankung vermutete EBV-ähnliche Primaten-Gammaherpesvirus nachgewiesen werden konnte [34]. Es wäre daher von Interesse, die in dieser Studie gewonnenen Proben auf porcine Gammaherpesviren zu untersuchen. Im positiven Falle wäre dies ein erster Hinweis auf die Fähigkeit dieser Viren, in Primaten eine PTLD-ähnliche Erkrankung auszu- lösen.
Mehr anzeigen

165 Mehr lesen

Bericht über das 6.Minisymposium Xenotransplantation am Robert Koch-Institut in Berlin im Mai 2003

Bericht über das 6.Minisymposium Xenotransplantation am Robert Koch-Institut in Berlin im Mai 2003

viren und die Sapeloviren (simian and porcine enterovirus-like viruses). Te- schoviren verursachen beim Schwein milde bis schwere Polioencaphalomye- litiden, aber auch Fruchtbarkeitsstörun- gen und Myokarditiden. Sie lassen sich in der Zellkultur nur in porcinen Zellli- nien vermehren. Die Sapeloviren rufen ebenfalls Polioencaphalomyelitiden her- vor, haben aber offensichtlich ein brei- teres Wirtsspektrum als die Teschoviren und vermehren sich u.a.auch in mensch- lichen Zellen. Ein weiteres porcines En- terovirus, das Virus der vesikulären Schweinekrankheit, verursacht beim Schwein Aphthen, die von denen der Maul- und Klauenseuche nicht unter- scheidbar sind. Um die Diagnostik der porcinen Entero- und Teschoviren zu verbessern und damit ihre Übertragung auf den Menschen bei einer Xenotrans- plantation zu verhindern, wurden – ne- ben der Serotypisierung – ein nested RT-PCR-Nachweis und ein Realtime- PCR-Nachweis etabliert.
Mehr anzeigen

5 Mehr lesen

Untersuchung transgener Tiermodelle für die Xenotransplantation

Untersuchung transgener Tiermodelle für die Xenotransplantation

Eine stärker auftretende zelluläre Immunantwort nach Xenotransplantation im Ver- gleich zur Allotransplantation wird aus folgenden Gründen erwartet: Erstens besitzt ein Xenotransplantat im Vergleich zu einem Allotransplantat eine sehr viel größere Anzahl an Fremdpeptiden, die eine starke T-Zell-Antwort über den indirekten Signalweg auslösen können (Dorling et al. 1996c). Zweitens kann die humorale Antwort auf Xenotransplantate die zelluläre Antwort verstärken. So beobachteten Kodaira et al. (2000), dass die Komplementaktivierung und Antikörperbindung an Endothelzellen die Freisetzung von Heparansulfat von deren Oberfläche bewirkte. Lösliches Heparansulfat induzierte die Reifung von APC, diese wiederum eine verstärkte Proliferation der T-Zellen und eine zytolytische T-Zell-Antwort. Drittens induziert sowohl der direkte als auch der indirekte Signalweg der T-Zell-Aktivierung durch porcine Stimulatorzellen in-vitro eine starke proliferative humane T-Zell-Antwort (Dorling et al. 1996a; Dorling et al. 1996b). Überdies besteht Spezieskompatibilität der kostimulatorischen Moleküle der T-Zell-Aktivierung, wie z.B. zwischen porcinem CD86 mit humanem CD28 (Rogers et al. 2000). Dadurch ist erklärbar, warum die direkte humane T-Zell-Antwort auf porcines Antigen mit der direkten humanen T-Zell- Antwort auf humanes Antigen bei HLA-Mismatch quantitativ vergleichbar war (Maher
Mehr anzeigen

188 Mehr lesen

Approaching virus safety in xenotransplantation: A search for unrecognized herpesviruses in  pigs

Approaching virus safety in xenotransplantation: A search for unrecognized herpesviruses in pigs

b-h ). Thus both viruses were theoretically excluded from detection. By leaving primer KG1 c out of the primer mixture KG1 a-h , mismatches to PLHV-2 were introduced (primer mixture KG1 a,b,d-h ). When both primers were left out (primer mixture KG1 b,d-h ), mismatches to all three PLHVs were inroduced thereby excluding them from detection. In practice, the use of the primer mixtures KG1 b-h or KG1 b,d-h in the consensus PCR indeed abrogated the detection of PLHV-1 and PLHV-3 in porcine blood and tissue samples. However, detection of PLHV-2 was only insufficiently diminished by using the primer mixtures KG1 a,b,d-h or KG1 b,d-h (data not shown). The latter result was analysed in more detail by performing the consensus PCR on PLHV-1, PLHV-2 or PLHV-3 with each of the modified KG1 primers as single antisense-primers in the first-round. In the case of PLHV-2, the assumption that a single KG1 primer detects a virus while the others do not proved to be wrong, in contrast to what was found for PLHV-1 and PLHV-3. Up to five out of the eight different modified KG1 primers were able to detect PLHV-2 in samples with high copy numbers (data not shown) thereby explaining the above mentioned insufficient reduction of PLHV-2 detection by the mixtures KG1 a,b,d-h or KG1 b,d-h .
Mehr anzeigen

22 Mehr lesen

Charakterisierung, Wirtsbereich und Diagnostik Porciner Endogener Retroviren (PERV) im Rahmen der Xenotransplantation

Charakterisierung, Wirtsbereich und Diagnostik Porciner Endogener Retroviren (PERV) im Rahmen der Xenotransplantation

Die Expression von Viruspartikeln aus Schweinegewebe ist Voraussetzung für die Infektion eines Transplantatrezipienten. Bereits mehrfach wurde in vitro die Freisetzung von für huma- ne Zellen infektiösen Partikeln aus PBMC und Endothelzellen von Schweinen nachgewiesen (Akiyoshi et al., 1998; Martin et al., 1998a; Wilson et al., 1998). Auch im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß PBMC in vitro nach Stimulation mit Mitogenen transient geringe Mengen von PERV bilden können. Dabei wurden auch die Stimulationsbedingungen variiert. Darunter waren auch Bedingungen, bei denen PERV von adhärenten, makrophage- nähnlichen Zellen produziert wurde. Eine gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) von hu- manen und porcinen PBMC reicht jedoch nicht aus. Diese Ergebnise wurde durch die RT- PCR-Untersuchungen bestätigt. Ein Nachweis der Expression mittels Immunfluoreszenz war allerdings ebensowenig möglich wie eine Typisierung der adhärenten Zellen durch Antikörper gegen verschiedene Oberflächenantigene. Im ersten Fall lag vermutlich die Expression unter- halb des Detektionslimits der Methode. Im zweiten Fall ließ sich aufgrund der geringen Zahl von zur Verfügung stehenden Antikörpern gegen porcine Oberflächenantigene keine Aussage treffen.
Mehr anzeigen

118 Mehr lesen

Der Einfluss von Defibrotide auf die Herzfunktion und den myokardialen Schaden in einem ex vivo Perfusionsmodell der kardialen Xenotransplantation

Der Einfluss von Defibrotide auf die Herzfunktion und den myokardialen Schaden in einem ex vivo Perfusionsmodell der kardialen Xenotransplantation

(Guglielmelli, Bringhen et al. 2012; Larocca, Cavallo et al. 2008; Morabito, Gentile et al. 2009; Pescador R , Capuzzi L , Mantovani M , Fulgenzi A , Ferrero ME 2013). Defibrotide soll durch die Stimulation der Thrombomodulinexpression in den Endothelzellen der Gefäße antithrombotisch wirken (Guglielmelli, Bringhen et al.; Larocca, Cavallo et al. 2008; Morabito, Gentile et al. 2009). Jedoch kann porcines Thrombomodulin nicht effizient humanes Thrombin inhibieren weil es nicht effektiv humanes Protein C binden kann (Roussel, Moran et al. 2008; Lee, Salvaris et al. 2008). Somit können porcine Regulationsmoleküle des Gerinnungssystems das porcine Endothel nicht vor der Aktivierung des humanen Gerinnungssystems und ihren Folgen schützen. Folglich dürfte es zu einer Überreaktion im Xenotransplantat mit verstärkter Thrombosierung gekommen sein. Solch eine Vorschädigung im Gewebe könnte immunologische Abstoßungsprozesse förden. Folglich ist der im humanen Modell getestete antithrombotische Effekt von Defibrotide nicht zwingend übertragbar auf das xenogene Modell. Das Ergebnis ähnelte einem Mangel an Thrombomodulin, der zu einer Thrombophilie mit Infarktneigung führt.
Mehr anzeigen

122 Mehr lesen

Hämodynamisches Monitoring mittels transpulmonaler Thermodilution in der 
präklinischen kardialen Xenotransplantation

Hämodynamisches Monitoring mittels transpulmonaler Thermodilution in der präklinischen kardialen Xenotransplantation

Bei der humanen Allotransplantation besteht im Zuge von postmortal gespendeten Organen die Gefahr einer Übertragung von infektiösen Keimen, wie das Cytomegalievirus oder das Epstein-Barr Virus (19). Im Rahmen der Xenotransplantation wird in einigen Studien die Übertragung von PERV (porcine endogene Retroviren) auf den Menschen diskutiert. Das porcine Retrovirus ist im Genom jeder porcinen Zelle vorhanden; somit ist das Virus vergleichbar mit dem humanen endogenen Retrovirus (HERV), welches in jeder humanen Zelle vorkommt (19, 23). In ihrem Wirt verursachen die Viren keinen Schaden, dennoch wird die Möglichkeit diskutiert, dass PERV oder PERV-Elemente mutieren und sich im Anschluss mit HERV kombinieren können und so ein neues für den Menschen oder Schwein potentiell pathogenes Virus entstehen lassen (19). Dazu gibt es bislang jedoch keine Studien und Daten, die dieses Szenario eindeutig belegen würden (19, 23, 33, 39). Neben PERV wird auch die Übertragung weiterer Viren, wie zB. PCMV (porcines Cytomegalivirus) und PCV (porcines Circovirus) diskutiert (40, 41). Weder für PCMV noch für PCV konnte gezeigt werden, dass humane Zellen infiziert und geschädigt werden könnten. Die Möglichkeit der Übertragung anderer mikrobiologischer Erreger (Xenozoonis) im Rahmen der Transplantation ist denkbar (6). Dies kann aber durch die Transplantation erregerfreier Organe verhindert werden. Für eine klinische Anwendung der Xenotransplantation sollen daher nur Spendertiere aus keimarmer, auf relevante Erreger überwachte, Haltungen verwendet werden (6).
Mehr anzeigen

169 Mehr lesen

Establishment of BAC-targeting in porcine primary cells

Establishment of BAC-targeting in porcine primary cells

As the initial focus, to modify livestock for agricultural purpose, such as growth performance, feed efficiency and body composition (Pursel, 1998), lactation performance (Zuelke, 1998), reproduction, disease resistance and immune responsiveness (Muller et al., 1998) does not meet the expectations, large animals came in a tighter focus for alternative areas. Especially the pig, due to indications like physique, the ability to standardize the environmental situation (housing, feeding, and sanitation standard), the well established reproductive technology and advanced techniques of genetic modification of the porcine genome, represents an ideal model organism for both, human diseases and xenotransplantation (Aigner et al., 2010). Several different technologies to produce transgenic animals, primarily developed in the mouse, such as pronuclear microinjection (PMI) (Gordon et al., 1980), sperm-mediated gene transfer (SMGT) (Lavitrano et al., 1989) or viral gene transfer (Jaenisch et al., 1976), were later on adapted to livestock (Brem et al., 1985; Hofmann et al., 2003; Kurome et al., 2006). In mice the main disadvantages arising from those methods, reported as random, partially multicopy integration of the transgene, insertional mutagenesis, positional effects, oncogene activation, low integration efficiencies or offspring mosaicism (Wheeler, 2003) have been partially bypassed with the establishment of murine embryonic stem cells (ESCs) (Evans et al., 1981; Martin, 1981) and the development of strategies to genetically modify them (Kuehn et al., 1987). In order to circumvent the lack of porcine ESCs, an alternative method, termed somatic cell nuclear transfer (SCNT), has become an indispensable tool to generate large animal models from genetically modified somatic cells (Campbell
Mehr anzeigen

160 Mehr lesen

Deleting PERV C infectious potential from donor pigs for xenotransplantation

Deleting PERV C infectious potential from donor pigs for xenotransplantation

V. Discussion 74 porcine genome with a not yet determined tropism, as the PCR amplifies a stretch from the receptor binding domain (RBD) (ARGAW et al., 2008; ARGAW & WILSON, 2012) of the env gene. At the present time point, however, it is even unclear if the proposed new subfamily is even replication competent, as the respective Gene bank sequences do only comprise the env gene. In this context, it is of note that the quality of the pig reference genome is still not fully satisfactory. For the 11 identified PERV C integration sites the annotation of the nearest genes did not differ between the initial poor quality version 10.2 and the improved version 11.1. This is particularly true for the gene edited provirus at chr1:41Mb. The comparison of exon definition in the pig genome with BLAST matches of the corresponding human and bovine cDNA sequences further confirmed the characterization of the PERV integration sites. Despite there is evidence that there are some additional, not yet characterized PERV C proviruses in any pig breeding herd, here I further demonstrate that PERV C can be removed effectively from donor pigs through selective breeding. However, the maintenance of the PERV C free animal status is an interesting aspect, because the young age of PERV C in the pig genome suggests that proviruses might still be active. New integration can therefore not be excluded, if PERV C free animals are maintained in a facility together with PERV C positive pigs. At best, de novo infections might be prevented by maintaining PERV C free pigs in a PERV C free stable.
Mehr anzeigen

117 Mehr lesen

Provision of safe donor pigs for xenotransplantation

Provision of safe donor pigs for xenotransplantation

While most of these pathogens are sufficiently controlled by housing animals within barrier facilities and thus protecting them from exogenous infections, porcine endogenous retroviruses (PERVs) are a more precarious issue as they can be transmitted via the germline. Consequently, PERVs have caused considerable concern for clinical xenotransplantation. But to date there has been no report of PERVs being actually transmitted to the recipient of a xenograft or having caused detectable adverse reactions within a transplant 10 . Recent successes in eliminating PERVs from the genome of pig lines have further diminished this potential hazard 11,12 . Other pathogens, however, provoke lifelong, latent, transmittable infections, and are prevalent in most, if not all, pig populations and are thus difficult to control. These include the porcine cytomegalovirus (PCMV), a β-herpesvirus related to the human cytomegaloviruses that causes systemic disease and potentially leads to graft failure in human allotransplantation 13 . In xenotransplantation, the PCMV has also been associated with transplant injury. This has been largely attributed to virus activation within the graft following transplantation but initially was not thought to cause invasive disease in the recipient 14,15 . It is still unclear whether PCMV can infect human cells, with one in vitro study suggesting the possibility 16 and a different study presenting evidence for the opposite 17 . There are indications that while in vitro PCMV appears susceptible to standard antiviral medication comparable to that employed in allotransplantation 18 , in vivo data from pig-to-baboon xenotransplantation suggest that the commonly used ganciclovir has no therapeutic efficacy against PCMV at standard doses 19 . Agents that do prevent or treat PCMV infection effectively, such as foscarnet or cidofovir, carry significant toxic potential for the transplant recipient and are thus of limited usefulness. Consequently, there is consensus that potential donor animals for xenotransplantation should be free of PCMV.
Mehr anzeigen

158 Mehr lesen

Gene expression of inflammation markers in cardiac xenotransplantation

Gene expression of inflammation markers in cardiac xenotransplantation

Hyperacute rejection is the first immunologic barrier for transplantation between human or NHP and pig. It starts immediately when the pig coronary arteries are perfused by primate blood. The graft is destroyed within 24 hours, but often even within the first hour: primate blood contains "natural" anti-pig antibodies that bind the vascular endothelial cells of the pig heart and activate the complement cascade. This leads to immediate injury of the endothelium, which causes thrombosis in vessels and edema that disrupts the function of the endothelium and heart within minutes [10]. The rejection is caused by the interaction between a carbohydrate epitope, galactose-α1,3-galactose (Gal), from porcine endothelial cells and antibodies present in the primate blood[11]. During neonatal life of all primates, these antibodies develop and are probably a reaction to micro-organisms that colonize the gastrointestinal tract [12, 13]. This response is similar to that in ABO-incompatible allotransplantation rejections [14].
Mehr anzeigen

62 Mehr lesen

Charakterisierung, Wirtsbereich und Diagnostik  Porciner Endogener Retroviren (PERV) im Rahmen  der Xenotransplantation

Charakterisierung, Wirtsbereich und Diagnostik Porciner Endogener Retroviren (PERV) im Rahmen der Xenotransplantation

Die Expression von Viruspartikeln aus Schweinegewebe ist Voraussetzung für die Infektion eines Transplantatrezipienten. Bereits mehrfach wurde in vitro die Freisetzung von für huma- ne Zellen infektiösen Partikeln aus PBMC und Endothelzellen von Schweinen nachgewiesen (Akiyoshi et al., 1998; Martin et al., 1998a; Wilson et al., 1998). Auch im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß PBMC in vitro nach Stimulation mit Mitogenen transient geringe Mengen von PERV bilden können. Dabei wurden auch die Stimulationsbedingungen variiert. Darunter waren auch Bedingungen, bei denen PERV von adhärenten, makrophage- nähnlichen Zellen produziert wurde. Eine gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) von hu- manen und porcinen PBMC reicht jedoch nicht aus. Diese Ergebnise wurde durch die RT- PCR-Untersuchungen bestätigt. Ein Nachweis der Expression mittels Immunfluoreszenz war allerdings ebensowenig möglich wie eine Typisierung der adhärenten Zellen durch Antikörper gegen verschiedene Oberflächenantigene. Im ersten Fall lag vermutlich die Expression unter- halb des Detektionslimits der Methode. Im zweiten Fall ließ sich aufgrund der geringen Zahl von zur Verfügung stehenden Antikörpern gegen porcine Oberflächenantigene keine Aussage treffen.
Mehr anzeigen

118 Mehr lesen

Virus safety of xenotransplantation and  porcine endogenous retroviruses (PERVs)

Virus safety of xenotransplantation and porcine endogenous retroviruses (PERVs)

to amplify the PERV-B(33) backbone in two steps leaving four homologous regions to be ligated during Gibson assembly. Amplification of fragments was successful and clear bands were observed as seen in figure 3.20. However efforts have so far been unsuccessful to assemble the various fragments after gel extraction via Gibson assembly. Possible reasons could be in the degradation of DNA over time, as these fragments were not used immediately. Another reason may be a too short extension period for the long (6 kb) amplicon. This may result in variable-length fragments that could be observed as slightly thicker bands on a 1 % agarose gel (Figure 3.20). At last, genetic material recovered may have been contaminated with salts or other organic compounds due to the elution process from the agarose gel. To circumvent this possibility in the future and to improve cloning efforts, a DpnI digest could be used to digest methylated template DNA only leaving intact amplicons. This is possible, as no extra bands were obtained. The resulting solution could then be cleaned via PCR-clean up kit (Invisorb ® DNA CleanUp A.5) to minimize the effect of residual ethanol and salts for downstream applications. It seems that a viable system was found to bypass the problem, with all tools in place to create a replication competent clone, provided the constructs given allow for proper assembly of the virus. Similarly the production of protein expression vectors, wild type and mutated, has revealed additional problems, such as long length amplicons and good efficiency in terms of protein secretion. The employment of a well functioning site-directed mutagenesis technique as well as the proper incorporation of the mutated fragments into the expression vector is crucial for success. Additionally, Env contains a transmembrane domain, which anchors the protein within the membrane of a cell, making it impossible to isolate sufficient amounts of Env from the supernatant of cells in cell culture(Figure 2.3). In order to prevent this from happening the env gene needed to be truncated in a way that it’s transmembrane domain was cleaved out and it could be readily secreted from the cell. Otherwise only harvesting of cell-lysate, which contains remnants of cellular debris, would have been possible. Such debris (e.g. fibrinogen and heparan sulfate) may be a reason for false readings when conducting IL-10 assays as it can also trigger TLR4 [54, 55].
Mehr anzeigen

94 Mehr lesen

The porcine virome and xenotransplantation

The porcine virome and xenotransplantation

As described in the abstract, the pig virome is the total amount of viruses in and on the pig body and includes also the endogenous retroviruses. Initial attempts to ana- lyse the porcine virome were undertaken using samples of the gut or faeces. These studies were started to better understand the reasons for neonatal porcine diarrhoea, a common problem worldwide that contributes to mor- bidity and mortality among piglets [6]. Although investi- gations of the porcine intestinal virome are so far limited [7–9], samples from the distal jejunum of 19 healthy pigs in a Swedish conventional herd yielded eight different viral families (Table 1). The most com- mon were picornaviruses, followed by circoviruses [10]. Viral infections were already observed 24 to 48 h after birth, indicating infection immediately post-partum, or alternatively, transplacental infection. Similar results were obtained when Chinese pigs were analysed [7] where, in addition to the viruses identified in Sweden, the coronaviruses transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) were found (Tables 2 and 3). In this study, the virus
Mehr anzeigen

7 Mehr lesen

Porcine endogene Retroviren und  Xenotransplantation:  Evaluierung des Infektionsrisikos und Strategien zur  Hemmung der Virusreplikation mittels  RNA-Interferenz

Porcine endogene Retroviren und Xenotransplantation: Evaluierung des Infektionsrisikos und Strategien zur Hemmung der Virusreplikation mittels RNA-Interferenz

Da trotz aller bislang durchgef¨ uhrten in vitro und in vivo Versuchsans¨atze zur Risiko- evaluierung der PERV Transmission kein absolute Sicherheit bei der Xenotransplantation gew¨ahrleistet werden kann, wurde in diesem zweiten Teil der Arbeit versucht, die PERV Freisetzung durch neue molekularbiologische Methoden zu inhibieren. In der Vergangen- heit war man bei dem Versuch, endogen exprimierte Proteine zu inhibieren, auf aufwen- dig durchzuf¨ uhrende Gen-Knockouts beschr¨ankt (Reviews, siehe [Mueller, 1999, Gong and Rong, 2003]) Diese genetischen Manipulation k¨onnen durchgef¨ uhrt werden, wenn das zu hemmende Gen in einfacher oder doppelter Ausf¨ uhrung im Genom lokalisiert ist. Bei den porcinen endogenen Retroviren stellt sich jedoch das Problem, dass etwa 50 unterschied- liche Integrationsorte im Genom des Schweins verankert sind [Bosch et al., 2000, Herring et al., 2001]. Obwohl viele dieser Provirus-Sequenzen mutiert oder deletiert sind und daher nicht f¨ ur die Expression intakter Viren zur Verf¨ ugung stehen, kann dennoch nicht v¨ol- lig ausgeschlossen werden, dass es durch homologe Rekombination dieser Sequenzelemente zur Komplementation intakter Virusgenome kommen kann. Andere Arbeitsgruppen ver- suchten daher durch konventionelle Zuchtmethoden Schweine heranzuziehen, die in ihrem Genom keine Variante des humanotropen PERV-A/C Subtyps enthalten [Oldmixon et al., 2002]. Diese Schweine setzen nach Angaben der Autoren keine humanotropen PERV Virio- nen frei. Allerdings konnte k¨ urzlich gezeigt werden, dass selbst porcine Zellen, die in ihrer genomischen DNA keine proviralen Sequenzen f¨ ur humanotrope replikationskompetente PERV-A/C Rekombinanten enthalten, in der Lage sind, nach Rekombination derartige Vi- rionen zu exprimieren, die dann humane Zellen infizieren k¨onnen [Scobie et al., 2004,Wood et al., 2004].
Mehr anzeigen

177 Mehr lesen

Xenotransplantation: Reduction of the risk of transmission of porcine endogenous retroviruses (PERV)

Xenotransplantation: Reduction of the risk of transmission of porcine endogenous retroviruses (PERV)

Non-human primates (NHPs: chimpanzee, gorilla, baboon) are phylogenetically the closest to human and show anatomical, physiological and immunological similarities and thus present the obvious choice as donor animals for xenotransplantation. Despite the fact that the only successful organ transplantation was a primat-to-human transplantation of kidney [19], they were ruled out from xenotransplantation for several reasons: (i) Ethical approaches were raised because of their superior intelligence degree and the physiological and behavioral features similar to humans and which implies that NHPs can suffer like humans [28, 29]. (ii) Most of NHPs species are threatened with extinction and have long gestation periods and low number of offspring. (iii) Concerns were also raised regarding the safety of the process since most of NHPs harbor several pathogens which may be infectious for human considering the similarity of the immune systems among the primates. The most striking example presents the evolutionary studies that suggested a cross-species transmission of the simian immunodeficiency virus (SIV) from chimpanzee (SIVcpz) and sooty mangabey (SIVsm) which generated the human immunodeficiency virus types 1 and 2 (HIV-1 and -2) [30]. Furthermore, baboons harbor several exogenous and endogenous retroviruses such as simian foamy viruses (SFV), simian T-cell lyphotropic virus (STLV), baboon endogenous virus (BaEV) and simian endogenous retrovirus (SERV) which may be transmitted to humans [31].
Mehr anzeigen

149 Mehr lesen

The shock response of a rendered porcine fat

The shock response of a rendered porcine fat

␯ = 0.49兲, further reinforce the suggestion that the bulk sound speed of the rendered porcine fat tested here should be lower than the linear-fit value of c 0 = 1.58 mm / ␮ s. The main mechanism proposed to explain curvature of the U s -u p Hugoniot at lower particle velocities involves two stages: 共1兲 primary reduction in the spaces between the poly- meric chains, due to the existence of weak van der Waals forces, before; 共2兲 secondary compression of the backbone carbon chain. Although this mechanism is arguably appli- cable to polymers in general, Carter et al. 16 discussed the existence of phase changes within certain polymeric materi- als at low pressures and how these could also account for such observations. Further, other theories describing this be- havior in polymers also exist, such as the elastic-plastic flow model, 36 which predicts extreme curvature of the Hugoniot at low particle velocities. Consequently, the inclusion of the data-point corresponding to an impact velocity of 39 m/s, suggesting slight-curvature in the Hugoniot of the adipose material at low particle velocities, supports evidence that the material possesses structural similarity to simple polymers.
Mehr anzeigen

10 Mehr lesen

Show all 10000 documents...

Verwandte Themen