Receptors G-Protein-Coupled/metabolism

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Discovery and characterization of bioactive peptides from nature as novel ligands for G protein-coupled receptors / submitted by Johannes Köhbach

Discovery and characterization of bioactive peptides from nature as novel ligands for G protein-coupled receptors / submitted by Johannes Köhbach

The majority of bioactive plant constituents known to date are small organic molecules arising from secondary metabolism. This includes essential oils, alkaloids, saponins, terpenes, phenylpropanes or polyketides, only to name a few (Teuscher et al, 2004). Though, plants also contain a range of gene-encoded peptides that have been recently studied in drug discovery and development efforts. Their main functions can be roughly divided into two groups, i.e. peptides that affect plant signaling and peptides involved in defense mechanisms (Farrokhi et al, 2008). In particular antimicrobial peptides have been ascribed in numerous species, indicating a fundamental role of these peptides in the innate defense machinery of plants. Typically these peptides contain multiple cysteine residues and are classified based on the number of disulfide-bonds and inter-cysteine sequence lengths (Lay & Anderson, 2005). Accordingly the presence of disulfide-bridges confers these peptides well-defined three-dimensional structures. In the context of evolution it is interesting that these peptides display further structural motifs, e.g. the cystine-stabilized αβ-motif, which is also found in venom peptides (Fant et al, 1998; Gurrola et al, 2012). Similar to bacteria (Montalban-Lopez et al, 2012) or mammals (Lehrer et al, 2012) some plants contain peptides with the unique feature of a cyclized backbone. This notably increases peptide stability as compared to their linear counterparts (Craik, 2006). Beside peptides lacking disulfide bonds such as orbitides (Arnison et al, 2013), circular and disulfide-containing are of particular interest. This includes trypsin-inhibitors from sunflower seeds (SFTI) (Korsinczky et al, 2001; Luckett et al, 1999), trypsin-inhibitors found in Momordica
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Identification of candidate G protein–coupled receptors : role of purinergic receptor P2Y2 in pulmonary arterial hypertension

Identification of candidate G protein–coupled receptors : role of purinergic receptor P2Y2 in pulmonary arterial hypertension

monoclonal expansion of endothelial cells has been found in IPAH [28]. In IPAH, there is evidence pointing towards the instability of short DNA microsatellite sequences within plexiform lesions [29]. Somatic chromosome abnormalities have been reported in the lungs of PAH patients, and in cultured cells from those individuals [30]. Pulmonary endothelial cells and vascular SMCs derived from PAH patients maintain their abnormal hyper- proliferative, apoptosis-resistant phenotype for a longer time than control cells when removed from their in-vivo environment [31-33]. More recently, pulmonary vascular cells derived from PAH patients exhibited an altered energy metabolism in situ and in vitro [34- 39]. However, there crucial differences between PAH pathogenesis and carcinogenesis (Figure 2) [40, 41]. In PAH, neither invasion nor metastasis has been observed. Inspired by the cancer-like concept, researchers recently tested certain anti-proliferative and/or oncological drugs, typically used in the treatment of cancer, in PAH patients [42-46]. Tyrosine kinase inhibitors, such as imatinib, have been demonstrated to have potential benefits in PAH patients, but severe side effects raise many concerns regarding their use in clinical practice [48, 49]. Therefore, the nature of the similarities and differences between PAH pathogenesis and carcinogenesis needs further clarification [7].
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3-Iodothyronamine and its role in aminergic G-protein coupled receptor signaling and neuromodulation

3-Iodothyronamine and its role in aminergic G-protein coupled receptor signaling and neuromodulation

Thyroid hormones (TH) accompany one‘s entire life. They regulate a wide range of biological pro- cesses associated with development, metamorphosis, and metabolism. THs are evolutionary con- served and vertebrate, as well as a large number of invertebrates, respond to them. Virtually all species, from plants, fungi, bacteria, and mammals can convert naturally occurring iodate to iodine. From there, the essential molecules of thyroid hormones, mono- and diiodotyrosine (MIT, DIT), can spontaneously form THs (Nishinaga et al., 1968; Cahnmann and Funakoshi, 1970). In vertebrates, 3,5,3’-triiodothyronine (T 3 ) and 3,5,3’,5’-tetrathyrosine (T 4 ) are synthesized in the thyroid gland. They mainly act through genomic signaling involving the binding of their nuclear receptor to control gene expression directly. T 3 and T 4 can be further metabolized to active and inactive molecules, like thyronamines (TAM, Piehl et al. 2011). These TH metabolites induce amongst other pathways non-genomic signaling through G-protein coupled receptors (GPCRs). The TAM 3-iodothyronamine (T 1 AM) has been the focus of research as it rapidly reduces the body temperature without side effects (Scanlan et al., 2004). Therefore T 1 AM evokes interest to transfer this hypothermic effect from rodents to human emergency medicine. However, the underlying molecular mechanism is not completely understood. Furthermore, T 1 AM acts centrally in rodents, but the exact brain loci remain subject to speculation (Gachkar et al., 2017). As T 1 AM is a promiscuous ligand for aminergic GPCRs, I would like to enlighten in this thesis if serotonin and histamine GPCRs may play a role in T 1 AM-induced hypothermia.
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Aggregation and post-translational modification of the parathyroid hormone and its agonistic activity towards the G-protein coupled PTH receptors

Aggregation and post-translational modification of the parathyroid hormone and its agonistic activity towards the G-protein coupled PTH receptors

Parathyroid hormone is an 84 amino acid single-chain polypeptide, plays a major role in calcium metabolism by its interaction with PTH1R. Intact PTH has been licensed to treat osteoporosis and it is commercially available in Europe (Preotact ® ; owned by Ny- comed, Denmark). This drug was approved by European medical agency in 2006 (Pie- trogrande 2009), but pending for FDA approval (in phase III clinical trials). The N- terminal 34 amino acid residues are biologically active, while the role of C-terminal region of PTH (1-84) is currently unknown. However, a large portion of the C-terminus of intact PTH is highly conserved across mammalian species. This strongly suggests the possibility of additional, independent biological functions (Murray et al. 2005). Fur- thermore, the bound conformation of PTH (15-34) or PTH (1-34) to the nPTH1R yield- ed poor NMR spectra (broad peaks) caused by the intermediate exchange which hinders the access to structural details about the bound state. To elucidate the mechanism of PTH (1-84) interaction to the nPTH1R, in more detail, the role of C-terminal PTH (1- 84) to the binding CD, ITC, and NMR experiments were performed. Recombinantly produced full length PTH and nPTH1R were used for these experiments.
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OPUS Würzburg | Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptorkinasen

OPUS Würzburg | Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptorkinasen

Zur “Downregulation” kommt es z.B., wenn nach Internalisierung der Rezeptor nicht wieder durch Recycling an die Zelloberfläche zurück gelangt, sondern in lysosomalen Kompartimenten abgebaut wird. Im allgemeinen erfolgt die Internalisierung von GPCRs nach Bindung von Arrestin an den aktivierten Rezeptor. Arrestin akkumuliert den Rezeptor in “Clathrin-coated-pits”. Dieser Hauptmechanismus wird von den meisten GPCRs benutzt. Allerdings gibt es auch hier Ausnahmen. So ist für den muskarinischen M2-Rezeptor gezeigt, dass er sowohl Clathrin- als auch Arrestin- unabhängig internalisiert (Werbonat et al., 2000). Der 5-HT 2A -Serotonin-Rezeptor benötigt zwar Clathrin, aber kein Arrestin zur Internalisierung (Bhatnagar et al., 2001). Die Internalisierung läuft im Gegensatz zur Desensibilisierung wesentlich langsamer ab. Ihr Maximum erreicht sie abhängig vom jeweiligen Rezeptorsystem nach Minuten bis Stunden. Die Faktoren, die für die Unterscheidung zwischen Recycling und lysosomalem Abbau verantwortlich sind, sind gerade in letzter Zeit intensiv untersucht worden. So wurde für den δ-Opioidrezeptor ein Protein identifiziert, das dessen Recycling fördert (GASP, G-protein-coupled receptor-associated sorting protein (Whistler et al., 2002)). Für den β 2 -Rezeptor wurde ein ähnliches Prinzip entdeckt, das durch Phosphorylierung mit GRK5 blockiert werden kann (Cao et al., 1999). Dieses Prinzip wurde allerdings in neueren Veröffentlichungen wieder angezweifelt (Millman et al., 2004). Voraussetzung für das Recycling der GPCRs ist einerseits das Dissoziieren des Liganden, das vermutlich durch das saure Milieu der Vesikel hervorgerufen wird (Krueger et al., 1997), sowie die Dephosphorylierung des Rezeptors. Hierfür wurde die Phosphatase vom Typ 2A identifiziert, die wahrscheinlich den Rezeptor nach Konformationsänderung durch das Dissoziieren des Liganden erkennt (Pitcher et al., 1995a).
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Total synthesis of marine and terrestrial natural products and development of novel photochromic ligands for ion channels, G-protein coupled receptors and cytoskeletal proteins

Total synthesis of marine and terrestrial natural products and development of novel photochromic ligands for ion channels, G-protein coupled receptors and cytoskeletal proteins

The aqueous phase was extracted with EtOAc, the combined organic phases were washed with aqueous HCl (1 M ), saturated aqueous NaHCO 3 and brine, dried over. MgS[r]

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Role of Orphan G-protein-coupled receptor GPRC5B in smooth muscle contractility and differentiation

Role of Orphan G-protein-coupled receptor GPRC5B in smooth muscle contractility and differentiation

binding functions, including recognition and interaction with the cyclopentane ring of prostacyclin [207], the transmembrane domain I also contains a dimerization motif [206]. Despite lack of information about GPRC5B dimerization, several studies suggest that the prostacyclin receptor can form dimers [208, 209]. Detailed experiments done by co-immunoprecipitation of differentially tagged IP in COS-7 cells demonstrate that the IP receptor can homodimerize and this depends on disulfide bonds between cysteines in different locations [210]. Furthermore, co-expression of a dysfunctional IP that is retained in the endoplasmic reticulum (ER) (IP(R212C) [211] exerted a dominant action on the wild type IP, leading to ER retention of the wild type receptor [212]. All these findings suggest homodimerization as a prerequisite for proper IP receptor trafficking. In line with this notion we found that the presence of GPRC5B decreases the ability of the IP receptor (as monomer or dimer) to traffic to the plasma membrane possible by GPRC5B/IP heterodimerization which restricts IP homodimerization. In support, we found that both receptors are expressed and colocalize in the plasma membrane and cytosol. In contrast to class C, A-class GPCRs are believed to dimerize through their transmembrane domain, however the structural motifs and specific sites mediating dimerization, are not clear [208, 209]. Likewise, it is still unknown if GPRC5B/IP interaction is ligand-dependent or -independent. In fact, our current findings show that GPRC5B and IP interact without exogenous ligand. Such result opens the possibility that SMC- autonomous ligands play a role, either SMC-produced prostacyclin [119, 152] or a yet unknown autocrine activator of GPRC5B.
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Der Stammzellmarker LGR5 (Leucine-Rich Repeat G-protein Coupled Receptor 5) übernimmt keine tumortreibende Funktion in der kolorektalen Karzinogenese

Der Stammzellmarker LGR5 (Leucine-Rich Repeat G-protein Coupled Receptor 5) übernimmt keine tumortreibende Funktion in der kolorektalen Karzinogenese

Eine   weitere   Schwachstelle   in   den   experimentellen   Systemen   stellt   der   fehlende   Nachweis   einer   Verringerung   der   LGR5-­‐Expression   auf   Proteinebene   dar.   Da   mit   keinem   der   bislang   kommerziell   verfügbaren   Antikörper   die   Etablierung   eines   LGR5-­‐ spezifischen   Western   Blots   gelang,   konnte   dieser   experimentelle   Ansatz   nicht   durchgeführt  werden.  Dies  kann  zum  einen  daran  liegen,  dass  Tumorzellen  nur  geringe   Mengen  an  LGR5-­‐Protein  exprimieren  (Barker  2008,  Barker  2007),  zum  anderen,  dass   es   schwierig   ist,   Antikörper   zu   entwickeln,   die   denaturiertes   LGR5-­‐Protein   erkennen   können.   Denn   in   FACS   Analysen   -­‐   also   nativem   LGR5   Protein   -­‐   scheinen   LGR5   spezifische   Antikörper   zumindest   bei   ausreichender   Expression   von   LGR5   zu   funktionieren  (Kemper  2012).  Umgekehrt  ist  es  daher  sehr  kritisch  zu  betrachten,  ob   die  bisherigen  veröffentlichten  Ergebnisse  zur  LGR5  Expression  in  fixiertem  humanem   Gewebe  (Fan  2010,  Kleist  2011,  Uchida  2010)  stimmen.  Somit  sind  bisher  kaum  valide   Daten   aus   humanen   kolorektalen   Tumoren   bekannt,   die   als   Grundlage   für   die   Einordnung  der  Relevanz  von  in  vitro  Daten  eingesetzt  werden  könnten.  
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Untersuchungen zur G-Protein Interaktion der Variante G beta 3s mit G gamma-Untereinheiten

Untersuchungen zur G-Protein Interaktion der Variante G beta 3s mit G gamma-Untereinheiten

Im inaktiven Zustand trägt die Gα-Untereinheit ein Molekül GDP und bildet mit dem Gβγ-Dimer das bereits erwähnte heterotrimere G-Protein. Dieses Heterotrimer ist in der Lage, mit heptahelikalen Rezeptoren zu interagieren. Nach gängiger Auffassung wird die Spezifität dieser Rezeptor - G-Protein Interaktion durch die Zusammensetzung des Heterotrimers bestimmt. Mechanistisch betrachtet, stabilisiert dabei das Gβγ-Dimer die Wechselwirkung der Gα-Untereinheit mit dem Rezeptor (Neer, 1995). Wenn es zu einer Aktivierung des heptahelikalen Rezeptors durch Bindung eines spezifischen Liganden kommt, führt dies zu einer Konformationsänderung des Rezeptors, die sich auf ein interagierendes G-Protein im GDP-Zustand überträgt. Die Gα-Untereinheit öffnet ihre Bindungstasche, GDP dissoziiert und sein Platz wird von GTP eingenommen, das in der Zelle in einer wesentlich höheren Konzentration als GDP vorkommt. Die Bindung von GTP an die Gα-Untereinheit führt zu einer weiteren Konformationsänderung, die der Aktivierung der Gα-Untereinheit entspricht (GTP-Zustand). In diesem Zustand verliert die Gα- Untereinheit ihre Affinität für den Rezeptor und die Gβγ-Untereinheit, so dass es zu einem Zerfall des Multiproteinkomplexes kommt. Die aktivierte Gα-Untereinheit ist in der Lage, spezifische Effektoren – wie z.B. Adenylylzyklasen oder Isoformen der Phospholipase C (PLC) – zu stimulieren. Dabei erfolgt die Interaktion der aktivierten Gα-Untereinheit mit den genannten Effektoren überwiegend über Kontaktpunkte, die im Heterotrimer durch das Gβγ-Dimer blockiert sind. Das in diesem Szenario frei gewordene Gβγ-Dimer ist ebenfalls in der Lage Gβγ-abhängige Effektoren zu regulieren. Solche Effektoren umfassen u.a. Isoformen der PLC, bestimmte Kaliumkanäle, Rezeptorkinasen oder die MAP-Kinasen Kaskade (Logothesis et al., 1987; Katz et al., 1992; Crespo et al., 1994; van Biesen et al., 1996; Faure et. al, 1994). Zeitlich begrenzt wird dieser Aktivierungszustand durch die intrinsische GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit, die zu einer Hydrolyse des gebundenen GTP führt (Gilman, 1987). Hierdurch nimmt die Gα-Untereinheit wieder ihren GDP- Zustand ein und ist in der Lage mit einem Gβγ-Dimer wieder ein Heterotrimer zu bilden. Da auf diese Weise ein G-Protein mehrfach aktiviert werden kann und ein Rezeptor mehrere G-Proteine aktivieren kann, kommt es zu einer frühen Amplifikation des Signals.
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Mitogenic signaling by Gq/11-coupled receptors

Mitogenic signaling by Gq/11-coupled receptors

The exact mechanism and regulation of growth factor release resulting in EGFR transactivation is not fully understood. EGFR ligands are initially synthesized as membrane-bound precursor proteins which are subsequently processed by metalloproteinase activities yielding a secreted product. Conversion of insoluble precursors to soluble factors by enzymatic cleavage may constitute an important post-translational modification regulating growth factor activity and availability (Goishi 1995, Sunnarborg 2002). In CHO cells, for instance, shedding of membrane- anchored HB-EGF can effectively be induced by phorbolesters and subsequent PKC activation. However, the shedding process appears to be regulated by ERK, and time course experiments indicated that TPA/PKC-induced ERK activation precedes HB- EGF release (Gechtman 1999). In gonadotropic cells examined by us, however, MT1-MMP secretion, gelatinase activation and HB-EGF shedding is a rapid process whose time course concurred with that of GnRH-dependent Ras and ERK activation. Here, we directly show for the first time MT1-MMP secretion and gelatinase activation as an immediate response to occupation of a G q/11 -coupled receptor by its agonist. Protein levels of active gelatinases in conditioned media were found to be elevated within 5 min of GnRH stimulation together with migration of MT1-MMP from cells to the cell culture media. Furthermore, gelatin zymography carried out with conditioned media of αT3-1 cells demonstrated increased MMP2 enzyme activity following short-term stimulation of cells with GnRH.
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Phosphorylated peptide of G protein-coupled receptor induces dimerization in activated arrestin

Phosphorylated peptide of G protein-coupled receptor induces dimerization in activated arrestin

proteincoupled receptor induces dimerization in activated arrestin Andreas M. Stadler 1,2 , Joachim Granzin 3 , Anneliese Cousin 3 & Renu Batra‑Safferling 3* Termination of the Gproteincoupled receptor signaling involves phosphorylation of its C‑terminus and subsequent binding of the regulatory protein arrestin. In the visual system, arrestin‑1 preferentially binds to photoactivated and phosphorylated rhodopsin and inactivates phototransduction. Here, we have investigated binding of a synthetic phosphopeptide of bovine rhodopsin (residues 323–348) to the active variants of visual arrestin‑1: splice variant p44, and the mutant R175E. Unlike the wild type arrestin‑1, both these arrestins are monomeric in solution. Solution structure analysis using small angle X‑ray scattering supported by size exclusion
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Role of PKC in the desensitization and crosstalk of G protein coupled receptors in the control of neuronal ion channels / by Kristina Kosenburger

Role of PKC in the desensitization and crosstalk of G protein coupled receptors in the control of neuronal ion channels / by Kristina Kosenburger

the mAChRs are members of the metabotropic or G protein coupled receptors. Molecular cloning studies could show the existence of five different mammalian mAChRs named M 1 -M 5 (Caulfield and Birdsall, 1998). The M 1 -M 5 receptors can be subdivided regarding their coupling to different G proteins. The M 1 , M 3 and M 5 receptors selectively cou- ple to G proteins of the G q /G 11 family, the other ones M 2 and M 4 activate G i /G o type G proteins (Wess, 1996; Caulfield and Birdsall, 1998). Each of these five subtypes has a specific expression pattern. The M 1 and M 4 subtypes are preferentially expressed in the CNS, whereas the M 2 and M 4 are found in the CNS as well as in peripheral tissues (Abrams et al., 2006; Volpicelli and Levey, 2004). In the past a variety of substances like atropine, pirenzepine, himbacine, oxotremorine M, etc. have been tested, but un- fortunately none of these substances succeeded to show a high selectivity for one special subtype. Different subtypes can only be discriminated from each other by using a series of, not a single, subtype preferring antagonists (Caulfield and Birdsall, 1998). The same is true for agonists at muscarinic receptors. The problem increases, because most tis- sues or cell types express multiple mAChRs. The way out was to generate mutant mice deficient in one or more mAChR subtypes. There is evidence that M 1 mAChRs might mediate many of the cognitive enhancing effects of Ach (Messer, 2002; Fisher et al., 2003; Caccamo et al., 2006). The M 1 receptor is predominately expressed in higher brain areas, implicating to be involved in cognitive processes (Volpicelli and Levey, 2004). Studies showed that the M 2 mAChR subtype plays a key role in the regulation of heart rate, in the way that it serves to mediate pacemaker activity and atrioventricular conduction (Caulfield, 1993; Dhein et al., 2001; Harvey and Belevych, 2003). Besides its involvement in the heart rate the M 2 receptor subtype plays a key role in temperature control, in the regulation of movement control and of pain responses (Gomeza et al., 1999). Be- sides their expression in the periphery M2 receptors are also distributed throughout the brain (hippocampus, cortex, basal forebrain, thalamus). Knockout mice of M 2 receptors showed pronounced deficits in certain cognitive tasks and hippocampal synaptic plasticity (Seeger et al., 2004).
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Defining the role of G-coupled protein receptor Gpr56 in acute myeloid leukemia

Defining the role of G-coupled protein receptor Gpr56 in acute myeloid leukemia

protease inhibitors. Cells were snap frozen in liquid nitrogen, thawed on ice, and then vortexed for 2min. The cell lysate was centrifuged at 1600xG for 20min and supernatant was removed and stored at -80°C. Protein concentration was determined by the Bradford method using Protein assay dye reagent, measuring the absorbance on a spectrophotometer at 595nm, and comparing it against a BSA protein standard curve. 50ug of protein was separated on a 10% SDS/PAGE layered with a 5% stacking gel along with a protein ladder and separated at 100V for 1hr. The protein was transferred onto a PVDF membrane using a semi-dry transfer apparatus at 300mAmp for 50min. The blot was blocked for one hour with 5% milk and then probed overnight with Anti-GPR56 (clone H11, Millipore) or - actin. Excess antibody was removed by washing the membrane 3x with TBS-T buffer and then the blot was incubated with corresponding HRP-conjugated secondary for one hour and the washing steps repeated. The membrane was developed using an ECL detection kit according to manufacturer’s instructions and expose to film for visualization. The film was developed with Curix 60 developer and the blots compared to the protein ladder for size conformation. A 65kDa protein represented the post-translationally processed Gpr56 and 73kDa a non- translationally process protein. Equal amounts of total protein loaded onto the gel was confirmed by the 42kDa -actin signal.
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Characterization of the G protein coupled receptor (GPR) 55 in the human placenta / submitted by Julia Kremshofer

Characterization of the G protein coupled receptor (GPR) 55 in the human placenta / submitted by Julia Kremshofer

melted up. However, in the following cycles this temperature maintains 30 seconds (C-D). Prior to that RNA samples are reversely transcribed into cDNA at 50°C for 50 min (A-B). Denaturation of templates is followed by primer annealing. In this step primers bind to their complementary sequence at the template. Therefore the tubes are cooled down to 55-65°C for 30 sec, depending on primer design (E-F). The annealing temperature should be chosen exactly and in the best case be the same for all primers used. A temperature below the perfect annealing temperature leads to unspecific binding or primers even bind to themselves. Too high temperatures may inhibit any annealing at all. Right after primer annealing the amplification phase is following. Amplification takes place at temperatures ranging between 68-72°C, depending on the deployed polymerase (G-H). Duration of amplification depends on the size of the product (30 sec for every 500 base pairs) and the efficiency of the polymerase, but is around 60 seconds. Polymerases used for PCR elongate DNA in direction 5’ to 3’. Therefore they start amplification where forward primer is bound and adhere one nucleoside triphosphate after the other. Primers stay attached to the strand they are bound to until all formed double bonds are denaturated again to be available as templates. These three steps are repeated about 25 – 40 times. Similar to the first step the last amplification step is expanded to ensure that all templates are elongated. After the whole process is finished, the workstation normally cools down the tubes to 4°C to protect received products from further degradation.
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Analyse des Einflusses von heterotrimeren G-Proteinen und Nicht-G-Protein-Interaktionspartnern auf die hCCR2-vermittelte Signaltransduktion

Analyse des Einflusses von heterotrimeren G-Proteinen und Nicht-G-Protein-Interaktionspartnern auf die hCCR2-vermittelte Signaltransduktion

Ribose-Einheit auf die Gα-Untereinheit überträgt. Dadurch wird der Austausch von GDP zu GTP blockiert und das Protein bleibt in seinem inaktiven Zustand. Heterotrimere G- Proteine verbinden GPCRs und nachgeschaltete Effektormoleküle. Dabei durchlaufen sie einen Zyklus, bestehend aus einem aktiven und einem inaktiven Zustand (McCudden et al. 2005). Im inaktiven Zustand hat die Gα-Untereinheit ein GDP gebunden und liegt assoziiert mit dem Gβγ-Dimer vor. Dieser heterotrimere Komplex ist über Fettsäurereste auf der Innenseite der Plasmamembran verankert (Higgins & Casey, 1996; Evanko et al,. 2001; Chen & Manning, 2001; Evanko et al., 2005). Durch die Interaktion mit einem aktivierten GPCR kommt es an der Gα-Untereinheit zum Austausch von GDP zu GTP. Daraufhin dissoziiert die Gα-Untereinheit sowohl vom Rezeptor als auch vom Gβγ-Dimer. Damit ist nun die Gα-Untereinheit und das Gβγ-Dimer frei und in der Lage, die Aktivität verschiedenster Effektormoleküle wie Adenylyl- und Guanylylcyclasen, Phosphodiesterasen, Phospholipase C-Isoformen (PLC) und Phosphoinositid-3-Kinasen (PI3K) zu regulieren. Dadurch kommt es zu einer Aktivierung bzw. zu einer Inhibition der Produktion von second messenger Molekülen, wie cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP), cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP), Diacylglycerol (DAG), Inositol- 1,4,5-trisphosphat (IP3), Phosphatidylinositol-3,4,5-phosphat, Arachidonsäure und Phosphatidylsäure (Marinissen & Gutkind, 2001; Neves et al., 2002). Durch die intrinsische GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit wird das GTP hydrolysiert. Die Gα- Untereinheit reassoziiert in ihrem GDP-gebundenen Zustand wieder mit dem Gβγ-Dimer, wodurch die Interaktion mit den Effektoren beendet wird und somit der Zyklus wieder von vorne beginnen kann (Ford et al., 1998; Li et al., 1998; McCudden et al., 2005). Beobachtungen, dass die GTPase-Aktivität von isolierten G-Proteinen viel geringer ist als die unter physiologischen Bedingungen gemessene Aktivität führte zur Entdeckung einer Familie von ubiquitär exprimierten Proteinen, die die GTPase-Aktivitiät von Gα erhöhen (Arshavsky & Pugh, 1998). Diese Proteine werden als RGS-Proteine (regulator of G-
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OPUS Würzburg | Über die Interaktion aktivierter G-Proteine mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren

OPUS Würzburg | Über die Interaktion aktivierter G-Proteine mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Die Untersuchung zur G-Protein/Effektor Interaktion sind gegenwärtig nicht mit einem eindeutigen Ergebnis abgeschlossen. Vom physiologischen Gesichtpunkt aus betrachtet wäre eine stabile Effektor/G-Protein Interaktion vor der G-Protein Aktivierung für eine Lokalisation des Rezeptorsignals zum Effektor hilfreich. Eine Studie zur Interaktion mit GIRK-Kanälen aus Kir3.1 Monomeren und der Adenylatcyclase mittels BRET kamen zu dem Ergebnis, dass heterotrimere G-Proteine und Effektoren unabhängig von der Aktivierung des G-Proteins einen stabilen Komplex bilden (Rebois, 2006). Alternative Untersuchungen an GIRK-Kanälen mittels FRET und Totaler Internaler Reflexions Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) ergaben den gleichen Rückschluss (Riven, 2006). Zu beiden Studien sei angemerkt, dass diese in heterologen Expressionssystemen durchgeführt wurden. In Neuronen konnte eine Aktivierung von GIRK-Kanälen durch immobilisierte µ-opioid Rezeptoren mit der gleichen Kinetik wie ohne Immobilisierung gezeigt werden, was bedeutet, dass die Diffusion von GPCRs in der Aktivierungskinetik nicht der zeitlich limitierende Faktor ist (Lober, 2006). Indirekt konnte gezeigt werden, dass aufgrund der verwendeten Methode unter diesen Bedingungen, genauso wie unter heterologen Bedingungen, GIRK Kanäle immobilisiert sind, was gegen stabile Effektor/G-Protein Komplexe spricht.
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Protein-Protein-Wechselwirkungen im männlichen Genitaltrakt der Säuger (Mammalia) am Beispiel der Profiline und eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors

Protein-Protein-Wechselwirkungen im männlichen Genitaltrakt der Säuger (Mammalia) am Beispiel der Profiline und eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors

eine jeweils Gewebe- und kontext-spezifische physiologische / pathologische Funktion vermutet [Jones & Jomary, 2002]. Untersuchungen haben gezeigt, dass Clusterin streß-induziert bei apoptotischen Prozessen eine Chaperon-ähnliche Funktion ausübt [Buttyan et al., 1989; Humphreys et al., 1999] und dass es bei einer Ligation der Ductuli efferentes zu einer bis zu 100- fachen Erhöhung der Clusterin-Mengen kommt [Grima et al., 1990]. So ist vermutlich auch das drastisch erhöhte Expressionslevel im HE6-KO-Nebenhoden auf die Obstruktion der Ductuli, Gewebeveränderungen und apoptotische / pathologische Prozesse, d.h. indirekt auf den KO- Phänotyp zurückzuführen. Ähnliches kann für Osteopontin/Spp1 vermutet werden. Osteopontin ist ein multifunktionales Phosphoprotein, das auf der Oberfläche von vielen Epithelien gefunden wird und in verschiedene pathologische Prozesse involviert ist [Denhardt et al., 2001]. Im Nebenhoden ist es wie HE6 apikal in den Mikrovilli der Prinzipalzellen exprimiert, wo vermutet wird, dass es eine Funktion bei der Regulation der luminalen Flüssigkeit spielt, indem es Kalzium-Ionen aus dem epididymalen Lumen entfernt [Luedtke et al., 2002]. Da für Osteopontin eine Interaktion mit anderen Rezeptoren beschrieben wurde, wodurch es verschiedene Signaltransduktionswege aktiviert und in Prozesse wie Zell-Adhäsion, intrazelluläre Kalzium-Regulation und Zytoskelett- Organisation eingebunden wird [Denhardt & Guo, 1993], kann eine Interaktion mit HE6 vermutet werden. So könnte es als HE6-downstream-reguliertes Gen an der transepithelialen Resorption von Kalzium-Ionen und somit an der Gestaltung eines speziellen biologischen Milieus im Nebenhodenkopf beteiligt sein. Andererseits ist Osteopontin jedoch ein wichtiges regulatorisches Protein der Zellimmunität, das bei pathologischen und inflammatorischen Prozessen wie z.B. Gewebeverletzungen drastisch heraufreguliert wird [Denhardt et al., 2001], so dass die verstärkte Expression im HE6-KO auf die indirekten Folgen des KO, nämlich Obstruktion und Atrophie zurückgeführt werden könnte. Es bleibt zu klären, ob die veränderten Genexpressionsmuster dieser vier Gene in einem direkten Zusammenhang mit dem KO des HE6-Rezeptors stehen, es sich also um so genannte downstream-regulierte Gene handelt, oder ob sie eine indirekte Folge des KO- Phänotyps mit partiellem Verschluss der Ductuli sind und auf das Fehlen testikulärer Faktoren oder auf inflammatorische Prozesse zurückzuführen sind.
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Funktionelle Selektivität von G-Protein gekoppelten Rezeptoren in der
Energiehomöostase

Funktionelle Selektivität von G-Protein gekoppelten Rezeptoren in der Energiehomöostase

extracellular N-terminus of mGPR83 highlights this region as a determinant for signaling regulation. This region of mGPR83 is composed of nearly 70 amino acids that are conserved among species (Electronic supplementary material, Fig. S1). Furthermore, these structural findings support a potential domain-like fold in this region. It is of future interest to take these first hints into consideration for studying signaling mechanisms of the GPR83 in detail. This N-terminal part might function as a tethered inverse agonist that switches to an intramolecular agonist during activation or may function as a signal transmitter. Such scenario Figure 3. Structural mGPR83 homology model with sensitive positions for constitutive receptor activation and zinc(II)-stimulation. This structual GPR83 homology model is based on the crystal structure of rhodopsin in the inactive state. Highlighted wild type amino acids were depicted from this model for experimental approaches, because they are located extracellularly at the ECLs or at the extracellular ends of the TMHs and those amino acids are known as putative determinants of metal-ion binding motifs: histidine, glutamate, asparagine or cysteine. Arranged in defined spatial arrangements they can interact e.g. with zinc(II)-ions. Interestingly, six side-chain substitutions abolished stimulation by zinc(II) (green sticks) and five substitutions at different positions expressed an increase in constitutive signaling activity of mGPR83 (red sticks). The are spatially clustered in two different regions – red cycle (CAMs) and green (zinc(II)-binding) full cycle. In summary, they are indicating the extracellular region of the mGPR83 as highly sensitive for activation. Cysteine 304 (blue stick) at TMH6 is one of the highly conserved family A GPCR residues and it was reported for several receptors that mutations here are leading almost always to constitutive receptor activation. Indeed, also the mGPR83 Cys304Trp mutation causes a slight ligand independent (constitutive) activation of Gq/11 mediated signaling pathways.
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G protein-coupled estrogen receptor correlates with Dkk2 expression and has prognostic impact in ovarian cancer patients

G protein-coupled estrogen receptor correlates with Dkk2 expression and has prognostic impact in ovarian cancer patients

Germany) for 20 min. The endogenous peroxidase was suppressed with 3% hydrogen peroxide (Merck, Darmstadt, Germany) in methanol (20 min). The specimens were rehydrated in a descending alcohol series (100%, 70%, 50% ethanol). The epitopes were retrieved by putting the slides in a pressure cooker with sodium citrate buffer (pH 6.0) for 5 min. After cooling to room temperature, the slides were washed in in distilled water and phosphate-buffered saline (PBS). To evade unspeci fic staining reagent 1 of the polymer kit (ZytoChem Plus HRP Polymer System, Berlin, Germany) was administered for 5 min. Next the slides incubated at +4°C for 16 h with the primary anti-body Anti- Dkk2 polyclonal rabbit IgG (ProteinTech, Manchester, UK). As negative controls the primary antibody was replaced by normal rabbit immunoglobulin G([IgG] supersensitive rabbit negative control; BioGenex, Fremont, California). Washing in PBS and the application of reagents 2 (20 min) and 3 (30 min) of the polymer kit anticipated the substrate-staining with chromogen diaminobenzidine (Dako, Hamburg, Germany). Counterstaining in Mayer acidic hematoxylin (Waldeck-Chroma, Münster, Germany) and dehydration in an ascending series of alcohol followed by Roticlear was performed. Cervical tissue was served as positive control.
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Hybrid Molecular Mechanics/Coarse-Grained Simulations for Structural Prediction of G-Protein Coupled Receptor/Ligand Complexes

Hybrid Molecular Mechanics/Coarse-Grained Simulations for Structural Prediction of G-Protein Coupled Receptor/Ligand Complexes

Abstract Understanding how ligands bind to G-protein coupled receptors (GPCRs) provides insights into a myriad of cell processes and is crucial for drug development. Here we extend a hybrid molecular mechanics/coarse-grained (MM/CG) approach applied previously to enzymes to GPCR/ligand complexes. The accuracy of this method for structural predictions is established by comparison with recent atomistic molecular dynamics simulations on the human b2 adrenergic receptor, a member of the GPCRs superfamily. The results obtained with the MM/CG methodology show a good agreement with previous all-atom classical dynamics simulations, in particular in the structural description of the ligand binding site. This approach could be used for high-throughput predictions of ligand poses in a variety of GPCRs.
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