MALDI TOF MS

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Evaluation der Eignung von MALDI-TOF MS zur mikrobiologischen Diagnostik in der Parodontologie

Evaluation der Eignung von MALDI-TOF MS zur mikrobiologischen Diagnostik in der Parodontologie

eine erhöhte β -Laktamase-Produktion erfasst (Fernandez-Canigia et al. 2015). Rams und Mitarbeiter untersuchten 2014 in ihrer Studie subgingivale Plaqueproben von 400 Patienten und konnten bei 74,2% des Patientenkollektivs resistente parodontopathogene Bakterien feststellen. Im Einzelnen bedeutet das, dass bei 296 Patienten Parodontopathogene mit einer nachgewiesenen Resistenz gegenüber mindestens eines der Antibiotika Amoxicillin, Clindamycin, Doxycyclin und Metronidazol erfasst wurden. Besonders interessant erscheint, dass bei 15,0% des Patientenguts die isolierten Infektionserreger eine Resistenz gegenüber Amoxicillin und gleichzeitig gegenüber Metronidazol (van-Winkelhoff- Cocktail) zeigten (Rams et al. 2014). In Europa sind in Bezug auf parodontopathogene Keime große Unterschiede im Auftreten von Antibiotikaresistenzen zwischen den Ländern erkennbar. So führte beispielsweise im Vergleich zu den Niederlanden der vermehrte Gebrauch von Antibiotika in Spanien zu einem höheren Anteil resistenter Bakterien in der subgingivalen Plaque von Parodontitispatienten (van Winkelhoff et al. 2000). Dadurch wird verdeutlicht, dass der vielfältige und achtlose Gebrauch von Antibiotika zur Entstehung resistenter Pathogene beiträgt. Insgesamt muss also dem adäquaten Antibiotikaeinsatz bei der Therapie parodontaler Erkrankungen besondere Beachtung gewährt werden. Diesbezüglich erlaubt die MALDI-TOF MS-Diagnostik nach der Speziesbestimmung eine erneute Kultivierung der Bakterien, wobei im Folgenden beispielsweise mithilfe eines Epsilometer-Tests (E-Test) eine Resistenzprüfung gegen in der Parodontologie gebräuchliche Antibiotika ohne Weiteres durchgeführt werden kann. Auf diese Weise konnten auch Dahlen und Preus die Resistenz einer Vielzahl isolierter Parodontopathogene gegenüber Metronidazol, Penicillin, Amoxicillin, Amoxicillin/Clavulansäure und Clindamycin untersuchen (Dahlen und Preus 2017). Das MALDI-TOF MS-Verfahren lässt sich also problemlos mit Resistenzbestimmungsmethoden kombinieren, was letztlich die gezielte Auswahl eines zweckmäßigen Antibiotikums möglich macht.
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Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027  and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system

Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system

identified simultaneously to C. difficile identification when using MALDI-TOF MS. However, due to the low number of 017 isolates it was not possible to identify diagnostic peaks for this strain. Although this limitation counts for other sporadic strains found in our region, 98.9% of the isolates (268 of 271) belonging to types 001, 027 and 078/126 were identified correctly by MALDI-TOF MS.

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OPUS FAU | Positionsspezifischer Nachweis und relative Quantifizierung von Modifikationen des alpha-s1-Caseins in Milch mittels MALDI-TOF-MS

OPUS FAU | Positionsspezifischer Nachweis und relative Quantifizierung von Modifikationen des alpha-s1-Caseins in Milch mittels MALDI-TOF-MS

Lysinreste 5, 13, 94, 108 und 122 nachgewiesen, nachdem ein Kindernährmittel mit- tels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und der entsprechende Spot mit Trypsin ver- daut und mittels nano-ESI-MS/MS vermessen wurde [49]. Auch Carulli et al. haben Amadoriprodukte an Lys5/Lys13, Lys58/Lys62, Lys98/Lys108 und Lys122 detektiert. Des Weiteren konnten eine Oxidation des Peptids 1034 und eine CML-Modifikation von Peptid 1622 nachgewiesen werden [64]. Als Probe wurde dabei im Milchmodell- system mit Lactose erhitztes a-Lactalbumin nach Verdau mit AspN mittels MALDI- TOF-MS in ClCCA vermessen. Als zusätzliche Modifikationen führen Arena et al. Lactosylierungen von Lys16, Lys58, Lys62, Lys79, Lys93, Lys98 und Lys114 auf, wo- bei hier die Proteine eines Kindernährmittels tryptisch verdaut wurden, anschließend an Aminophenylboronsäure-Säulen aufgereinigt und mittels LC-ESI-LIT-MS/MS ver- messen wurden [59]. Zusätzlich konnte hier die Oxidation von Met90 gemessen wer- den. Meltretter et al. schließlich konnten neben der Oxidation des Peptids 1034 auch die der Peptide 2188 (entspricht Trp104/Cys111) und 2517 (Trp26/Cys28) feststellen, ebenso die CML-Modifikation und das Amadoriprodukt der Peptide 1252 (entspricht Lys5) und 1622 (Lys5/Lys13). Hier wurde ebenfalls im Milchmodellsystem mit Lactose erhitztes a-Lactalbumin vermessen [19]. Damit stehen die in Tab. 2.8 genannten Lac- tosylierungsstellen in guter Übereinstimmung mit der Literatur; CML könnte durch den Abbau dieser Amadoriprodukte gebildet werden. Ebenso sind die meisten der hier detektierten Oxidationen in der Literatur beschrieben; die dort erwähnte Lysinaldehyd- Bildung konnte jedoch nicht beobachtet werden. Unterschiede zwischen den Literatur- daten und den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit können beispielsweise durch un- terschiedliche Proben (Milchproben und Erhitzungen im Modellsystem), abweichende Probenaufarbeitungen und unterschiedliche Ionisierungstechniken erklärt werden.
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Subspecies typing of Streptococcus agalactiae based on ribosomal subunit protein mass variation by MALDI-TOF MS

Subspecies typing of Streptococcus agalactiae based on ribosomal subunit protein mass variation by MALDI-TOF MS

Methods: A total of 796 GBS whole genome sequences, covering the genetic diversity of the global GBS population, were used to in silico predict molecular mass variability of 28 rsp and to identify unique rsp mass combinations, termed “rsp-profiles”. The in silico established GBS typing scheme was validated by MALDI-TOF MS analysis of GBS isolates at two independent research sites in Europe and South East Asia. Results: We identified in silico 62 rsp-profiles, with the majority ( >80%) of the 796 GBS isolates displaying one of the six rsp-profiles 1–6. These dominant rsp-profiles classify GBS strains in high concordance with the core-genome based phylogenetic clustering. Validation of our approach by in-house MALDI-TOF MS analysis of 248 GBS isolates and external analysis of 8 GBS isolates showed that across different laboratories and MALDI-TOF MS platforms, the 28 rsp were detected reliably in the mass spectra, allowing assignment of clinical isolates to rsp-profiles at high sensitivity (99%) and specificity (97%). Our approach distinguishes the major phylogenetic GBS genotypes, identifies hyper-virulent strains, predicts the probable capsular serotype and surface protein variants and distinguishes between GBS genotypes of human and animal origin. Conclusion: We combine the information depth of whole genome sequences with the highly cost efficient, rapid and robust MALDI-TOF MS approach facilitating high- throughput, inter-laboratory, large-scale GBS epidemiological and clinical studies based on pre-defined rsp-profiles.
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A simple, rapid typing method for Streptococcus agalactiae based on ribosomal subunit proteins by MALDI-TOF MS

A simple, rapid typing method for Streptococcus agalactiae based on ribosomal subunit proteins by MALDI-TOF MS

All but one of the 28 rsp was reliably measured (27 rsp above 92% and 14 rsp above 95%) in the 996 mass spectra generated here. The overall measurability of the rsp is high, and there were 29 isolates displaying novel rsp mass variants. The only current drawback pertains to the low measurability of the rsp L19, which was found in only half of the spectra. We do not think that this is a general technical limitation of the Microflex platform, given that L19 was still abundant in the other half of the spectra and that by experience a simple repetition of MALDI-TOF MS measurement resulted in the detection of missed L19. Visual inspection of isolates CUHK A23, CUHK A31 and CUHK A60 mass spectra with missing L19 revealed that the main mass variant was present but the peak not distinct enough to pass the signal-to-noise threshold. In silico prediction of L19 in these isolates confirmed this observation and can likely be extrapolated to the other isolates with missing L19. L19 is a highly conserved rsp, mostly present as the main mass variant and for the majority of genotypes, missing of L19 does not interfere with the correct assignment of the rsp-profile. The 13 isolates that were assigned with a double-ID due to the missing L19, all matched to both rsp-profile 4 and the rsp-profile 31, which is not a frequently seen profile (1 out of 796 WGS). Furthermore, it has been attributed to a GBS genotype that is located in the same phylogenetic cluster as the majority of rsp-profile 4 genotypes. Hence, the double ID in this case still allows the assignment of genotype to its correct evolutionary relationship 20 .
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Darstellung massenmodifizierter 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-triphoshate für die DNA-Analyse mittels MALDI-TOF-MS

Darstellung massenmodifizierter 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-triphoshate für die DNA-Analyse mittels MALDI-TOF-MS

Molekülion weniger stark aufgespalten, so daß insgesamt eine höhere Empfindlichkeit bei der MALDI-TOF-Analyse resultiert. Aus diesem Grund ist es denkbar, daß durch den Ersatz von A und G durch die entsprechenden C 7 -Verbindungen der für Nucleinsäuren zugängliche Massenbereich erheblich erweitert werden kann. Dabei wurden für alle PCR-Produkte unmodifizierte Primer eingesetzt. Allein durch die enzymatische Reaktion ließen sich bei PCR-Produkten mit einer Länge von 100-200 nt 80-90 % der Purinbasen durch die entsprechenden 7-Desaza-Verbindungen ersetzen. Dies ist durchaus ausreichend, um eine signifikante Verbesserung bei der MALDI-Analyse zu erzielen. Die Kombination von unmodifizierten Primern und den kommerziell erhältlichen 7-Desaza-Purin dNTPs bietet somit eine allgemein anwendbare Methode zur Verbesserung der MALDI-Analyse von PCR- Produkten. Eine weitere Verbesserung läßt sich durch den Einsatz von Primern mit Ribo- Modifikation am vorletzten Nucleotid erzielen. Wie gezeigt wurde, können diese nach der PCR mittels NaOH abgespalten werden. Das resultierende, hydrolysierte Produkt enthält ausschließlich 7-Desaza-Purinbasen und weist zudem eine geringere Masse auf. Da bei der MALDI-TOF-Analyse von PCR-Produkten hauptsächlich die einzelsträngigen Verbindungen nachgewiesen werden, diese jedoch infolge ihrer geringen Massendifferenz meist nicht mehr aufgetrennt werden können, hängt die Auflösung (m/ 'm) des Signals ebenfalls von der Massendifferenz der beiden Einzelstränge ab. Bei ähnlichen Massendifferenzen der Einzelstränge von PCR- und Hydrolyseprodukt läßt sich allein durch die Verschiebung des Produktes in den kleineren Massenbereich eine Verbesserung der Auflösung erzielen. Weitere Untersuchungen, bei denen die hier erzielten Ergebnisse auf die Sanger-Sequenzierung übertragen werden, stehen noch aus. Zwar wurden aufgrund der nachgewiesenen, höheren Ionenstabilität von 7-Desaza-Purin-modifizierten Oligonucleotiden in unserer Arbeitsgruppe C 7 -dATP und C 7 -dGTP als Substrate für die Sanger-Sequenzierung mittels MALDI-TOF-MS eingesetzt, die mögliche, zusätzliche Abspaltung des Primers bietet jedoch weitere Vorteile: Zum einen werden die Sequenzierungsprodukte in den niedrigeren Massenbereich verschoben, zum anderen kann durch die Abspaltung des Primers die für MALDI-Analysen von Sequenzierungsprodukten übliche, geringe Leselänge um die Länge des Primers erweitert werden.
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Anwendbarkeit der Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) für den Nachweis und die Differenzierung von Leptospira spp. im Vergleich zum Multilocus Sequence Typing (MLST)

Anwendbarkeit der Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) für den Nachweis und die Differenzierung von Leptospira spp. im Vergleich zum Multilocus Sequence Typing (MLST)

Lange Zeit konnte die Massenspektrometrie (MS) nur für die Analyse von Atomen oder großen Molekülen verwendet werden, da die Ionisierung der Proben zu unkontrollierbaren Veränderungen in der chemischen Struktur der Analyten führte (SAUER et al., 2010; VESTAL, 2011). Im Jahr 1988 beschrieben Karas und Hillenkamp erstmals eine neue Ionisierungstechnik die keine Strukturänderungen der Moleküle mehr verursachte (KARAS et al., 1988). Mit der Einführung des matrix assisted laser desorption ionization (MALDI)- Prinzips konnten zum ersten Mal große Moleküle wie Proteine und DNA-Oligomere anhand ihrer Größenunterschiede differenziert werden (VESTAL, 2011). Mit der Weiterentwicklung massenspektrometrischer Verfahren in den späten 80er Jahren konnten Peptide und Proteine in biologischen Materialien analysiert werden (SAUER et al., 2010). Lange Zeit wurde MS nur für die Charakterisierung von Proteinen, Lipiden und Zuckern verwendet. Für den Einsatz in der Mikrobiologie war die Technologie lange mit einem zu großen Aufwand verbunden. Erst im Jahr 1996 wurde das Prinzip des MALDI-TOF MS erstmals für die Differenzierung ganzer Zellen von grampositiven und gramnegativen Bakterien angewendet, ohne das die Proteine der Bakterienzelle vorher extrahiert wurden (CLAYDON et al., 1996). MALDI-TOF MS wird seither für die Identifizierung von Bakterien in der Routinediagnostik und der taxonomischen Einteilung von Mikroorganismen verwendet (WELKER (2), 2011). Dabei werden Bakterien- zellen anhand der Unterschiede ihrer Proteinmassen differenziert, die durch ein Massenspektrometer erfasst werden (STEPHAN et al., 2010).
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Entwicklung und Anwendung einer neuartigen Methode zur Identifizierung von Back- und Brauhefen mittels  MALDI-TOF-MS und der multivariaten Datenanalyse

Entwicklung und Anwendung einer neuartigen Methode zur Identifizierung von Back- und Brauhefen mittels MALDI-TOF-MS und der multivariaten Datenanalyse

Die Targets sind meist flache Metallplatten, die in das MALDI-TOF-MS-System eingeschleust werden. Sie haben eine bestimmte Anzahl an kleinen Vertiefungen, den sogenannten Spots. Für die Auswahl spielt die generelle Eignung sowie die Haltbarkeit, Robustheit und Resistenz gegenüber den notwendigen Chemikalien eine wichtige Rolle. In weiteren Schritten wurde untersucht, welche Matrix sich für die Messung der aufbereiteten Hefeproteine eignet. Basierend auf unterschiedlichen Literaturquellen, vor allem aus der klinischen Diagnostik, wurden verschiedene Ansatzpunkte bei der Target- und Matrixauswahl untersucht (Tabelle 4-1, 4-2). Die Tabellen geben einen Überblick über den Literaturstand zu Beginn der Forschungsarbeiten und während des Forschungsverlaufs.
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Möglichkeiten und Grenzen der Mastitisdiagnostik mittels MALDI-TOF MS-Analytik und molekularbiologischen Methoden

Möglichkeiten und Grenzen der Mastitisdiagnostik mittels MALDI-TOF MS-Analytik und molekularbiologischen Methoden

Ein modifiziertes Protokoll des MALDI Sepsityper TM Kit nach Barreiro et al. (2012) soll es ermöglichen, Milchproben ohne vorherigen Kultivierungsschritt mit Hilfe von MALDI-TOF MS zu untersuchen. Zunächst wurden hierzu die Milchproben bei 37 °C für vier Stunden inkubiert. Danach wurden 900 µl der Milch mit 200 µl Lysis Buffer gemischt und zwei Minuten bei 13.000 x g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand vorsichtig mit einer Pipette abgenommen und verworfen. Zu dem so gewonnenen Pellet wurden ein ml destilliertes Wasser und erneut 200 µl Lysis Buffer hinzugegeben und gemischt. Danach erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt für zwei Minuten bei 13.000 x g. Abermals wurde der Überstand vorsichtig mit einer Pipette abgenommen und verworfen. Das Pellet wurde nun mit einem ml Washing Buffer gemischt und erneut für zwei Minuten bei 13.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und das Pellet in 300 µl destilliertem Wasser resuspendiert. Anschließend wurden 900 µl Ethanol absolut hinzugegeben, um die Bakterien zu inaktivieren und lagerungsfähig zu machen. Danach wurde noch zweimal je zwei Minuten bei 13.000 x g zentrifugiert und jeweils der Überstand abgenommen. Das Pellet wurde nun für fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Im Anschluss wurden fünf µl 70 %ige Ameisensäure und fünf µl 100 %iges Acetonitril zu dem Pellet hinzugefügt. Nach zwei-minütigem Zentrifugieren bei 13.000 x g wurde ein µl des klaren Überstandes auf das Target gegeben und luftgetrocknet. Anschließend wurde ein µl der HCCA-Matrixlösung (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) auf jedes belegte Well pipettiert. Die Messung erfolgte dann wie in Kapitel 3.3.3.1 beschrieben.
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Editorial: MALDI-TOF MS Application for Susceptibility Testing of Microorganisms

Editorial: MALDI-TOF MS Application for Susceptibility Testing of Microorganisms

Editorial on the Research Topic MALDI-TOF MS Application for Susceptibility Testing of Microorganisms In the present era of multi-/pan-resistant microorganisms, the acceleration of the microbiological diagnostics is the most pressing task and declared aim of many academic and industrial research groups. These efforts are of fundamental importance for appropriate antibiotic treatment and efficient infection control measures. Besides neglected issues of the preanalytical processes, rapid identification, and rapid susceptibility testing are essential components to be addressed ( van Belkum et al., 2013, 2019; Idelevich et al., 2018a ). Conventional standardized methods for susceptibility testing are usually accurate, but require long incubation times, especially for fungi ( Idelevich and Becker, 2015 ). In the past decades the primary emphasis was on the development of nucleic acid-based molecular assays, which are only partially able to meet these demands. In particular, all DNA-based molecular assays are focused to the respective resistance genes. The presence of these, however, does not necessarily correspond to the resistance phenotype, nor is applicable in case of unknown resistance mechanisms. Consequently, universal approaches are necessary, which allow for (i) rapid and untargeted identification, (ii) fast and mechanism- independent susceptibility testing and, if needed, (iii) further characterization (e.g., typing) of a given isolate.
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Mikrostrukturaufklärung von synthetischen Polymeren durch
MALDI-TOF-MS mit integrierter Hochenergie-Fragmentierungs-
Zelle (HE-CID)

Mikrostrukturaufklärung von synthetischen Polymeren durch MALDI-TOF-MS mit integrierter Hochenergie-Fragmentierungs- Zelle (HE-CID)

Desorption in die Gasphase mit anschließender Ionisation, ohne dass die Makromoleküle deutliche Fragmentierungen erfahren. Nach Untersuchungen an Molekülen niedriger Masse beschrieben 1987 Karas und Hillenkamp den Einsatz UV-aktiver Substanzen als Matrix für die schonende Ionisation thermisch labiler Biomoleküle. 2, 15 Etwa zur gleichen Zeit berichtete Tanaka über seine Beobachtungen der Laserionisation von hochmolekularen Proben sowohl biologischen als auch synthetischen Ursprungs. 1 Statt niedermolekularer UV-aktiver Substan- zen verwendete Tanaka Glycerol als eine flüssige Matrix, in der hochfeines Cobaltpulver dispergiert wurde. 1 Schon bald darauf wurde über die Untersuchung synthetischer Polymere mit der von Karas und Hillenkamp beschriebenen Methode berichtet. 16 Einige häufig verwen- dete Matrices in der MALDI-TOF-MS synthetischer Polymere sind in Tabelle 2 gezeigt. 3, 7, 17 Der genaue Vorgang der Desorption und der Entstehung der Primärionen in der MALDI ist noch immer nicht abschließend geklärt. Im Allgemeinen wird von einem zweistufigen Prozess ausgegangen, bei dem die während der Ablation gebildeten Primärionen in der expandie- renden Wolke weiter reagieren, bis ein lokales thermisches Gleichgewicht erreicht wird. 18 Die Sekundärreaktionen in der expandierenden Wolke aus Primärionen und Neutralteilchen können gut als anschließend stattfindende Charge-Transfer-Reaktionen zwischen ionischen und neutralen Spezies in der Gasphase beschrieben werden. 18 Für die Bildung der Primär- ionen, bei denen es sich zumeist um Matrixspezies handelt, gibt es zwei wichtige Modelle. 19, 20 Das „Lucky Survivors“-Modell geht davon aus, dass bereits im festen Zustand Ionen vorgeformt in der Matrix vorliegen. 19, 21 Im Gegensatz dazu basiert das Modell der Photo- ionisation auf der Kombination mobiler Matrixexcitonen, so dass durch Addition der Energie mehrerer Photonen eine Ionisation eines Matrixmoleküls erfolgt. 18, 22
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Nachweis von Pseudomonas Spezies und anderen Non-Fermentern in Trinkwasserproben mit anschließender Identifizierung mittels MALDI-TOF-MS

Nachweis von Pseudomonas Spezies und anderen Non-Fermentern in Trinkwasserproben mit anschließender Identifizierung mittels MALDI-TOF-MS

Nach einer Untersuchung der Trinkwasserproben durch eine Membranfiltration und nach ei- ner Inkubation der Membranfilter auf Cetrimid- und R2A-Nährmedium für zwei Tage bei (30 ± 2)° C kann als Ergebnis (vergleiche 4.1) festgestellt werden, dass die Diversität an mit- tels MALDI-TOF-MS nachgewiesenen Non-Fermentern im Trinkwasser hoch ist. Die Diversität variiert nicht nur zwischen den Trinkwasserinstallationen, sondern auch zwischen den einzelnen Proben einer Installation. So können an der Trinkwasserinstallation 1 je nach Entnahmeart und ausgewähltem Nährmedium die Gattungen Brevundimonas, Pseudomonas, Acidovorax und Sphingomonas nachgewiesen werden. In der Trinkwasserinstallation 2 kön- nen die Gattungen Brevundimonas, Pseudomonas und Brevibacterium nachgewiesen werden. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis ist, dass nur ein Anteil der Gesamtanzahl ver- schiedener Gattungen und Spezies im Trinkwasser auf den Nährmedien gewachsen ist. Es kann sich neben den nähr- und hemmstoffbedingten Selektivitäten (näheres hierzu in Ab- schnitt 5.4) um zufällige Verteilungen handeln. In Trinkwassersystemen, genauer gesagt in dem darin enthaltenen Trinkwasser sind die Mikroorganismen meist nicht gleichmäßig ver- teilt, sodass je Probeentnahme verschiedene Mikroorganismen nachgewiesen werden können [Kistemann, 2012]. Dies ist auch eine Erklärung für das Vorkommen unterschiedlicher Non- Fermenter in einer Trinkwasserinstallation, also in einem Gebäude.
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Gutenberg Open Science: Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Makromolekülanalytik

Gutenberg Open Science: Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Makromolekülanalytik

Matrices Makromoleküle in deren Kristallgitter einbauen. Ende 1999 wurde, mehr als zehn Jahre nach der Einführung von MALDI-TOF-MS, die Modellvorstellung (Abb. 1-3, S. 5), dass der Analyt in eine kristalline Matrix eingebettet sein muss, um eine Desorption/Ionisation zu ermöglichen, berichtigt. Der Einbau des Analyten in den Kristall ist hilfreich, jedoch keine generelle Notwendigkeit, um große Analytionen zu produzieren 180 . Diese Annahme stützt sich auf Untersuchungen der DHB-Isomere als Matrices (Abb. 3-23) und Cytochrom C als Analyt. Weiter wird vorgeschlagen, dass bei der UV- MALDI-TOF-MS eine unmittelbare Nähe vom Analyten zur Matrix ausreicht, wie sie z.B. bei einer Adsorption an der Matrixoberfläche gefunden wird. Es wird angenommen, dass ein großes Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis die Chance erhöht, dass ein Analyt an einer entsprechenden Oberfläche haftet. Diese Hypothese stützt sich dabei insbesondere auf Untersuchungen der 2,6-DHB- Matrix und Cytochrom C, bei der ausschließlich die „thin-layer“-Präparation exzellente Massenspektren lieferte. Dies bildet aufgrund der schnellen Verdampfung des Lösungsmittels submikrometerkleine Matrix/Analyt-Kristalle mit einem großen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis. Es konnten keine Massenspektren des Cytochrom C von großen prismatischen Einkristallen und von langen Nadeln, die bei der „dried droplet“-Präparation gebildet wurden, erhalten werden.
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Gutenberg Open Science: Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Polymeranalytik

Gutenberg Open Science: Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Polymeranalytik

Die Charakterisierung des PAHs 57 sowie noch größerer PAHs benötigt folglich einen milderen Desorptionsprozeß als den bei direkter Laserdesorption. Bei löslichen organischen Verbindungen wurde MALDI-TOF-MS eingeführt, um die Molekulargewichtsgrenze der LD- TOF-MS überzuwinden. 116 Damit große Analytmoleküle (einige Tausend bis einige Hunderttausend g/mol) in die Gasphase ohne Fragmentierung überführt werden können, werden sie bei der MALDI-Methode in einem Überschuß von Matrix-Molekülen (z.B. 1:1000 Analyt:Matrix) eingebettet und voneinander isoliert. 15,117 Die kleinen organischen Matrix- Moleküle absorbieren die Laserenergie und sublimieren. Gleichzeitig werden die in der Matrix eingebetteten Analytmoleküle ohne direkte Anregung und praktisch fragmentierungsfrei in die Gasphase mitüberführt. Obwohl die Analyt-Matrix-Mischung in kondensierter Phase in das Massenspektrometer eingeführt wird, erfordert die konventionelle Probenvorbereitung 15 lösliche Analyt- und Matrixmoleküle, um homogene Mischungen vor der Verdampfung des Lösungsmittels zu erzielen. Damit wird die Anwendung von MALDI auf lösliche Proben begrenzt. Allgemein wird angenommen, daß die nach der Verdampfung des Lösungsmittels hinterlassene mikrokristalline Struktur der Probe eine Rolle spielt, daß also das Kristallgitter, in das der Analyt quasi als Fehlstelle eingebaut ist, für den Desorptionsprozeß wichtig ist. Es existiert jedoch kein Beweis dafür, da die äußerst geringe Analytkonzentration eine Visualisierung des Analyten in der Kristallstruktur der Matrix verhindert. Im Gegenteil, die Probenvorbereitungen mit flüssigen Matrices 118,119,120 oder mit unlöslichen Matrices 121 (wie schon bei den frühesten MALDI-Experimenten von Tanaka 117 ) deuten daraufhin, daß lediglich eine homogene Verteilung des Analyten in der Matrix für den MALDI-Prozeß erforderlich ist. Unseren Überlegungen zufolge gibt es also keinen zwingenden Grund für den „Umweg“ über den gelösten Zustand von Matrix und Analyt. Es wurde daher im Laufe dieser Arbeit die systematische Entwicklung einer speziellen Probenvorbereitung durchgeführt, um den MALDI-Prozeß auch für unlösliche PAH-Proben zu erzielen.
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Evaluierung des strukturaufklärenden Verfahrens MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Identifizierung von filamentösen Schimmelpilzen / eingereicht von Thuy Huyen Le

Evaluierung des strukturaufklärenden Verfahrens MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Identifizierung von filamentösen Schimmelpilzen / eingereicht von Thuy Huyen Le

Dank einfacher Handhabung bei automatisiertem Datenabgleich lassen sich mit Schnelligkeit einzelne Proben identifizieren. Targets mit bis zu 96 Spots können zur selben Zeit geladen sowie nacheinander abgelesen werden und stellen so eine gute Voraussetzung für eine Etablierung im Routinebetrieb dar. Im Sinne einer ressourcensparenden Diagnostik lassen sich dadurch Diagnosezeiten deutlich verkürzen und Befunde zeitig mitteilen. Ein frühzeitiger Beginn einer anti-infektiologischen Therapie korreliert deutlich mit dem Outcome [78]. Ökonomisch betrachtet ermöglicht MALDI-TOF-MS durch eine akkurate Bestimmung und reduzierter Durchlaufzeit frühzeitig zielgerichtete Therapien sowie Kosteneinsparungen im klinischen Alltag. Denn noch immer stellt neben einem langen Patientenaufenthalt, insbesondere die Gabe von teuren Medikamenten mit empirischen Charakter einen Hauptkostenverursacher in der Klinik dar. Demnach konnte der Anteil der Blutkultur positiven Patienten mit adäquater antibiotischer Therapie in einer Studie von Ge et al. von 56,1% auf 71 % gesteigert werden [170], zwar gelten die Zahlen für Bakterien, jedoch können solche Ergebnisse auch für Pilze angenommen werden.
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Quantification of nitroaromatic explosives in contaminated soil using MALDI-TOF mass spectrometry

Quantification of nitroaromatic explosives in contaminated soil using MALDI-TOF mass spectrometry

If soil is contaminated with nitroaromatic explosives, the ex- tracts often contain not only one compound but rather several degradation products. Their parallel identification and quanti- fication with conventional chromatographic methods is often achieved with a mixture of several standard substances, which is used for calibration. Subsequently, explosives in soil ex- tracts are quantified on the basis of their specific retention time and mass if a mass spectrometer is at hand. We followed a similar approach and used MALDI-TOF MS to generate spec- tra of a mixture of standard explosives in different concentra- tions. In the resulting spectra all explosive components were identified, revealed concentration-dependent signals, and showed good reproducibility for the measurement of repli- cates (Fig. 4a ). On the basis of this, the explosive-specific signals were normalized to the ion abundance of the internal standard (m/z 216) and plotted against the concentration of the explosive (Fig. 4b ). We then performed classical linear least squares regression. The resulting calibration curves exhibit good linearity in the calibration range. Only the plots for m/z 137 ([NT] •- ]), m/z 211 ([TNT − O] •- ), m/z 213 ([TNB] - ), and m/z 227 ([TNT] •- ) partly have a higher standard deviation. As shown before, the detection of NT is not very sensitive. The masses of [TNT − O] •- and [TNB] - are quite similar, which may be a reason for increased ion suppression or interferences through naturally occurring isotopes [ 19 ]. However, the sim- ple linear regression accurately reflects the concentrations used for all m/z investigated. Hence, it was used to calculate the explosives ’ concentrations in contaminated soil extracts. Multiple measurements of a standard solution and two soil
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Characterization of Yersinia using MALDI-TOF mass spectrometry and chemometrics.

Characterization of Yersinia using MALDI-TOF mass spectrometry and chemometrics.

For off-line analysis by MALDI-TOF MS, the 10-fold-diluted TFA extracts (see the sample preparation of microbial extracts and ref 19) were first pelleted by centrifugation. The supernatant was discarded and the pellet then dissolved in 6 M urea and 1% acetic acid. Peptide separation was performed on an Agilent (Palo Alto, CA) 1200 series binary HPLC instrument fitted with a 4.6 × 50 mm mRP-C18 reversed-phase column (Agilent). Peptides were eluted at a flow rate of 0.75 mL/min employing a gradient of 3%−30% B in 5 min and 30%−50% B in 33 min, where solvent A consisted of 0.1% TFA in water and solvent B of 0.08% TFA in acetonitrile. The eluate was monitored at λ = 210 nm, and 0.75 mL fractions were collected. Following evaporation to dryness, peptides of each fraction were dissolved in 10 μL of TA2 (see above). A 1 μL volume of each fraction was mixed with 1 μL of HCCA solution (6 mg/mL in TA2) and the resulting solution air-dried on a 384-well polished steel target plate (Bruker Daltonics). MALDI-TOF MS measurements were carried out under the control of FlexControl software, version 3.0 (Bruker Daltonics), using an Ultraflex II MALDI-TOF/TOF (TOF/TOF = tandem time-of-flight) mass spectrometer (Bruker Daltonics) equipped with a frequency-tripled solid-state Smartbeam Nd:YAG laser (λ = 355 nm) which operated at 100 Hz. Fractions containing target peptides were identified by recording spectra in linear positive mode with external calibration using a standard mixture of peptides. To sequence peptides, an exploratory scan from m/z 2000 to m/z 5000 was performed in the reflectron mode to assign a mass window for fragmentation and peptide sequencing in the “LIFT” tandem mass spectrometry (MS/MS) mode. The spectra were obtained by averaging up to 3000 laser shots acquired at a fixed laser power, which was set to the minimum laser power necessary for ionization of selected samples before the analyses were started. The mass spectra were visualized and processed using FlexAnalysis software, and sequence tag hints were obtained by analyzing tandem MS spectra using the Biotools 3.0 software (Bruker Daltonics). A BLAST search restricted to the Yersinia taxonomic identifier was performed, and finally the MS/MS spectrum was reinvestigated by alignment to the sequence obtained from the database search.
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Vergleichende Differenzierung von Clostridium spp. mittels biochemischer und molekularbiologischer Methoden sowie MALDI-TOF Massenspektrometrie

Vergleichende Differenzierung von Clostridium spp. mittels biochemischer und molekularbiologischer Methoden sowie MALDI-TOF Massenspektrometrie

In der Regel sollte hierbei eine Untersuchung auf die vier für die Humanmedizin bedeutendsten Toxintypen A, B, E und F ausreichen. Parallel zur PCR wird ein Ausstrich der Anreicherung auf festen Nährmedien wie Blutagar oder Eigelb-Laktose- Agar angefertigt und dieser 48 h anaerob bei 30 °C bebrütet. Nach erfolgreicher Bebrütung wird erneut eine Real-Time PCR von verdächtigen Kolonien im Hinblick auf das Vorhandensein der BoNT-Gene durchgeführt. Kolonien mit positivem PCR- Ergebnis können mittels MALDI-TOF MS oder mit biochemischen Testsystemen bestätigt werden. Gegebenenfalls empfiehlt es sich, das Toxinbildungsvermögen BoNT-Gen-positiv getesteter Keime mittels Maus-Bioassay nachzuweisen. Allerdings gilt allein ein Zusammenhang zwischen BoNT-Gen-positiven C. botulinum-Stämmen im Lebensmittel und gleichzeitig vorhandenen Erregern im Stuhl des Patienten - oder lediglich die Ausbildung charakteristischer Symptome beim Patienten - schon als lebensmittelrechtlich beanstandbar. In Abb. 12 wird der schematisierte Ablauf einer Untersuchung auf C. botulinum dargestellt.
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MALDI-ToF basierte Frühdiagnostik Carbapenemase-positiver gramnegativer Bakterien

MALDI-ToF basierte Frühdiagnostik Carbapenemase-positiver gramnegativer Bakterien

Zum breitgefächerten Screening auf unbekannte Erreger scheinen enzymatische Verfahren wie MALDI-ToF oder der CarbaNP-Test am besten geeignet. Beide Tests sind schnell und einfach durchführbar. Zudem sind sie, abgesehen von der Erstanschaffung im Falle von MALDI-ToF, kostengünstig durchzuführen. Der Nachteil beider Verfahren liegt darin, dass sie sich nur zur Testung auf Carbapenemase-vermittelter Carbapenemresistenz eignen und andere Resistenzmechanismen, wie beispielsweise Porinverlust unerkannt bleiben. Der bereits kommerziell und in verschiedenen Varianten erhältliche CarbaNP-Test (Dortet et al., 2015) zeigt in Studien eine schwankende Sensitivität von 70% (Tijet et al., 2013) bis 100% (Patrice Nordmann, Poirel, et al., 2012) und Probleme bei der Diagnostik OXA-48, GES und SME- positiver Proben (Mitra et al., 2015; Tijet et al., 2014). Dennoch ist der CarbaNP gängigen Referenztests in Sensitivität und Spezifität, sowie in seiner praktikablen Durchführung überlegen und stellt ein kostengünstiges und schnelles Verfahren zum Carbapenemasescreening dar (Bayramoğlu et al., 2016; Kabir et al., 2016; Vasoo et al., 2013). Vergleichende Studien zwischen CarbaNP-Test und auf MALDI-ToF basierende Verfahren zeigen, dass sich mittels MALDI-ToF gleichwertige (Knox et al., 2014) oder sogar bessere (Chong et al., 2015) Detektionsraten erzielen lassen. Nachteilig sind die initial hohen Gerätekosten, die somit die Verfügbarkeit des Verfahrens je nach Region einschränken. Eine Studie von Mirande et al. sieht MALDI-ToF-MS in naher Zukunft nicht routinefähig (Mirande et al., 2015). Als problematisch wird die unterschiedliche Enzymkinetik der verschiedenen Carbapenemasen und ihr unterschiedliches Ansprechen auf verschieden Carbapeneme gesehen. Mirande et al. sieht die Notwendigkeit individueller Arbeitsprotokolle für verschiedene Enzym-Antibiotika- Kombinationen, die sich in Inkubationszeit und Reagenzien unterschieden. Tatsächlich verwenden aktuelle Studien stets individuelle auf ihre Fragestellung abgestimmte Versuchssettings, die sich in Wahl des Antibiotikums, Inkubationsdauer und Reaktionspuffer unterscheiden (Burckhardt & Zimmermann, 2011; Hooff et al., 2012; Hrabák et al., 2011; Johansson et al., 2014; Kempf et al., 2012).
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Effects of sample fixation on specimen identification in biodiversity assemblies based on proteomic data (MALDI-TOF)

Effects of sample fixation on specimen identification in biodiversity assemblies based on proteomic data (MALDI-TOF)

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), on the other hand, provides a reliable and fast alternative for specimen-by-specimen identification. Based on a so-called proteome fingerprint, this technique is commonly used in species identification for fungi (e.g., Chalupová et al., 2014 ), viruses (e.g., La Scola et al., 2010 ), and bacteria (e.g., Singhal et al., 2015 ). For several groups of metazoans like insects ( Feltens et al., 2010; Kaufmann et al., 2011b ), fish ( Volta et al., 2012 ), or calanoid copepods ( Riccardi et al., 2012; Laakmann et al., 2013 ), pilot studies showed the successful use of this method. Furthermore, Bode et al. (2017)
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