Arabidopsis Thaliana

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Interaction in the rhizosphere of Arabidopsis thaliana

Interaction in the rhizosphere of Arabidopsis thaliana

Protozoen sind dafür bekannt, dass sie das Pflanzenwachstum durch Rückführung von in bakterieller Biomasse gebundenen Nährstoffen verbessern. Außerdem kann die Beweidung bakterieller Gemeinschaften zu einer Dominanz wachstumsfördernder Rhizobakterien führen. In einem dritten Experiment wurde untersucht, ob Protozoen das Pflanzenwachstum indirekt über Veränderungen der bakteriellen Gemeinschaft oder direkt durch die Freisetzung von Nährstoffen beeinflussen. Arabidopsis thaliana- Pflanzen wuchsen in einem Sand/Streu System und wurden mit bakteriellen Einzelstämmen, einem diversen Inokulum und Acanthamoeba castellanii beimpft. Der Rosettendurchmesser, als Kriterium für pflanzliche Biomasse und Fitness, war generell in Behandlungen mit Amöben erhöht, gleichzeitig war die Wurzelbiomasse in den Behandlungen mit Einzelstämmen erniedrigt. Außerdem erhöhte sich der Stickstoffgehalt im Pflanzengewebe und resultierte in einer Verringerung des C/N- Verhältnisses. Das Wachstum und die Nährstoffgehalte der Pflanzen unterschieden sich nicht zwischen Ansätzen mit Einzelstämmen und diversen Bakteriengemeinschaften, was darauf hinweist, dass der wachstumsfördernde Einfluss von Protozoen unabhängig von der bakteriellen Zusammensetzung ist.
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Funktionelle Analyse von Cryptochrom 3 aus Arabidopsis thaliana

Funktionelle Analyse von Cryptochrom 3 aus Arabidopsis thaliana

Hinweis auf die Funktion von Cryptochrom 3 zu erhalten. Cry3 konnte sowohl in Chloro- plasten, als auch teilweise in Mitochondrien detektiert werden (Abbildungen 11 E-F und 36). Eine Negativ-Kontrolle zu diesen Versuchen konnte allerdings nicht durchgeführt werden, da die cry3-knock-out-Mutante zu diesem Zeitpunkt noch nicht zur Verfügung stand. Auch eine Kontrolle mit dem Präimmunserum wurde nicht durchgeführt, da für diese Versuche ein affini- tätsgereinigter cry3-Antikörper verwendet worden war. Mögliche Kreuzreaktionen des Präim- munserums hätten daher keine zusätzlichen Aussagen über die Spezifität des verwende- ten Antikörpers ermöglicht. Aufgrund der Verteilung der Goldpartikel auf den Schnitten kann man jedoch auf eine hohe Spezifität des Antikörpers schließen. Goldpartikel waren fast aus- schließlich in den Organellen und kaum in anderen Bereichen wie Cytoplasma oder Vakuolen zu finden. Auch der Nachweis von lokalen clustern aus 4-6 Goldpartikeln in vielen Chloro- plasten spricht gegen eine zufällige Verteilung der Partikel und bestätigt die Lokalisation von cry3 in den Chloroplasten. Die Gesamtmenge an nachweisbaren Goldpartikeln war insge- samt relativ gering, obwohl für diese Experimente die cry3-Überexpressionslinie verwendet worden war. Cry3 konnte nur innerhalb einigen Mitochondrien detektiert werden. Der Nach- weis von cry3 in den Mitochondrien spricht somit gegen eine reine Assoziation von cry3 mit der äußeren Membran dieser Organellen. Die Untersuchungen ermöglichen keine Aussage über eine spezifische Lokalisation von Cryptochrom 3 innerhalb der Organellen, denn in den Chloroplasten konnte das cry3-Signal nicht mit speziellen plastidären Strukturen in Verbin- dung gebracht werden. Die Immunogoldstudien konnten somit keine weiteren Hinweise auf eine mögliche Funktion in den Organellen von Arabidopsis thaliana erbringen, die mit einer speziellen Subkompartimentierung zusammen hängen würde. Durch die verwendete Präpa- rationstechnik der Schnitte sind allerdings keine Thylakoid-Strukturen in den Chloroplasten erkennbar. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass cry3 in den Plastiden mit den Thylakoid-Membranen assoziiert ist. Zusammen mit den Ergebnissen der Zellfraktionierung und den Lokalisationsstudien durch GFP-Analysen (Kleine et al., 2003) kann man mit sehr großer Sicherheit sagen, dass cry3 sowohl in die Chloroplasten, als auch in die Mitochondri- en transportiert wird. Ein Artefakt bei den bisherigen Lokalisationsstudien durch GFP-Fusion und Überexpression ist somit auszuschließen, da bei den Untersuchungen durch Zellfraktio- nierung das endogene cry3-Protein in den Organellen nachgewiesen werden konnte. Neben cry3 konnten bislang noch einige weitere Proteine identifiziert werden, die über eine Transitse- quenz verfügen, welche einen Transport in Chloroplasten und Mitochondrien ermöglicht. Der genaue Mechanismus dieses dual targetings ist bislang jedoch nicht vollständig aufgeklärt (Carrie et al., 2009).
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Charakterisierung des Transport- und Assemblierungsverhaltens der Ferritine aus Arabidopsis thaliana

Charakterisierung des Transport- und Assemblierungsverhaltens der Ferritine aus Arabidopsis thaliana

Die in die Plastiden importierten Ferritine zeigen verschiedene Prozessierungsmuster (Abb. 2.3). Zum einen wird nur ein reifes Protein (AtFer1 und AtFer2) gebildet und zum anderen entstehen mindestens zwei reife Proteinbanden (AtFer3 und AtFer4). Im- munologisch konnte bislang eine einzelne Bande in Arabidopsis thaliana (Gaymard et al. (1996)) und in Reis nachgewiesen werden (Qu et al. (2005)). Diese Daten stimmen somit mit den Ergebnissen der Importexperimente zu der AtFer1 und AtFer2 Proteine ¨uberein. AtFer3 und AtFer4 weisen dagegen mindestens eine Doppelbande nach Import in die Chloroplasten auf. Interessanterweise zeigen nur diese beiden einander sehr ¨ahnlichen Arabidospsis Ferritine ein solches ungew¨ohnliches Bandenmuster. Die Inkubation der Vorl¨auferproteine von AtFer3 und AtFer4 mit Stromaextrakt f¨uhrte nur zu einem Pro- zessierungsprodukt (Abb. 2.4), so dass die beobachteten Banden nicht ausschließlich das Produkt der SPP-Spaltung sein k¨onnen. Daher muss im intakten Organell eine von der SPP unabh¨angige proteolytische Spaltung dieser Ferritine erfolgen. Das Auftreten sol- cher Doppelbanden wurde bereits mehrfach f¨ur pflanzliche Ferritine beschrieben (Laul- here et al. (1988), Proudhon et al. (1989), Laulhere et al. (1989), Dong et al. (2007)). In diesen Arbeiten konnte u.a. beobachtet werden, dass das gr¨oßere Ferritin (28 kDa) bei- spielsweise durch Inkubation mit Blattextrakt in die kleinere Form (26,5 kDa) ¨uberf¨uhrt werden kann (Laulhere et al. (1989), Lobr´eaux & Briat (1991), Masuda et al. (2001), Dong et al. (2007)). Zun¨achst wurde vermutet, dass das pflanzenspezifische Extensi- onspeptid (EP) vom Aminoterminus der Ferritine abgespalten wird (Abb. 1.4, Ragland et al. (1990)). Inzwischen haben allerdings Masuda et al. (2001) gezeigt, dass bei So- jabohnenferritin die carboxyterminalen 16 Aminos¨auren abgespalten werden, wodurch die E-Helix, welche an der Oberfl¨ache der Ferritinkomplexe liegt, fehlt (vgl. Abb. 1.3 und 2.2). Die Autoren vermuten daher, dass die Poren der 4-fold channel vergr¨oßert werden und konnten dies mit einer schnelleren Eisenabgabe aus Komplexen verk¨urzter Ferritinuntereinheiten belegen (Masuda et al. (2001)).
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Wirkspektrum und Signaltransduktionsmechanismus von oxidierten Lipiden in Arabidopsis thaliana

Wirkspektrum und Signaltransduktionsmechanismus von oxidierten Lipiden in Arabidopsis thaliana

Zur Identifikation von Transkriptionsfaktoren, die am PPA 1 - und OPDA-vermittelten Signalmechanismus beteiligt sind, wurden die Promotorbereiche der, durch PPA 1 -Behandlung mehr als dreifach induzierten, Gene auf häufig vorhandene Sequenzmotive mit Hilfe des „Motif Analysis Tools“ der Arabidopsis thaliana Internetseite (TAIR) (http://www.tair.com) untersucht. Die Ergebnisse belegten, dass etwa die Hälfte aller mehr als dreifach PPA 1 -induzierten Gene in den ersten 500 Basenpaaren ein Bindungsmotiv für TGA-Transkriptionsfaktoren (TGACG) enthalten. Um festzustellen, ob die Regulation der PPA 1 - und OPDA-responsiven Gene durch TGA- Transkriptionsfaktoren vermittelt wird, wurde eine Transkriptomanalyse unter Verwendung des ATH1 Chip in der Arabidopsis thaliana-Mutante tga2tga5tga6 durchgeführt. Die Dreifach-Mutante weist einen Defekt in der Bildung der drei TGA-Transkriptionsfaktoren TGA2, TGA5 und TGA6 auf. Von den 411 Genen, die in der Wildtyp-Pflanze durch PPA 1 mehr als zweifach reguliert wurden, waren 60 Prozent (247) in dieser Mutante nicht induziert. Dieses Ergebnis legt die Beteiligung von TGA2, TGA5 und/oder TGA6 an der PPA 1 -Signalweiterleitung nahe. Die bioinformatische Analyse der ersten 500 Basenpaaren der Promotorbereiche von den 247 Genen, die in der Wildtyp-Pflanze und nicht in der tga2tga5tga6 Mutante durch PPA 1 reguliert wurden, zeigte, dass 42 Prozent dieser Gene das TGA-Transkriptionsfaktor Bindungsmotiv TGACG enthalten (siehe Anhang Tabelle III). Dies bedeutet, dass 58 Prozent der TGA-abhängigen Genregulation entweder nicht über das Bindungsmotiv TGACG reguliert werden, oder alternativ indirekt durch TGA-Transkriptionsfaktoren reguliert werden, die an der Vermittlung von Phytoprostanwirkungen durch TGA2, TGA5 und TGA6 beteiligt sind.
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Identifizierung von MAP-Kinase-Substraten in Arabidopsis thaliana

Identifizierung von MAP-Kinase-Substraten in Arabidopsis thaliana

Als Versuchspflanzen wurden transgene Arabidopsis thaliana Col-0 verwendet, die mit der codierenden Sequenz für die MEK2 aus Nicotiana tabacum transformiert wurden. Die Sequenz ist so verändert, dass im translatierten Protein die Aminosäurereste T-227 und S-233 durch Asparaginsäure ersetzt sind. Die Expression dieses Proteins wird durch den Promotor GVG gesteuert und kann durch die Zugabe von DEX induziert werden (WT DD ). Es wurden auch Pflanzen verwendet, bei denen zusätzlich das Gen für MPK6 durch T-DNA- Insertionen ausgeschaltet wurden (mpk6 DD ). Zur Anzucht in Flüssigkultur wurden Samen oberflächensterilisiert. 50 ml 1/4 MS-Medium (Murashige and Skoog, 1962) in 250 ml Erlenmeyerkolben wurden mit je ca. 250 Samen inokuliert. Die Kolben wurden für zwei Tage bei 4 °C stratifiziert, um eine gleichzeitige Keimung zu gewährleisten. Danach wurden sie in einen Lichtschrank überführt, wo sie bei 22°C und Dauerlicht mit einer Intensität von ca. 90 µmol m -2 s -1 ohne Schütteln inkubiert wurden. Alle Salicylsäure- Vorbehandlungen erfolgten am zehnten Tag im Licht. Die Induktion der Expression des Transgens erfolgte am zwölften Tag im Licht.
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Identifizierung von MAP-Kinase-Substraten in Arabidopsis thaliana

Identifizierung von MAP-Kinase-Substraten in Arabidopsis thaliana

Als Versuchspflanzen wurden transgene Arabidopsis thaliana Col-0 verwendet, die mit der codierenden Sequenz für die MEK2 aus Nicotiana tabacum transformiert wurden. Die Sequenz ist so verändert, dass im translatierten Protein die Aminosäurereste T-227 und S-233 durch Asparaginsäure ersetzt sind. Die Expression dieses Proteins wird durch den Promotor GVG gesteuert und kann durch die Zugabe von DEX induziert werden (WT DD ). Es wurden auch Pflanzen verwendet, bei denen zusätzlich das Gen für MPK6 durch T-DNA- Insertionen ausgeschaltet wurden (mpk6 DD ). Zur Anzucht in Flüssigkultur wurden Samen oberflächensterilisiert. 50 ml 1/4 MS-Medium (Murashige and Skoog, 1962) in 250 ml Erlenmeyerkolben wurden mit je ca. 250 Samen inokuliert. Die Kolben wurden für zwei Tage bei 4 °C stratifiziert, um eine gleichzeitige Keimung zu gewährleisten. Danach wurden sie in einen Lichtschrank überführt, wo sie bei 22°C und Dauerlicht mit einer Intensität von ca. 90 µmol m -2 s -1 ohne Schütteln inkubiert wurden. Alle Salicylsäure- Vorbehandlungen erfolgten am zehnten Tag im Licht. Die Induktion der Expression des Transgens erfolgte am zwölften Tag im Licht.
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Charakterisierung eines neuartigen Zuckertransporters aus Arabidopsis thaliana

Charakterisierung eines neuartigen Zuckertransporters aus Arabidopsis thaliana

Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war die molekulare und biochemische Charakterisierung des AtMSBP1 (Arabidopsis thaliana Monosaccharid Binding Protein 1), eines neuartigen Proteins der Zuckertransporterfamilie aus Arabidopsis. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, das dieses Protein nicht nur strukturelle, sondern auch funktionelle Besonderheiten im Vergleich zu anderen bisher bekannten Zuckertransportern aus Arabidopsis aufweist. Mit Hilfe von „knock out“-Pflanzen konnte gezeigt werden, dass das Fehlen dieses in der äußeren Plastidenmembran lokalisierten Proteins zu einer erhöhten Empfindlichkeit auf phänotypischer und molekularer Ebene gegenüber verschiedenen Zucker führt. Diesem neuen Typ von Zuckertransportern, der in allen Angiospermen vorzukommen scheint, kann eine Rolle im Zuckersensing zugeordnet werden und damit ein weiterer Beitrag zur Aufklärung der komplexen Vorgänge des Zuckersensing in Pflanzen erbracht werden.
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Biochemische und physiologische Untersuchung der Phytochelatinsynthasen von Arabidopsis thaliana

Biochemische und physiologische Untersuchung der Phytochelatinsynthasen von Arabidopsis thaliana

An erster Stelle einen großen Dank an Professor Doktor Dierk Scheel, Direktor des Leibniz-Institutes für Pflanzenbiochemie und Leiter der der Abteilung Stress- und Entwicklungsbiologie, für die vorbildlichen Forschungsbedingungen, die für das gelingen dieser Arbeit sehr wichtig waren. Einen besonderen Dank an Doktor Stephan Clemens das wir zusammen einen kleinen aber bedeutenden Schritt in der Aufklärung der Funktion der Phytochelatinsynthasen erarbeitet haben. Sein umfangreiches Wissen war ein Garant für den Erfolg. Bedanken möchte ich mich auch bei allen der Arbeitsgruppe Metallhomöostase. Ich habe mich sehr über die gegenseitige Hilfe und über das Interesse in der Klärung kleiner Probleme gefreut. Danke hier vor allem Doktor Alexandra Trampczynska. Einen großen Dank verpflichtet bin ich Doktor Christoph Böttcher für die gemeinsame Etablierung der Methode zur Quantifizierung der Phytochelatinbildung in Arabidopsis thaliana. Sehr bemerkenswert sind seine chemischen Kenntnisse und sein Wissen in die Massenspektrometrie. Für die Finanzierung diese Arbeit möchte ich mich weiterhin bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft bedanken. Und Volker Weiske Danke ich für die Fertigstellung dieser Arbeit.
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Ein molekularer Mechanismus des „Primings” in Arabidopsis thaliana

Ein molekularer Mechanismus des „Primings” in Arabidopsis thaliana

Earlier results in the Conrath group indicated that the Elicitor-Responsive Mitogen-activated protein Kinase (ERMK) might play a role in priming of parsley suspension cells (Simonis, 2000). As a first step towards studying the molecular basis of priming a Basic Local Alignment and Search Tool (BLAST) sequence database search and sequence comparison have been performed. The parsley ERMK deduced amino acid sequence defined the MAPK 3 (MPK3) as its closest ortholog in Arabidopsis thaliana. The overall structure prediction based on deduced amino acid sequence of these two orthologous enzymes is highly conserved with a se- quence similarity of 83% (Ligterink et al., 1997). To investigate whether A. thaliana MPK3 might be an im- portant component of the priming/SAR mechanism, first it was assayed whether MPK3 is induced by various compounds that are known to induce the primed state and acquired immunity in A. thaliana. We employed foliar application of biologically active (SA, 4-chloro-SA (4-Cl-SA) and BTH) and inactive (3-hydroxy-benzoic acid (3-OH-BA)) compounds that are structurally related to SA (Fig. 1A) (Conrath et al., 1995). Some of these compounds have been reported to mimic SA by acting as natural inducers of enhanced resistance to patho- gens in A. thaliana and some other plant species (Ryals et al., 1996; Durrant and Dong, 2004). More recently, the biologically active salicylates (SA, 4-Cl-SA and BTH) have been shown to induce SAR and the primed state in Arabidopsis plants (Görlach et al., 1996; Kohler et al., 2002). The gene encoding MPK3 was activated only when plants were sprayed with these active compounds, but not upon spraying the biologically inactive, but structurally related, 3-OH-BA (Fig. 1B).
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Anreicherung und Charakterisierung von O-Methyltransferasen aus Arabidopsis thaliana

Anreicherung und Charakterisierung von O-Methyltransferasen aus Arabidopsis thaliana

Neben dem Nachweis bereits bekannter Proteine wird auch die Detektion und nachfolgende Cha- rakterisierung von Proteinen noch unbekannter Funktion innerhalb einer Gen- oder Proteinfamilie erleichtert. Ein Vertreter der Caffeoyl-CoA O -Methyltransferasen aus Arabidopsis thaliana, die AtCCoAOMT3, war mittels CCMS nur in Wurzeln erfassbar, was durch Transkriptdaten be- stätigt werden konnte. Diese Organspezifität sollte durch biochemische Analysen ergänzt wer- den, wobei ein in vitro Substrat (das Flavonol Quercetagetin) und der Phänotyp einer T-DNA- Insertionsmutante (erhöhte Keimungsinhibierung unter Salzstress) identifiziert werden konnte. Durch Sahr et al. (2010) wurde gleichzeitig bekannt, dass dieses Enzym in vitro die Methylie- rung eines N-terminalen Peptides eines Aquaporins katalysiert. Diese Resultate ließen Mutma- ßungen über eine Funktion in der Wasser- und Nährstoffzufuhr der Pflanze zu, welche durch die gezeigte Wurzelspezifität unterstützt wurde. Jedoch deuten Widersprüche in den Resultaten bei- der Arbeiten an, dass die Methylierung der in vitro Substrate in vivo fraglich ist. Deshalb sollten auch andere Möglichkeiten der Funktion der AtCCoAOMT3 im Wasser- und Nährstoffhaushalt der Pflanze in Betracht gezogen werden. Interessanterweise konnten die erhaltenen Hinweise der wurzelspezifischen Expression mittels CCMS nicht reproduziert werden. Hier stößt diese Metho- de an ihre Grenzen. Da es sich bei den angewendeten Capture Compounds wahrscheinlich um Sonden handelt, die aktives bzw. korrekt gefaltetes Protein anreichern, könnte eine Begründung die Inaktivität der AtCCoAOMT3 unter den hier gewählten Bedingungen sein. Andererseits ist es auch denkbar, dass eine geringe Abundanz des Proteins und die Bindung an eine Membran problematisch waren.
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Funktionelle Charakterisierung von flavinhaltigen Monooxygenasen in Arabidopsis thaliana

Funktionelle Charakterisierung von flavinhaltigen Monooxygenasen in Arabidopsis thaliana

Die FMO1 ist ein durch biotische Stressoren induzierbar exprimiertes Gen (Bartsch et al., 2006; Mishina et al., 2006; Koch et al., 2006;). Die induzierbaren Verteidigungsmechanismen der Pflanze sind sehr bedeutend für deren Fitness. Da ihr Einsetzen auch häufig ein vermindertes Wachstum mit sich bringt, werden sie nur nach Befall induziert (Heil und Baldwin, 2002). Die Produktion von Abwehrsubstanzen lohnt sich nur ab einer bestimmten Anzahl von Herbivoren oder Pathogenen, weil sie Energie und Nährstoffe erfordert (Heil und Baldwin, 2002). Das heißt, die Verteidigungsmaßnahmen einer Pflanze konkurrieren mit anderen physiologischen Prozessen, wie Wachstum und Reproduktionsraten (Frucht- und Samenbildung), um die verfügbaren Ressourcen. Dies spiegelt sich in der Erfahrung wider, dass gezüchtete Nutzpflanzen gegenüber wild wachsenden Vorfahren zwar ertragreicher, aber dafür krankheitsanfälliger sind (Heil und Baldwin. 2002). Zudem haben Laborversuche gezeigt, dass resistenzerhöhende Mutationen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu verringerter Samenproduktion führen (Heil und Baldwin, 2002). Im Falle der FMO1 scheint trotz der Induktion durch biotische Stressoren kein negativer Einfluss auf das Wachstum oder die Adaptionsfähigkeit an abiotische Stressoren vorzuliegen. Außerdem ist die FMO1 während der Evolution der Pflanze stark konserviert. Die Analysen in den Datenbanken TAIR bzw. NCBI zeigten, dass ein FMO-Gen, was eine hohe phylogenetische Verwandtschaft zur FMO1 hat, auch in evolutiv niederen Organismen wie Physcomittrella patens und Selaginella, deren Genom vollständig sequenziert wurde, vorhanden ist. Das ist ein erster Hinweis auf eine grundsätzlich wichtige Rolle der FMO1 in Pflanzen.
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Molekulare Funktionsanalyse von Signaltransduktionssystemen in Arabidopsis thaliana

Molekulare Funktionsanalyse von Signaltransduktionssystemen in Arabidopsis thaliana

One of the signal transduction systems mediates the specific transmission of calcium signals. Signal transmission is achieved by calcium sensors and their interacting partners. One type of such calcium sensors are the AtCBLs (Calcineurin B-like), a protein family comprising of ten members in Arabidopsis thaliana. These AtCBLs interact with a protein kinase family of 25 members, the AtCIPKs (CBL-interacting protein kinases). The proteins of both families interact in a yeast two-hybrid system in a specific manner. A 24 amino acid domain has been identified to be required and sufficient for the interaction. Factors generating specificity in this system are specific complex formation and the different localizations of the CBLs and CIPKs within the cell as well as a differential expression of the proteins within the plant. Therefore a specific network for signal transduction in various calcium dependent pathways can be postulated. Those calcium signals are known to be generated in response to environmental and biotic stimuli. Indeed, in this work drastic changes in the perception of external stimuli could be analyzed in T-DNA insertion mutants with insertions in the CBL1 gene and in the CIPK1 gene. The insertions in the cbl1 mutant as well as in the cipk1 mutant render plants more sensitive to drought and heat. Whereas the cbl1 mutant exhibits a higher sensitivity the cipk1 mutant appears less sensitive to salt. As a result of these mutant analyses it can be assumed that though there are high identities within amino acid sequences in the protein families of the CBLs and the CIPKs there is only limited functional redundancy. Signal transduction occurs specific by passing the signal from one CBL to its specific interacting CIPK. AtCBL1 seems to be a general calcium sensor involved in different pathways.
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Untersuchungen zur Expression und Lokalisationen des Cryptochrom3 in Arabidopsis thaliana

Untersuchungen zur Expression und Lokalisationen des Cryptochrom3 in Arabidopsis thaliana

Phytochrome (im Folgenden als phy bezeichnet) sind dimere Proteine, die durch Absorption von rotem bzw. dunkelrotem Licht einer reversiblen Konformationsänderung unterliegen, die ihre Absorptions-Eigenschaften verändern. Sie liegen in der Zelle in der sog. Pr oder Pfr Form vor, wobei die Pr-Form rotes (660 nm, red ), die Pfr-Form dunkelrotes (730 nm, far-red ) Licht absorbiert und das Protein damit in die jeweils andere Form überführt (Übersichtsartikel Batschauer, 1998; Rockwell et al. , 2006). Daraus ergibt sich ein Equilibrium aus Pr- und Pfr-Form, das der Pflanze die Lichtbedingungen am Standort reflektiert. Phytochrome steuern verschiedene Prozesse in der Pflanzenentwicklung (Keimung, De-Etiolierung, Blütenentwicklung), die zusammen als Photomorphogenese bezeichnet werden. Phytochrome von Arabidopsis thaliana haben ein MW von ~125 kDa und tragen N-terminal den Chromophor Phytochromobilin - ein offenkettiges, lineares Tetrapyrrol, welches kovalent gebunden ist. Die cis-trans Isomerisierung des Chromophors (Mancinelli , 1994), die die Absorptionseigenschaften des Photorezeptors verändert, ist auch Auslöser für die lichtinduzierte Konformationsänderung des Proteins (Park et al. , 2000). Phytochrome besitzen eine photosensorische Domäne (N- terminal) und einer regulatorischen Domäne (C-terminal), die für die Dimerisierung zuständig ist. Die photosensorische Region ist aus einem PAS-ähnlichen Motiv, einer GAF- Domäne (entfernt verwandt mit PAS, kommt vor in pflanzlichen Phytochromen und cGMP- spezifischen Phosphodiesterasen), die den Chromophor trägt, und einer Phytochrom- spezifischen Domäne aufgebaut. Im C-Terminus sind zwei PAS-Domänen (in pflanzlichen Phytochromen) sowie eine Histidin-Kinase ähnliche Domäne (HKRD) konserviert (Abb. 1.2). Der C-Terminus vermittelt die Homodimerbildung und ist obligat für die Bildung von
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Charakterisierung des Arabidopsis thaliana Aquaporins AtNIP1;1

Charakterisierung des Arabidopsis thaliana Aquaporins AtNIP1;1

Alonso, J.M., Stepanova, A.N., Leisse, T.J., Kim, C.J., Chen, H., Shinn, P., Stevenson, D.K., Zimmermann, J., Barajas, P., Cheuk, R., Gadrinab, C., Heller, C.m Jeske, A., Koesema, E., Meyers, C.C., Parker, H., Prednis, L., Ansari, Y., Choy, N., Deen, H., Geratl, M., Hazari, N., Hom, E., Karnes, M., Mulholland, C., Ndubaku, R., Schmidt, I., Guzman, P., Aguilar-Henonin, C., Schmid, M., Weigel, D., Carter, D.E., Marchand, T., Risseeuw, E., Brogden, D., Zeko, A., Crosby, W.L., Berry, C.C., Ecker, J.R. (2003). Genome-Wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301, 653-657. Beitz, E., Wu, B., Holm, L.M., Schultz, J.E., Zeuthen, T. (2006). Point mutations in the aromatic/arginine region in aquaporin 1 allow passage of urea, glycerol, ammonia, and protons. PNAS 103 (2), 269-274.
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Phosphatidylglycerophosphat-Synthasen aus Arabidopsis thaliana

Phosphatidylglycerophosphat-Synthasen aus Arabidopsis thaliana

3. Ergebnisse und Diskussion 3.1 Phosphatidyltransferasegene im Genom von A. thaliana Zur Identifizierung und Isolierung von Genen für CDP-DAG-abhängige Phosphatidyltransferasen aus Pflanzen stehen eine Reihe von Informationen zur Verfügung. Zum einen wurde die Sequenz des Genoms von A. thaliana im Laufe dieser Arbeit komplettiert und in internationalen Gendatenbanken zur Verfügung gestellt, und zum anderen sind eine ganze Reihe von Phosphatidyltransferasegenen unterschiedlichster Herkunft bereits beschrieben und kloniert worden. Mit den bekannten Phosphatidyltransferasesequenzen aus dem Dendrogramm in Abb. 3.1 wurden daher Datenbanken abgesucht und hierbei fünf A. thaliana Gene identifiziert. Wie in Abb. 3.1 dargestellt, weisen die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der fünf A. thaliana-Gene deutlich größere Ähnlichkeiten zu Phosphatidyltransferasen des DGAR-Typs als zu denen des HKD-Typs auf. Interessanterweise enthält das Genom von A. thaliana keine Gene, die für Proteine aus der HKD-Gruppe kodieren und gleichzeitig Ähnlichkeiten zu Phosphatidyltransferasen zeigen. Hingegen finden sich einige Transkriptionsfaktoren der Homöobox-Leucin-Zipper-Klasse, welche das HKD-Motiv enthalten. HAT3 (Homöobox Arabidopsis thaliana; Abb. 3.1) hat von allen HAT-Proteinen die höchste Ähnlichkeit zu den Phosphatidyltransferasen. Weitere Sequenzanalysen ließen es allerdings für äußerst unwahrscheinlich erscheinen, dass diese Gene Phosphatidyltransferasen kodieren, da HAT3 weitaus höhere Ähnlichkeiten zu anderen HAT-Proteinen (HAT1 bis HAT7) und Transkriptionsfaktoren besitzt. Eine weitere Klasse von Proteinen, die ein bis zwei HKD-Motive enthalten, sind die Phospholipasen des D-Typs (PLD). In gewisser Weise handelt es sich auch bei diesen Enzymen um Phosphatidyltransferasen, denn diese katalysieren den Transfer des Phosphatidylrestes auf Wasser oder, unter in vitro-Bedingungen, auch auf Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol (Munnik et al., 1995). Allerdings beschränken sich die Ähnlichkeiten der PLDs zu den Phosphatidyltransferasen allein auf das HKD-Motiv. Alle möglichen Phosphatidyltransferasen aus A. thaliana gehören also zu der Gruppe von Proteinen, welche das sogenannte CDP-Alkohol-Phosphotransferase-Motiv (Dx 2 DGx 2 ARx 8 Gx 3 Dx 3 D) enthalten.
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Isolierung von MAP-Kinase-Proteinkomplexen aus Arabidopsis thaliana

Isolierung von MAP-Kinase-Proteinkomplexen aus Arabidopsis thaliana

In verschiedene Kinasen (unter anderem den MAPKs ERK2, JNK2, p38α und Fus3) konnten jedoch bereits Mutationen an der ATP-Bindetasche vorgenommen werden, welche die Funktion nicht eliminierten und gleichzeitig die Sensibilisierung gegen den Inhibitor 1-Naphthyl-PP1 bewirkten (Bishop et al., 2000; Bishop et al., 2001; Carroll et al., 2001; Zhang et al., 2005) (Abb. 4.2). Für Kinasen aus Pflanzen wurde diese Strategie bisher am Beispiel einer Kalzium-abhängigen Proteinkinase und der Serin/Threonin-Kinase Pto getestet (Böhmer, 2005; Zhang et al., 2005). Für das Modellenzym NtCDPK2 konnte im Anschluss an die entsprechende Mutation im Rahmen der biochemischen Charakterisierung kein Verlust der Kinaseaktivität und Substratspezifität nachgewiesen werden (Böhmer, 2005). Die Generierung von chemisch hemmbaren Mutantenlinien erfolgte anschließend in Arabidopsis thaliana am Beispiel der NtCDPK2-Isoform AtCPK1. Die Zugabe von 100 µM 1-Naphthyl-PP1 bewirkt nach Kältestress unter anderem eine 60%ige Reduktion der Expression des Kältemarkers CBF3 (Böhmer, 2005). Bei der Kinase Pto aus Tomate resultiert die Mutation der ATP- Bindetasche, welche die Sensibilisierung gegen 1-Naphthyl-PP1 ermöglicht, im Verlust der Kinaseaktivität, wie er bisher bei etwa 30% der derartig mutierten Kinasen beobachtet wurde (Zhang et al., 2005). Für einige dieser inaktivierten Kinasen konnte durch eine zweite Mutation in der N-terminalen Untereinheit der Kinasen die Kinaseaktivität ganz (z.B. GRK2) oder teilweise (z.B. Pto) wiederhergestellt werden. Angaben zu den Auswirkungen der zweifachen Mutagenese von Pto in planta sind nicht verfügbar. Diese Daten zeigen, dass bei der Umgehung der Embryoletalität der mpk3/mpk6-Doppelnullmutante auch Strategien aus dem Bereich der chemischen Genetik zum Erfolg führen könnten.
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Expressionsprofile von ABC-Transportern in Arabidopsis thaliana

Expressionsprofile von ABC-Transportern in Arabidopsis thaliana

Eine weitere Subklasse umfasst die PDR-Proteine (pleiotropic drug resistance). Im Vergleich zu den beiden vorherigen Subklassen ist bei dieser Subfamilie die Reihenfolge der Domänen vertauscht. Die erste Domäne ist eine ABC-Domäne gefolgt von einer transmembranen Domäne, wodurch sich die Abfolge ABC-TM-ABC-TM ergibt (Balzi & Goffeau, 1994; Smart & Flemings, 1996). Der aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) isolierte ABC-Transporter PDR5 wird unter Stressbedingungen, wie Hitzeschock oder Anwesenheit von Xenobiotika, induziert und verleiht Resistenz zum Beispiel gegenüber Cycloheximid (Balzi & Goffeau, 1994). Davon ausgehend wird postuliert, dass dieser Transporter eine Rolle bei der Entgiftung zytotoxischer Verbindungen oder der Metabolite spielt, die während des Wachstums und insbesondere unter umweltbedingten Stressbedingungen akkumulieren. In der aquatischen Pflanze Spirodela polyrrhiza konnte ein Homolog des PDR5-Proteins kloniert werden (TUR2) (Smart & Flemings, 1996). Behandlung der Pflanzen mit Abscisinsäure führte zu einer Akkumulation der TUR2-mRNA, ebenso führten Salz- und Kältestress zu einer Induktion. Somit könnten diese Proteine bei dem Transport der unter Stressbedingungen entstehenden Metabolite involviert sein (Smart & Flemings, 1996). In Nicotiana plumbaginifolia wurde erst kürzlich ein ABC-Transporter dieser Subfamilie identifiziert. Vermutlich ist dieser Transporter NpABC1 in der Sekretion von sekundären Metaboliten involviert, die in der Pflanzenabwehr eine Rolle spielen (Jasinski et al., 2001). In Arabidopsis thaliana sind bisher keine homologen Sequenzen experimentell untersucht worden. Obwohl diese Subfamilie sowohl in Arabidopsis thaliana als auch in Hefe vertreten ist, ist bisher kein homologes Gen im menschlichen Genom identifiziert worden.
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Functional analysis of PIP2 aquaporins in Arabidopsis thaliana

Functional analysis of PIP2 aquaporins in Arabidopsis thaliana

Plants harbor about 30 genes encoding major intrinsic proteins (MIP) which were named aquaporins because of the frequently observed water channel activity and their putative involvement in water relations. Plasma membrane intrinsic proteins (PIP) are subdivided into two groups with five PIP1 and eight PIP2 members in the model plant Arabidopsis thaliana. PIP2 genes are highly homologous to each other, which might indicate a redundant function. However, several lines of evidence argue for gene-specific and non-redundant functions. PIP2 genes exhibit overlapping, but differential expression patterns when assessed by promoter::GUS transgenic lines. Most PIP2 genes were expressed in the region of the vascular tissue, however with differential cellular patterns. PIP2;5 and PIP2;7 were more uniformly found in leaves. PIP2;4 was the only root-specific member and preferentially expressed in outer cell layers, whereas PIP2;6 and PIP2;8 were mostly found in young leaves with a distinct expression. PCA analyses based on publicly available stress-responsive expression patterns revealed distinct transcriptional responsiveness of PIP2 genes. No visible phenotypes were observed for pip2 knock-out lines under normal growth conditions. However, pip2;3 mutants specifically showed salt-sensitivity, although the duplicated gene PIP2;2 has only eight amino acids different from PIP2;3 that mostly cluster in the region of the extracellular loop C. Transcriptional analysis using a custom-made DNA array focusing on membrane proteins indicated that loss-of-function of distinct PIP2 genes did not interfere with major transport processes, at least at the transcriptional level. For several mutants of abundantly expressed PIP2 isoforms, root transcriptome analysis was extended to the whole genome using Affymetrix ATH1 GeneChip. Furthermore, PIP2 co-expression analyses revealed enrichment for different functional categories. Only PIP2;1 and PIP2;2 showed significant correlations with other PIP genes, however most PIP2 genes were also correlated to TIP isoforms, suggesting an functional relationship of plasma membrane and tonoplast permeabilities. Surprisingly, at the protein level, the loss of PIP2;1 or PIP2;2 specifically provoked a decrease in PIP1 proteins indicating a dependence of PIP1 stability on these PIP2 members.
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Biogeographie und Ökologie von Arabidopsis thaliana

Biogeographie und Ökologie von Arabidopsis thaliana

A Geographical Information System (GIS) is used to analyse allelic information of 13 sequenced loci of natural populations of Arabidopsis thaliana and to identify geographical structures. GIS provides tools for visualization and analysis of geographical population structures using molecular data. The geographical distribution of the number of variable positions in the alignments, the distribution of recombinant sequence blocks, and the distribution of a newly defined measure, the differentiation index, are studied. The differentiation index is introduced to measure the sequence divergence among individual plants sampled from various geographical localities. The numbers of variable positions and the differentiation index are also used for a metadata analysis covering about 26 kb of the genome. This analysis reveals, for the first time, differences in DNA sequence structures of geographically different populations of A. thaliana. The broadly defined west Mediterranean region consists of accessions with the highest numbers of polymorphic positions followed by the west European region. The GIS technology Kriging is used to define Arabidopsis specific diversity zones in Europe. The highest genetic variability is observed along the Atlantic coast from the western Iberian Peninsula to southern Great Britain, while lowest variability is found in central Europe.
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Remorin proteins in Arabidopsis thaliana

Remorin proteins in Arabidopsis thaliana

Die Plasmamembran lebender Zellen stellt die Hauptbarriere für alle Arten von extrazellulären Signalen dar. Viele davon werden ins Innere der Zelle weitergeleitet, hier lösen sie im Kern transkiptionelle Veränderungen und damit die Anpassung der Zelle auf Proteinebene aus. Andere wiederum werden direkt erkannt und in unmittelbare molekulare Antworten umgewandelt, wie zum Beispiel die Sekretion von gespeicherten Stoffen oder Konformations-änderungen von Proteinen. Besonders in Pflanzen, welche durch ihre sesshafte Lebensweise auf die rechtzeitige und spezifische Erkennung von Umweltveränderungen angewiesen sind, hat sich ein höchst diverses Rezeptorsystem entwickelt. In der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana, der in dieser Arbeit verwendeten Modellpflanze, wurden 610 verschiedene Rezeptorproteine identifiziert, welche wiederum von zahlreichen interagierenden, und bis jetzt weitestgehend unerforschten Proteinen reguliert werden. Als entscheidendes Prinzip, dieses Aufgebot an membran-gebundenen Komponenten von Signalkaskaden zu organisieren, gilt inzwischen die zeitliche und lokale Kompartimentierung der Plasmamembran. Durch Akkumulation relevanter Bestandteile von biologischen Prozessen in sogenannten Membrandomänen werden kurze Reaktionszeiten und die unmittelbare Signalweiterleitung garantiert. Besonders wichtig bei solchen Prozessen sind sogenannte Gerüstproteine, welche als Adaptoren zwischen anderen Komponenten fungieren.
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