Designer Host Defense Peptide zur onkolytischen Therapie von Liposarkomen

Volltext

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Aus der

Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, Handchirurgiezentrum

des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. H.U. Steinau

Designer Host Defense Peptide

zur onkolytischen Therapie von Liposarkomen

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Cornelius Dieter Schubert aus Roth

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Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. L. Steinsträßer Koreferent: Prof. Dr. med. S. Hahn

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ABSTRACT

Cornelius Dieter Schubert

Designer Host Defense Peptide

zur onkolytischen Therapie von Liposarkomen Problem:

Weichgewebssarkome stellen eine heterogene Gruppe seltener sowie hochaggressiver maligner Tumoren dar. Aktuelle Therapieoptionen sind limitiert und die Ansprechrate auf Chemotherapeutika ist immer noch unbefriedigend. Host Defense Peptide (HDPs) als Teil des angeborenen Immunsystems könnten in Zukunft eine Schlüsselrolle in der Sarkomtherapie spielen. Ziel meiner in vitro und in vivo Studie war es, ein Designer-HDP auf seine onkolytische Wirkung gegenüber Liposarkomen, den häufigsten Weichgewebssarkomen, hin zu untersuchen sowie den genauen Wirkmechanismus hierbei zu analysieren.

Methode:

In vitro: Die humane Liposarkomzelllinie SW-872 und primäre humane Fibroblasten als Kontrollzellen wurden mit [D]-K3H3L9 inkubiert, einem 15-mer D,L-Aminosäure Designer-HDP. Die antiproliferative (BrdU-Assay) wie

auch die antimetabolische Wirkung (MTT-Assay) wurde im Vergleich zu aktuellen klinischen „Gold-Standard“-Chemotherapeutika (Doxorubicin, Vincristin, Methotrexat, Ifosfamid) analysiert. Zudem wurde die DNA-Fragmentierung (TUNEL-Assay) unter HDP-Inkubation untersucht. Der onkolytische Wirkmechanismus wurde mittels FACS-Analyse undkonfokaler Laser Scanning Mikroskopie erforscht.

In vivo: Durch subkutane Injektion von SW-872 Liposarkomzellen wurde in athymischen Nacktmäusen (Foxn1nu/nu) Tumorwachstum induziert. Ab einem Tumorvolumen von 200 mm3 wurde [D]-K3H3L9

(Einzeldosis: 8,5 mg/kg; n=7) dreimal pro Woche über einen Zeitraum von 3 Wochen intratumoral injiziert. PBS diente als Kontrolle (n=5). Die Proliferationsrate, Mitoserate, Gefäßdichte, das Ausmaß des nekrotischen Areals sowie Zeichen der Apoptose bzw. Nekrose wurden histologisch und immunhistochemisch verglichen.

Ergebnis:

In vitro: [D]-K3H3L9 reduzierte hochsignifikant (p<0,01) die Zellproliferation und den Zellmetabolismus.

Verglichen mit aktuellen klinischen „Gold-Standard“-Chemotherapeutika erwies sich das Peptid als vergleichbar antiproliferativ bzw. als stärker antimetabolisch wirksam. Der TUNEL-Assay zeigte eine dosisabhängige genotoxische Wirkung. FACS-Analyse und konfokale Laser Scanning Mikroskopie bestätigten die Zellnekrose als primären onkolytischen Wirkmechanismus.

In vivo: Zum Versuchende war das Tumorvolumen der Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe hochsignifikant (p<0,01) reduziert. Es betrug lediglich 13,1 % des Tumorvolumens der Kontrollgruppe. Makroskopisch konnte in 43 % volle Remission und in 43 % Teilremission beobachtet werden. Histologische und immunhistochemische Analysen zeigten in der Behandlungsgruppe eine hochsignifikante Reduktion der Proliferationsrate (-87%), eine Verminderung der Mitoserate (-39 %), eine signifikante Abnahme der Gefäßdichte (-52%) sowie eine Vergrößerung der nekrotischen Fläche (+100 %). Die morphologische Analyse bestätigte die Zellnekrose als wahrscheinlichsten onkolytischen Wirkmechanismus in vivo.

Diskussion:

Zusammenfassend konnte ich in meiner Forschungsarbeit zeigen, dass das Designer-HDP [D]-K3H3L9

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Für

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INHALTSVERZEICHNIS

Seite 1. EINLEITUNG ....……….………...10 1.1. Weichgewebssarkome .………...10 1.1.1. Definition ………... 10 1.1.2. Epidemiologie ...………....11 1.1.3. Ätiologie ………... 13 1.1.4. Klinisches Erscheinungsbild ………... 14

1.1.5. Pathologie und Staging ………... 16

1.1.6. Therapieoptionen ……….……...20

1.1.6.1. Chirurgische Therapie ………...20

1.1.6.2. Strahlentherapie ………...21

1.1.6.3. Chemotherapie ………...22

1.2. Host Defense Peptide ………... 25

1.2.1. Definition ………...25 1.2.2. Wirkungsspektrum ………... 26 1.2.2.1. Antimikrobielle Aktivität ………... 26 1.2.2.2. Immunmodulatorische Aktivität ………... 27 1.2.2.3. Wundheilung ………...28 1.2.2.4. Onkolytische Aktivität ………... 28 1.2.3. Molekularer Aufbau ………... 29 1.2.4. Wirkmechanismus ………...32

1.2.5. Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 ………... 35

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3. MATERIAL UND METHODIK ………... 38

3.1. Laborbedarf ………... 38

3.1.1. Reagenzien ………... 38

3.1.2. Puffer und Lösungen ………... 42

3.1.3. Labormaterialien und Geräte ………... 43

3.2. Zellkultur ………... 47

3.2.1. Zellen ………... 47

3.2.2. Isolierung primärer humaner Fibroblasten ………... 48

3.2.3. Peptide und Chemotherapeutika ………...49

3.3. In Vitro Analyse ………... 50

3.3.1. Proliferations-Analyse: BrdU-Assay ………...50

3.3.2. Vitalitäts-Analyse: MTT-Assay ………... 51

3.3.3. DNA-Fragmentierung: TUNEL-Assay ………... 52

3.3.4. Zelltod-Differenzierung: FACS-Analyse ………... 54

3.3.5. Zelluläre Peptidlokalisation: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie …...55

3.4. In Vivo Analyse ………... 57

3.4.1. Tiere und Haltung ………... 57

3.4.2. Sarkom Xenograft Model ………... 57

3.5. Histologische Analyse ………... 60

3.5.1. Histologische Färbungen ………... 60

3.5.2. Immunhistochemische Färbungen ………... 60

3.5.3. Auswertung ………... 61

(7)

4. ERGEBNISSE ………... 63 4.1. In Vitro ………... 63 4.1.1. Proliferations-Analyse: BrdU-Assay ………...63 4.1.2. Vitalitäts-Analyse: MTT-Assay ………... 64 4.1.3. DNA-Fragmentierung: TUNEL-Assay ………...67 4.1.4. Zelltod-Differenzierung: FACS-Analyse ………... 69

4.1.5. Zelluläre Peptidlokalisation: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie …….. 72

4.2. In Vivo ………... 73

4.2.1. Sarkom Xenograft Model ………... 73

4.3. Histologie ………... 76 4.3.1. Proliferation ………... 76 4.3.2. Nekrotische Fläche ………...80 4.3.3. Angiogenese ………...81 4.3.4. Morphologie: Semidünnschnitt-Verfahren ………...82 5. DISKUSSION ………... 84

5.1. Onkolytische Wirksamkeit in vitro ………...85

5.2. Onkolytische Wirksamkeit in vivo ………...92

5.3. Onkolytischer Wirkmechanismus ………... 98

6. ZUSAMMENFASSUNG ………... ...104

7. LITERATUR ………...107

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VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN

7-AAD 7-Amino-Actinomycin

22RV1 Humane Prostatakarzinom-Zelllinie 22RV1

AJCC American Joint Committee on Cancer

AS Aminosäure

BrdU Bromdesoxyuridin

c-erbB2 Cellular avian erythroblastosis homologue B2 – Gen

C2H6O Ethanol

CHOP C/EBP-homologous protein

CL1 Humane Prostatakarzinom-Zelllinie CL1

CoCl2 Cobaltdichlorid

DAPI 4′,6-Diamidin-2’-phenylindol-dihydrochlorid

D-HDP D-Aminosäuren Host Defense Peptid

D-L-HDP D- und L-Aminosäuren Host Defense Peptid

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

dTTP Desoxythymidintriphosphat

dUTP 2'-Deoxyuridine 5'-Triphosphate

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FACS Fluorescence-activated cell sorting

FBS Fetales Rinderserum (engl.: fetal bovine serum)

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FNCLCC French Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer

g Erdbeschleunigung

G Grading

GIST Gastrointestinaler Stromatumor

H Histidin

HCHO Methanal

HCl Salzsäure

HDP Host Defense Peptid

H&E Hämatoxylin-Eosin

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HIV Humanes Immundefizienz-Virus

HPF High Power Field

HSV Herpes-simplex-Virus

IC50 Mittlere inhibitorische Konzentration IC100 Komplette inhibitorische Konzentration

IVC Individuell ventilierter Käfig (engl.: individually ventilated cage)

K Lysin

L Leucin

L-HDP L-Aminosäuren Host Defense Peptide

M Fernmetastase (TNM-Klassifikation)

M Molar

MDM2 Mouse double minute 2 - Gen

MG Molekulargewicht

mM Milimolar

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

N Regionärer Lympknoten (TNM-Klassifikation)

N2 Stickstoff

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxid

N-myc V-Myc Myelocytomatosis viral related oncogene, Neuroblastoma derived - Gen

N2O Distickstoffmonoxid

O2 Sauerstoff

OL Humane Vorhaut-Fibroblasten OL

p Irrtumswahrscheinlichkeit

PBS Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (engl.: phosphate buffered saline)

PBS-T PBS-Tween-20

PS Phosphatidylserin

ras Rat sarcoma - Gen

RP-HPLC Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl.: reverse phase high performance liquid chromatography)

SCC Standard saline citrate

SEM Standardfehler (engl.: standard error of the mean)

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SW-872 SW-872 Liposarkomzelllinie

T Primärtumor (TNM-Klassifikation)

TdT Terminale Deoxynucleotidyl Transferase

TLR-2 Toll-like-Rezeptors 2

TLS Translocated in liposarcoma - Gen

TNF-α Tumornekrosefaktor-α

Tris HCl Tris (hydroxymethyl)-aminomethan-hdyrochlorid

TUNEL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-mediated 2'- Deoxyuridine 5'-Triphosphate (dUTP) Nick-End labeling

UICC Union Internationale Contre le Cancer

µl Mikroliter

µM Mikromolar

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VERZEICHNIS DER TABELLEN

Tabelle 1 Tumor-Staging (S. 17)

Tabelle 2 Tumor-Grading (S. 18)

Tabelle 3 TNM-Klassifikation (S. 19)

Tabelle 4 BrdU-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen (S. 51)

Tabelle 5 MTT-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen (S. 52)

Tabelle 6 TUNEL-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen (S. 54)

Tabelle 7 BrdU-Assay - IC50-Werte (S. 66)

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VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN

Abbildung 1 Weichgewebssarkom - Verteilung (S. 12)

Abbildung 2 Liposarkom - Klinisches Erscheinungsbild (S. 14)

Abbildung 3 Weichgewebssarkom - Lokalisation (S. 15)

Abbildung 4 AktuellerTherapiealgorithmus bei Weichgewebssarkomen (S. 24)

Abbildung 5 HDP-Wirkungsspektrum (S. 25)

Abbildung 6 HDP-Design (S. 30)

Abbildung 7 HDP-Wirkmechanismus (S. 33)

Abbildung 8 Sarkom Xenograft Model (S. 59)

Abbildung 9 Nekrosenausmessung (S. 62)

Abbildung 10 BrdU- bzw. MTT-Assay (S. 65)

Abbildung 11 TUNEL-Assay (S. 68)

Abbildung 12 FACS-Analyse – Scatterplot (S. 70)

Abbildung 13 FACS-Analyse (S. 71)

Abbildung 14 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (S. 72)

Abbildung 15 Sarkom Xenograft Model (S. 74)

Abbildung 16 Tumorgewicht (S. 74)

(13)

Abbildung 18 Peptidinjektionsareal (S. 77)

Abbildung 19 High Power Field Auszählung – Proliferation (S. 78)

Abbildung 20 Proliferationsrate (S. 78)

Abbildung 21 High Power Field Auszählung – Mitose (S. 79)

Abbildung 22 Mitoserate (S. 79)

Abbildung 23 Tumorausmessung (S. 80)

Abbildung 24 Nekrotischer Tumoranteil (S. 80)

Abbildung 25 High Power Field Auszählung – Angiogenese (S. 81)

Abbildung 26 Angiogenese (S. 81)

Abbildung 27 Semidünnschnittverfahren – Behandlungsgruppe (S. 82)

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1. EINLEITUNG

1.1. WEICHGEWEBSSARKOME

1.1.1. Definition

Weichgewebssarkome stellen eine heterogene Gruppe seltener, hochaggressiver maligner Tumoren dar. Zusammen mit den malignen Knochensarkomen werden sie der Übergruppe der Sarkome zugeteilt [32]. Der Begriff Sarkom geht ursprünglich auf den griechischen Arzt und Anatom Galenos von Pergamon (129 n.Chr – 216 n.Chr) zurück und leitet sich von der griechischen Bezeichnung für Fleisch, „Sarkos“, ab. Er bezieht sich auf das fleischartige makroskopische Aussehen dieser Tumorart [71, 114].

(15)

1.1.2. Epidemiologie

Obwohl beim Menschen das Weichgewebe 50 % der Gesamtkörpergewebsmasse ausmacht [203], stellen Weichgewebssarkome weniger als 1 % aller maligner

Tumoren dar [76]. Mit einer jährlichen Inzidenz von nur 2-4

Neuerkrankungen / 100.000 Einwohner sind sie relativ selten. In der Bundesrepublik Deutschland werden pro Jahr lediglich ca. 2500 - 3000 Fälle neu diagnostiziert, wobei Männer etwas häufiger betroffen sind als Frauen [51]. Das mediane Diagnosealter beträgt 65 Jahre [51]. Durchschnittlich gehört mit einem Anteil von 15 % an allen Weichgewebssarkomen das Liposarkom zu den häufigsten Vertretern. Innerhalb der Liposarkome wiederum dominierend sind die drei histologischen Haupttypen das gut-differenzierte, das myxoide sowie das pleomorphe Liposarkom [122]. Mit 12 %, sind zudem das Leiomyosarkom, mit

10 % das Synovialsarkom und mit 6 % der maligne periphere

Nervenscheidentumor relativ häufig [30]. Auch im operativen Referenzzentrum für Gliedmaßentumore des BG Klinikums Bergmannsheil in Bochum stellt sich ein ähnliches Bild dar und so nimmt das Liposarkom mit einem Anteil von 22,9 % auch hier die Mehrheit aller behandelten Weichgewebssarkome ein (Abb. 1).

(16)

Liposarkom: 22,9% Malignes fibröses Histiozytom: 17,5%

Leiomyosarkom:10,1% Fibromatose: 6,5%

Myxofibrosarkom: 6,5% Synovialsarkom: 6,4% Maligner peripherer Nervenscheidentumor: 5,6% Spindelzellsarkom: 3,6%

Rhabdomyosarkom: 3,0% Dermatofibrosarcoma protuberans: 2,8% Fibrosarkom: 2,6% Myofibroblastisches Sarkom: 2,3% Hämangio-Tumoren: 2,1% Epitheloides Sarkom: 1,8% Extraskelettales Ewing-Sarkom: 1,8% Klarzellsarkom: 1,5% Extraskelettales Chondrosarkom: 1,1% Seltene Typen: 0,9%

Alveoläres Weichgewebssarkom: 0,6% Extraskelettales Osteosarkom: 0,4%

17,5% 10,1% 6,5% 6,5% 6,4% 5,6% 3,6% 3,0% 2,8% 2,3% 2,1% 2,6% 1,1% 1,5% 1,8% 1,8% 0,6% 0,4% 0,9% 22,9%

Abbildung 1: Weichgewebssarkom-Verteilung. Verteilung der einzelnen Weichgewebssarkom- Entitäten am operativen Referenzzentrum für Gliedmaßentumore des BG Klinikums Bergmannsheil. (Prozentuale Verteilung, n: 2056 Weichgewebssarkome, Stand: 1.7.2007,

(17)

1.1.3. Ätiologie

Der Ursprung der meisten Weichgewebssarkome ist noch unbekannt. Der Großteil scheint de novo und ohne direkte Ursache zu entstehen [51].

Zu den wenigen gesicherten Risikofaktoren zählt die Bestrahlungstherapie im Rahmen der Tumorbehandlung, welche bei nahezu 1 % der Sarkom-Patienten, insbesondere bei Angiosarkom-Patienten als Einflussfaktor eine Rolle spielt [51]. Nach einer Radiatio maligner Tumoren der Brust, Cervix, Ovarien, Hoden oder des lymphatischen Systems ist die Inzidenz um den Faktor 8 – 50 erhöht [17, 201]. Hierbei nimmt das Risiko, später an einem Weichgewebssarkom zu erkranken, mit ansteigender Strahlendosis zu. Die meisten der betroffenen Patienten haben zuvor eine Strahlendosis von mindestens 50 Gy erhalten [51]. Die mediane Latenzzeit zwischen Bestrahlungstherapie und Sarkom-Diagnose beträgt ca. 10 Jahre [51, 145].

Ein weiterer Risikofaktor ist der Kontakt mit bestimmten Chemikalien.

Herbizide wie Phenoxyessigsäure oder Holzschutzmittel, welche Chlorphenol enthalten,sindbezüglichWeichgewebssarkomenbesonderskanzerogen [62, 166]. Bei der Entstehung von ca. 1 % aller Weichgewebssarkome spielen außerdem genetische Faktoren eine prädisponierende Rolle. Beim Li-Fraumeni Syndrom scheint die Keimbahnmutation des TP53 Tumor Suppressor Gens entscheidend für die Tumor-Entstehung zu sein. Die Hälfte aller Betroffenen leidet hier bereits im Alter von 30 Jahren unter malignen Tumoren, von denen über 30 % Weichgewebs- und Knochensarkome darstellen [72]. Zudem erhöhen gewisse DNA-Mutationen die Erkrankungswahrscheinlichkeit. Onkogene, deren Mutation die Entstehung eines Weichgewebssarkoms zur Folge haben können, sind das Mouse double minute 2 (MDM2) - Gen, das V-Myc myelocytomatosis viral related oncogene - Neuroblastoma derived (N-myc) - Gen, das Cellular avian erythroblastosis homologue B2 (c-erbB2) - Gen wie auch Mitglieder der Rat sarcoma (ras) – Genfamilie. Eine Amplifikation dieser Onkogene korreliert zudem mit einer schlechteren Prognose [98].

(18)

Abbildung 2: Liposarkom – Klinisches Erscheinungsbild. Tumor in situ, MRT-Aufnahme, Tumorpräparat, Histologischer Befund (von oben nach unten, Färbung: H&E, Vergrößerung: 100 x) [141]

1.1.4. Klinisches Erscheinungsbild

Weichgewebssarkome zeichnen sich durch ihr

vorerst lokal verdrängendes Wachstum

aus (Abb. 2). Das umgebende Gewebe wird hierbei zu einer Art Pseudokapsel mit reaktiven

Gewebsveränderungen komprimiert und

umgestaltet. Es besteht hier die Gefahr, dass der Tumor aufgrund seiner vermeintlichen Kapsel als benigne fehlinterpretiert wird. Tatsächlich ist die Pseudokapsel jedoch stets mit Tumorzellen infiltriert und der Tumor wächst mikroskopisch über den Kapselrand hinaus. Bevorzugt folgt das Tumorwachstum von Weichgewebssarkomen vorangelegten Faszien- und Gefäß-Nerven-Strukturen als Leitschienen. Auch diskontinuierliches Wachstum in Form von Skip-Läsionen ist möglich. Diese erhöhen je nach Ausmaß der chirurgischen Resektion die Häufigkeit von Lokalrezidiven [76]. Die klinische Symptomatik von Weichgewebssarkomen ist relativ unspezifisch. Schwellungen, die vom Patienten selbst entdeckt werden, stellen das

häufigste Primärsymptom dar. Diese

Schwellungen führen aber nur in 20 % - 30 % zu einer lokalen oder fortgeleiteten Schmerz- symptomatik [76]. Oftmals werden Weich-gewebssarkome als Zufallsbefunde erfasst, die trotz des häufig großen Tumorvolumens, nicht die Funktion oder das Allgemeinbefinden des Patienten einschränken. Nur in ca. 20 % der Fälle stehen bereits zum Diagnosezeitpunkt Anzeichen einer malignen Erkrankung wie z.B. Gewichtsverlust, Leistungsknickoder Metastasen

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Unterschenkel: 12,1% Oberschenkel: 37,3%

Abbildung 3: Weichgewebssarkom-Lokalisation. Verteilungsmuster von Weichgewebssarkomen am operativen Referenzzentrum für Gliedmaßentumore des BG Klinikums Bergmannsheil

(Prozentuale Verteilung, Zeitraum: 1990 – 2008, Quelle: Klinik für Plastische Chirurgie, BG Klinikum Bergmannsheil, Bochum)

Aufgrund ihrer Seltenheit und des vergleichsweise harmlosen klinischen Erscheinungsbildes werden maligne Weichgewebssarkome oftmals als benigne Tumoren fehldiagnostiziert. Die Tatsache, dass benigne Weichgewebstumoren wie z.B. Lipome um den Faktor 100 häufiger sind als maligne Sarkome, macht diese Problematik umso verständlicher [51]. Somit beträgt die durchschnittliche Anamnesedauer ca. ein Jahr [76]. Prinzipiell können Weichgewebssarkome am gesamten Körper lokalisiert sein, jedoch findet sich eine gewisse Häufigkeitsverteilung für bestimmte Körperpartien (Abb. 3) [26]. Die Lokalisation korreliert oft mit der Größe des Tumors. Im Gegensatz zu Tumoren der Extremität oder Rumpfwand sind retroperitoneale Tumoren zum Diagnosezeitpunkt meist deutlich größer, da sie aufgrund ihrer anatomischen Lage erst sehr spät symptomatisch werden [51]. Das Liposarkom ist das häufigste retroperitoneal gelegene Weichgewebssarkom. Es wird daher oft erst in einem fortgeschrittenen Tumorstadium mit entsprechend schlechter Prognose diagnostiziert, so dass aktuelle Therapieansätze (siehe 1.1.6.) meist ungenügend sind [26].

Im Allgemeinen sind zum Zeitpunkt der Diagnose des Primärtumors bereits in 10 % 20 % der Patienten Metastasen nachweisbar [51, 76], welche zu 70 % 80 % in der Lunge lokalisiert sind [9, 76]. Bei retroperitonealen und viszeralen Tumoren kommen häufiger auch Leber- und Peritonealmetastasen vor [41]. Weichgewebssarkome metastasieren vorwiegend hämatogen. Lymphogene Metastasen sind selten und am ehesten beim Synovial- oder Rhabdomyosarkom zu finden [76]. Fuß: 5,0% Hand: 2,2% Unterarm: 8,5% Oberarm: 12,0% Stamm: 19,9%

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1.1.5. Pathologie und Staging

Der exakte Weichgewebssarkom-Pathomechanismus ist bislang noch nicht geklärt [133]. Im Gegensatz zu vielen epithelialen Karzinomen, stammen Weichgewebssarkome oft nicht von den entsprechend ausgereiften Gewebetypen ab [187, 196]. So ist bisher nicht bewiesen worden, dass beispielsweise Liposarkome dem ausgereiften Fettgewebe entspringen bzw. durch maligne Transformation aus Lipomen hervorgehen [187]. Die heute bekannten, über 50 verschiedenen histologischen Weichgewebssarkom-Subtypen werden daher vornehmlich nach dem Gewebe benannt, dem sie hinsichtlich Morphologie am ehesten ähneln [26].

Um die exakte Entität zu bestimmen wird der Tumor anhand folgender pathologischer Kriterien untersucht: Makroskopisches Erscheinungsbild, Histopathologie, Immunophänotyp, Ultrastruktur sowie individuelle genetische Merkmale [26, 116].

Hinsichtlich der genetischen Merkmale können Weichgewebssarkome generell in zwei Hauptgruppen unterteilt werden [67]:

Die erste Hauptgruppe umfasst Tumoren mit einem nahezu diploiden Karyotyp mit nur wenigen spezifischen genetischen Veränderungen [67]. Insbesondere chromosomale Translokationen, die zu Fusionsgenen führen können, sind hier von zentraler Bedeutung. Im Falle des myxoiden Liposarkoms beispielsweise führt die chromosomale Translokation der Chromosomen 12 und 16 t(12;16)(q13;p11) zu einer charakteristischen Fusion des Gens für C/EBP-homologous protein (CHOP) und des Translocated in liposarcoma (TLS)-Gens [32, 149]. Ein weiteres typisches Merkmal dieser ersten Gruppe sind zudem onkogene Mutationen wie z.B. des c-Kit Gens, welches für die Rezeptor-Tyrosinkinase KIT kodiert und in über 50 % aller gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) zu finden ist [38]. Diese Mutation führt zu einer ligandenunabhängigen, kontinuierlichen Aktivierung der Tyrosinkinase, was eine anti-apoptotische wie auch proliferationsfördernde Wirkung zur Folge hat [71].

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Tabelle 1: Tumor-Staging. Staging-System für Weichgewebssarkome gemäß AJCC und UICC. (Erläuterungen der Abkürzungen in Tab. 2 + 3)

Veränderungen in der Chromosomenzahl sowie Gendeletionen bzw.

Genamplifikationen [187]. Zu den Tumoren dieser zweiten Hauptgruppe gehören z.B. alle Liposarkom-Subtypen außer dem myxoiden Liposarkom, das, wie oben dargestellt, zur ersten Hauptgruppe gehört [67].

Die genannten genetischen Aberrationen können erblich oder erworben sein und sind bereits in vielen Weichgewebssarkomen beschrieben und systematisiert worden [83, 88, 182]. Dadurch wird die Klassifizierung von ehemals schwierig zu identifizierenden Sarkom-Entitäten, insbesondere von pleomorphen Weich- gewebssarkomen, erleichtert bzw. überhaupt erst möglich gemacht [26, 163]. Dennoch reicht eine pathologische Klassifizierung der Weichgewebssarkome in ihre jeweiligen Subtypen allein nicht aus, um den klinischen Verlauf vorherzusagen und eine entsprechend aggressive Therapie zu planen [51].

Durch das Staging wird versucht, eine genauere Aussage über den Ausbreitungsgrad des Tumors und somit die individuelle Prognose des Patienten zu machen. Das Staging beeinflusst somit zentral die Radikalität und den Umfang der folgenden Therapie. Das führende Staging System für Weichgewebssarkome ist vom American Joint Committee on Cancer (AJCC) und der Union Internationale Contre le Cancer (UICC) entwickelt worden (Tab. 1) [26, 32, 51]. Es beinhaltet die vier wichtigsten Kriterien, die das Überleben des Patienten beeinflussen:

Tumor-Grading (G) (Tab. 2), Größe und Lage des Tumors (T), Befall regionärer Lympknoten (N) sowie das Vorhandensein von Fernmetastasen (M) (Tab. 3).

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Das Tumor-Grading ist innerhalb des Stagings der wichtigste prognostische Faktor. In der Vergangenheit sind diverse Grading-Systeme für Weichgewebs- sarkome entwickelt worden [33, 111, 120, 188, 193]. Zu den gängigsten Grading-Systemen zählt das System der French Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer (FNCLCC) (Tab. 2) [29-31, 188]. Hierbei wird das Tumor-Grading über entsprechende Scores anhand von Tumorzelldifferenzierung, Mitoserate und Tumornekroseanteil errechnet [188]. Daraus ergibt sich eine dreistufige Einteilung der Sarkome in gut differenzierte G1-Tumoren, mäßig differenzierte G2-Tumoren sowie schlecht differenzierte G3-Tumoren. Innerhalb der Weichgewebssarkome liegt die Grading-Verteilung bei 5 % - 10 % für G1-Tumoren, 25 % - 30 % für G2-Tumoren und die Mehrheit mit 50 % - 60 % für G3-Tumoren [29], was die Aggressivität dieser G3-Tumoren deutlich unterstreicht. Das Grading ist zudem der Haupteinflussfaktor auf die 5-Jahres-Überlebensrate des Patienten. Für G1-Sarkome liegt diese bei 72 % - 83 %, für G2-Sarkome bei 53 % - 59 % und für die mehrheitlich vorkommenden hochaggressiven G3-Sarkome bei lediglich 26 % - 42 % [82]. Bei Weichgewebssarkomen ist es entscheidend, dass das Tumor-Grading von einem erfahrenen und auf diese Tumorart spezialisierten Pathologen durchgeführt wird, da sie von allgemeinen Pathologen in 25 % - 40 % der Fälle fehldiagnostiziert werden [151, 165].

Tumorzelldifferenzierung

Score: 1  Ausgeprägte Ähnlichkeit mit normalem, adultem, mesenchymalem Gewebe Score: 2  Sicherer histologischer Typ

Score: 3  Embryonales und undifferenziertes Gewebe oder unsicherer histologischer Typ Mitoserate

Score: 1  0-9 Mitosen / 10 HPF* Score: 2  10-19 Mitosen / 10 HPF* Score: 3  ≥ 20 Mitosen / 10 HPF* Tumornekroseanteil

Score: 0  Keine Nekrose Score: 1  < 50 % Tumornekrose Score: 2  ≥ 50 % Tumornekrose Histologisches Tumor-Grading Grade 1:  Gesamtscore: 2-3 Grade 2:  Gesamtscore: 4-5 Grade 3:  Gesamtscore: 6-8

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Die weiteren das Staging beeinflussenden Faktoren sind in der TNM-Klassifikation für Weichgewebssarkome zusammengefasst (Tab. 3). Hierzu zählt die Größe und Lage des Primärtumors (T). Weichgewebssarkome werden in Tumoren > 5 cm und Tumoren ≤ 5 cm eingeteilt. Des Weiteren wird zwischen oberflächlich und tief gelegenen Tumoren unterschieden. Regionale Lymphknoten (N) sind bei Weichgewebssarkomen mit 5 % relativ selten befallen [32]. Fernmetastasen (M) hingegen beeinträchtigen stark das Gesamtüberleben der Patienten. Die meisten Patienten sterben aufgrund weitläufiger Tumormetastasierung, welche in 80 % der Patienten innerhalb der ersten 2 - 3 Jahre nach Erstdiagnose auftreten[32].

T Primärtumor T1 Tumordurchmesser ≤ 5cm - T1a - Oberflächlich - T1b - Tief T2 Tumordurchmesser > 5cm - T2a - Oberflächlich - T2b - Tief N Regionäre Lymphknoten

N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen

N1 Regionäre Lymphknotenmetastasen vorhanden

M Fernmetastasen

M0 Keine Fernmetastasen

M1 Fernmetastasen vorhanden

Tabelle 3: TNM-Klassifikation.

(24)

1.1.6. Therapieoptionen

1.1.6.1. Chirurgische Therapie

Im Zentrum der Weichgewebssarkom-Behandlung steht die chirurgische Therapie (Abb. 4) [36, 51, 76, 91, 161, 172]. Angestrebtes Ziel ist es, den Tumor gemäß allgemeinen Radikalitätsprinzipien zu resezieren, um ein lokoregionäres Rezidiv zu verhindern [91, 161, 172]. Als oberstes Prinzip gilt, dass der Tumor während der Operation nicht eröffnet wird, tumoradhärente Strukturen en-bloc entfernt werden und die Resektionsränder histologisch tumorfrei sind [36, 172]. Die Resektion muss weit im Gesunden angelegt sein, da infiltrierende Zellverbände entlang Faszien, Muskelsepten und epineuralem Bindegewebe diskontinuierlich vorwachsen können [76, 91]. Zur Sicherung der Radikalität sollten intraoperativ Schnellschnitte von den Resektionsrändern entnommen werden. Die Radikalität der Operation wird gemäß der Einteilung nach Enneking differenziert [161]. Hierbei wird unterschieden zwischen i) radikaler Resektion, ii) weiter Resektion, iii) marginaler Resektion, iv) intraläsionaler bzw. subtotaler Resektion sowie v) palliativer Resektion. Die Resektion gilt als radikal, wenn es tumorfreie Resektionsgrenzen von 3 cm und mehr gibt. Das tumortragende Kompartment wird hierbei en-bloc entfernt. Bei der weiten Resektion finden sich histologisch tumorfreie Resektionsgrenzen von 1 – 3 cm. Bei der marginalen Resektion reicht der Resektionsrand bis an den Tumor heran. Der Resektionsrand ist dabei histologisch auf einer Breite von einigen mm bis 1 cm tumorfrei. Bei der intraläsionalen bzw. subtotalen Resektion wird der Tumor eröffnet oder aus der oft tumorinfitrierten Pseudokapsel ausgeschält. Adhärente Strukturen wie Nerven, Gefäße oder Knochen sind histologisch nicht tumorfrei. Es verbleiben histologisch positive Resektionsränder. Die palliative Resektion umfasst lediglich eine Tumorverkleinerung mit makroskopisch deutlichen Tumorresten.

(25)

die einzig kurative Option darstellte, kann heute oftmals bei befriedigendem funktionellem Outcome extremitätenerhaltend operiert werden [46, 202]. Dennoch schränken diverse Faktoren den Erfolg der chirurgischen Therapie stark ein [35-36, 81, 170]. So ist eine kurative chirurgische Resektion bei bereits metastasierten Tumoren schwierig. Gerade bei den lange asymptomatischen und dadurch eventuell großen Sarkomen stellt eine ausgedehnte Resektion insbesondere für multimorbide Patienten eine große Belastung mit erhöhter Morbidität und Mortalität dar [35-36, 81, 170]. Auch eine chirurgische Resektion in der Nähe vitaler Strukturen wie z.B. Aorta oder Rückenmark birgt enorme Risiken mit eventuell fatalen funktionellen Einschränkungen. Postoperative Komplikationen reichen von Wundheilungsstörungen über Lähmungserscheinungen bis hin zur fulminanten Sepsis mit Multiorganversagen [35, 170-171].

1.1.6.2. Strahlentherapie

Die Radiatio hat im interdisziplinären Therapieansatz einen hohen Stellenwert und erlaubt, die lokale Tumorkontrolle deutlich zu verbessern (Abb. 4) [161].

Es werden i) präoperative bzw. neoadjuvante, ii) intraoperative sowie iii) postoperative bzw. adjuvante Strahlentherapien unterschieden. Ziel der neoadjuvanten Radiatio ist es, das Tumorvolumen vor der Operation zu reduzieren, um möglichst eine R0-Resektion zu ermöglichen bzw. eine Amputation

(26)

werden [32, 161]. Bei der adjuvanten Bestrahlungstherapie beinhaltet das bestrahlte Areal neben dem Operationsbett zusätzlich die Operationsnarbe und die Drainageausgangsorte. Die verabreichte Dosis beträgt hier meist 60 70 Gy [32]. Es können je nach Sarkomentität lokale Tumorkontrollraten von 78 % 91 % erzielt [32, 102] und die Lokalrezidivraten auch für nicht R0-resezierte

Weichgewebssarkome deutlich gesenkt werden [4-5, 27]. Generell bergen alle Arten der Strahlentherapie jedoch die Gefahr schwerer Nebenwirkungen, die direkt nach der Radiatio oder auch Jahrzehnte später auftreten können [2, 32]. Zu den wichtigsten Nebenwirkungen zählen neben den oben genannten Wundheilungsstörungen Strahlendermatitis, Lymphödeme, Fibrosen oder pathologische Frakturen [2, 32]. Überdies fördert die Strahlentherapie selbst die Entstehung von Weichgewebssarkomen oder von malignen Hauttumoren wie Plattenepithelkarzinomen (siehe 1.1.3.) [51, 152].

1.1.6.3. Chemotherapie

(27)

musste. Bei keinem der Patienten, bei denen vor der Chemotherapie eine Amputation indiziert war, konnte diese durch eine systemische neoadjuvante Chemotherapie verhindert werden [117].

Eine Sonderstellung unter den neoadjuvanten Chemotherapien nimmt die isolierte Extremitätenperfusion ein. Hierbei wird die tumortragende Extremität über einen getrennten Blutkreislauf mit dem Chemotherapeutikum Melphalan und dem Zytokin Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) perfundiert [96, 100, 128]. Dabei kann die Maximaldosis der Substanzen bis auf das 10 bis 20-fache der systemischen Dosis gesteigert werden, so dass bei eventueller Remission eine extremitätenerhaltende Operation teils möglich gemacht wird [20, 95, 201]. Jedoch ist ein kurativer Ansatz auf nicht-metastasierte Tumoren der Extremität beschränkt, wobei hier Remissionsraten von 50 % erzielt werden [96, 128]. Bei fortgeschrittenem Tumorwachstum konnte durch diese Technik bislang noch kein Fortschritt hinsichtlich eines Überlebensvorteiles erzielt werden [92, 95, 128].

(28)

Abbildung 4: Aktueller Therapiealgorithmus bei Weichgewebssarkomen I. Chirurgische Therapie • Zentrale Bedeutung • Wirkungsvoll • Ziel: Lokale Tumorkontrolle • Probleme: - Metastasierung

- Nähe zu vitalen Strukturen - Multimorbide Patienten - Funktionelle Beeinträchtigung III. Chemotherapie • Experimentell • Insuffizient • Ziel: Systemische Tumorkontrolle • Probleme: - Starke Nebenwirkungen - Mangelnde Ansprechrate - Keine Verbesserung des Gesamtüberlebens - Keine Verbesserung des krankheitsfreien Überlebens II. Strahlentherapie • Zentrale Bedeutung • Wirkungsvoll • Ziel: Lokale Tumorkontrolle • Probleme: - Metastasierung

- Nähe zu vitalen Strukturen - Starke Nebenwirkungen - Massive Spätfolgen - Hohe Strahlendosen nötig

(29)

Onkolytische Aktivität Antimirobielle

Aktivität Immunmodulation Wundheilung

Host Defense Peptid

Abbildung 5: HDP-Wirkungsspektrum

1.2. HOST DEFENSE PEPTIDE

1.2.1. Definition

(30)

Je nach Ursprung werden natürlich vorkommende HDPs von künstlich erschaffenen, so genannten Designer-HDPs mit optimierter Wirksamkeit unterschieden [73, 140]. Die Familien der Cathelizidine z.B. hCAP18/LL-37 und der Defensine z.B. α-Defensine gehören zu den am besten untersuchten natürlichen HDPs [125-126, 162]. Sie kommen in den verschiedensten Zell- und Gewebetypen des menschlichen Körpers wie z.B. Leukozyten oder Epithelzellen der Haut vor und werden entweder kontinuierlich oder auf spezifische immunologische Reize hin exprimiert [25, 65, 70, 86].

1.2.2. Wirkungsspektrum

1.2.2.1. Antimikrobielle Aktivität

(31)

1.2.2.2. Immunmodulatorische Aktivität

(32)

1.2.2.3. Wundheilung

Ein weiterer Wirkbereich von Host Defense Peptiden ist die Wundheilung.

Jedoch spielen HDPs nicht nur bei verletzter Haut eine zentrale Rolle, sondern sorgen auch bei intakter Haut dafür, dass der schützende Hautmantel unversehrt bleibt. So leisten z.B. die HDPs RNase 7 und Psoriasin S100A7 einen wichtigen Beitrag zur Aufrechterhaltung eines bakteriologischen Gleichgewichtes der Hautflora [12, 162]. Kommt es schließlich zu einer Verletzung oder sogar einer Infektion der Haut, werden bestimmte HDPs durch Neutrophile Granulozyten und Keratinozyten vermehrt synthetisiert und ausgeschüttet. So ist eine kontinuierliche und induzierbare Expression des humanen Cathelizidins hCAP18/LL-37 sowie der humanen beta-Defensine-2 und -3 in epidermalen Keratinozyten beschrieben worden [44, 52, 63]. Heilborn et al. zeigten eine hohe Konzentration von hCAP18/LL-37 in Wunden, wohingegen in chronischen Wunden nur stark erniedrigte hCAP18/LL-37-Konzentrationen nachgewiesen wurden [66]. Diverse andere Arbeitsgruppen konnten einen protektiven Effekt von hCAP18/LL-37 gegenüber Hautinfektionen mit bakteriellen Erregern insbesondere Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptokokken der Gruppe A nachweisen [14, 44, 127, 131]. Die Arbeitsgruppe um Niyonsaba beschrieb überdies, dass beta-Defensine die Migration wie auch die Proliferation von epidermalen Keratinozyten stimulieren würden und somit entscheidend für einen kutanten Wundheilungsprozess sein könnten [126].

1.2.2.4. Onkolytische Aktivität

(33)

bei allen behandelten Mäusen ein partieller Rückgang des Tumors und in 40 % der Fälle eine vollkommene Remission des Tumors nach Therapie mit dem synthetischen HDP erzielt werden [136]. Die Gruppe der onkolytischen HDPs werden in zwei Kategorien unterteilt [73]: Erstens, HDPs, die hochpotent gegenüber Bakterien und Krebszellen sind jedoch nicht gegenüber normalen, gutartigen Zellen. Zweitens, HDPs, die zytotoxisch gegenüber Bakterien, Krebszellen und zugleich zytotoxisch gegenüber normalen, gutartigen Zellen sind. Diese letzte Gruppe umfasst also hochaktive zytotoxische HDPs, die aber nicht selektiv zwischen gutartigen und bösartigen Zellen unterscheiden können. Entscheidend für die Selektivität sind zum einen Struktur und molekularer Aufbau potentieller Zielzellen und wie sehr sich diese von physiologischen, gutartigen Zellen unterscheiden, und zum anderen der individuelle HDP-Aufbau aus den verschiedenen Aminosäuren. Details hierzu werden unten genau erläutert (siehe 5.1.).

1.2.3. Molekularer Aufbau

In der großen Familie der Host Defense Peptide können natürlich vorkommende HDPs, wie z.B. das oben erwähnte Magainin II [90] von so genannten Designer Host Defense Peptiden, wie dem in dieser Studie untersuchtem [D]-K3H3L9

unterschieden werden [108]. Die Aminosäuresequenz letzterer Designer-HDPs kann hier völlig frei festgelegt werden und bietet dem Wissenschaftler ein fast unerschöpfliches Arsenal an HDPs, welche für den jeweiligen Einsatz hochspezifisch zusammengestellt werden können. All entscheidend für die Wirksamkeit sowohl der synthetischen Designer-HDPs als auch der natürlich vorkommenden HDPs ist der jeweilige molekulare Aufbau.

(34)

- Aktivität im sauren Milieu - Stabilität in vivo - Membranaktivität - Elektrostatische Bindung - pKs ↓ - D-L-Enantiomere - Amphipathisch - Kationisch HDP 5 - 40 AS

Abbildung 6: HDP-Design. Molekulare Charakteristika und deren Bedeutung.

Bakterien wie auch vieler maligner entarteten Zellen ist negativ geladen [18, 34, 43, 73, 190, 206]. Die kationische Ladung der HDPs auf der einen Seite und die anionische Ladung der Zielmembran auf der anderen Seite erlaubt somit über elektrostatische Wechselwirkungen eine gezielte Bindung.

Darüber hinaus ist darauf zu achten, dass die Wahl der AS zu einem möglichst amphipathischen Charakter des gesamten HDP-Moleküls führt [73], d.h. dass das HDP sowohl hydrophile als auch hydrophobe Abschnitte besitzt. Dies kann erzielt werden, indem man sowohl hydrophile also geladene Aminosäuren wie z.B. Lysin oder Histidin als auch hydrophobe also ungeladene bzw. neutrale Aminosäuren wie z.B. Leucin in einem HDP-Molekül verbindet. Ein amphipathischer Charakter erleichtert die Interaktion der HDPs mit der ebenfalls amphipathischen Phospholipidmembran der Zielzelle. Das HDP kann dadurch die Zielmembran leichter durchdringen und schließlich zerstören.

Ferner kann sich die Chiralität der einzelnen Aminosäuren auf die Halbwertszeit der HDPs im lebenden Organismus auswirken. Unterschieden werden die physiologisch in körpereigenen Proteinen vorkommenden L-Aminosäuren von ihren entsprechenden Enantiomeren, den D-Aminosäuren. In mehreren Studien

stellte sich heraus, dass insbesondere onkolytische HDPs, die nur aus L-Aminosäuren bestehen, nur in vitro aktiv sind, wohingegen sie in vivo ihre

(35)
(36)

1.2.4. Wirkmechanismus

Host Defense Peptide bieten ein äußerst umfassendes und breites Wirkungsspektrum. Ebenso zahlreich wie die vielen unterschiedlichen Einsatzmöglichkeiten sind die einzelnen Wirkmechanismen, die den jeweiligen Wirkungsspektren zugrunde liegen. Dabei ist der genaue Wirkmechanismus oft noch nicht vollständig verstanden [73, 140, 208]. Dieser Abschnitt soll sich auf die zentralen Hypothesen der onkolytischen Wirksamkeit beschränken.

Um möglichst gezielt nur maligne Zellen zu zerstören und physiologisch normale Zellen auszusparen, ist es wichtig die Unterschiede zwischen den beiden Zellen zu identifizieren. Von entscheidender Bedeutung ist hierbei die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem kationischen also positiv geladenen HDP und der anionischen also negativ geladenen, entarteten Zielzelle.

Im Gegensatz zu dieser zeichnen sich die normalen Zellen des menschlichen Körpers physiologischerweise durch eine neutrale Nettoladung aus [73]. So besteht die Phospholipiddoppelmembran von Säugetieren zum Großteil aus zwitterionischen Phospholipiden wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin oder Sphingomyelin und ist daher weniger attraktiv für die kationischen HDPs [73]. Dieser Unterschied in der Zellmembranzusammensetzung ist entscheidend für die gezielte Aktivität der HDPs [73, 140, 208].

Im Vergleich hierzu sind Tumorzellen eher negativ geladen. Dies hat mehrere Gründe: Zum einen besteht die Zellmembran von Tumorzellen zu 3-9 % aus negativ geladenem Phosphatidylserin (PS) [23, 195]. Des Weiteren beinhaltet die Zellmembran vieler Tumorzellen O-glykosilierte Mucine [21]. Diese Glykoproteine generieren eine weitere negative Aufladung der Tumorzelloberfläche. Überdies scheint das im Vergleich zu normalen Zellen verstärkt negative Membranpotential innerhalb von Krebszellen einen Einfluss auf die gezielte Aktivität von HDPs zu haben [34].

(37)

Abbildung 7: HDP-Wirkmechanismus. Wirkmechanismus von onkolytischen Host Defense Peptiden an der Membran von Tumorzellen [140].

Micellenbildung Membran- depolarisierung „Barrel-Stave-Model“ „Toroidal-Pores-Model“ „Carpet-Model“ Membranbindung HDPs in Lösung HDPs in Lösung

Bindet das HDP an die Zielzelle, so gibt es daraufhin mehrere Mechanismen, die zum Tod der Zelle via Nekrose oder Apoptose führen. Die meisten Host Defense Peptide sind membranaktiv, das heißt, dass sie spezifisch an die Zellmembran der negativ geladenen Tumorzellen binden und diese zerstören, was zum Zelltod durch Nekrose führt [138]. Hierfür werden mehrere rezeptorunabhängige Mechanismen diskutiert (Abb. 7) [140]:

Das „Carpet-Model“ [132, 150], das „Toroidal-Pores-Model“ [103, 113] sowie das „Barrel-Stave-Model“ [48].

(38)

Beim „Toroidal-Pores-Model“ erfolgt der erste Schritt wie beim „Carpet-Model“. Nachdem auch hier eine Schwellenkonzentration an HDPs erreicht wird, wölbt

sich die Membran nach innen und formt ein aus HDPs und

Plasmamembranbausteinen bestehende kreisrunde Pore. Zwischen den jeweils positiven und sich folglich abstoßenden HDPs wirken die negativ geladenen Phospolipidmembrananteile als Stabilisatoren der Porenwand [73]. Schließlich kommt es durch die Poren zur Membranzersetzung und zum Zelltod durch Micellenbildung nach dem „Carpet-Model“. Alternativ kommt es beim „Toroidal-Pores-Model“ zum Zelltod, indem durch die Poren eine Depolarisierung der Membran ausgelöst wird. Das führt dazu, dass das Ionengleichgewicht innerhalb der Zelle nicht mehr aufrecht erhalten werden kann. Zudem laufen durch die Poren Zellinhalte in den extrazellulären Raum.

Das „Barrel-Stave-Model“ findet sich primär bei HDPs, die nicht selektiv gegenüber Tumorzellen sind und die an alle Arten von Zellmembranen binden. Hierbei bilden HDPs eine transmembrane Pore, welche nur aus HDPs besteht und die gesamte Dicke der Plasmamembran überspannt. Dabei formt der hydrophile Teil der amphiphilen HDPs die Innenwand der Pore und der hydrophobe Teil der HDPs die Außenwand. Bedingung für das „Barrel-Stave-Model“ ist jedoch, dass ein HDP in der Lage ist, die ganze Dicke der Membran zu überspannen. Daher sind je nach Peptid-Sekundärstruktur im Falle von α-Helices mindestens 20 Aminosäurereste nötig und im Falle von β-Faltblättern mindestens 8 Aminosäurereste [73]. Schließlich kommt es hier zum Zelltod durch Nekrose, weil auch hier eine Depolarisierung der Membran ausgelöst wird.

(39)

Alloferon über eine immunmodulatorischen Effekt indirekt onkolytisch, indem es die antitumoralen Resistenzen in der Maus förderte.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass HDPs nicht nur über ihre membranolytischen Aktivitäten alleine Tumorzellen zerstören, sondern auch über viele weitere, teils bisher noch nicht verstandene Mechanismen onkolytisch wirksam sind.

1.2.5. Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9

In meiner Arbeit habe ich das synthetische Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 auf sein onkolytisches Potential gegenüber Liposarkomzellen

untersucht. Das Peptid besteht aus einem Mix von 15 D- und L-Aminosäuren. Die exakte Peptid-Sequenz lautet:

LHLLHKLLKHLLKLL-NH2

(L = Leucin, pKs = 5,98; H = Histidin, pKs = 6,1; K = Lysin, pKs = 10,5;

D-Aminosäuren sind unterstrichen hervorgehoben). Die mit unserem Labor kooperierende Arbeitsgruppe um Yechiel Shai des Weizmann Institute of Science in Israel stellte aus der Erfahrung mehrerer Studien dieses Peptid-Design als vorerst beste Entwicklung vor [108, 136-138, 140].

Beim HDP-Design wurde besonders auf einen möglichst geringen Gesamt-pKs-Wert geachtet. So wurden bei diesem Peptid im Vergleich zu einem Vorgängerpeptid [D]-K6L9 (LKLLKKLLKKLLKLL-NH2) drei Lysin-AS mit hohem pKs-Wert durch 3 Histidin-AS mit niedrigerem pKs-Wert ersetzt [108]. Dies hatte zur Folge, dass der Gesamt-pKs-Wert des Peptides reduziert wurde (siehe 1.2.3.). Dennoch konnte noch keine pH-Abhängigkeit des Peptides erreicht werden. Erst der vollständige Ersatz der Lysin-AS durch Histidin-AS in einem weiteren Vorgänger-HDP, [D]-H6L9 (LHLLHHLLHHLLKLL-NH2), konnte den Gesamt-pKs-Wert ausreichend senken, um die gewünschte pH-Abhängigkeit im sauren Bereich zu erreichen. Jedoch war dieses [D]-H6L9 bereits ab einer einzelnen i.v. Dosis von

20 mg/kg toxisch, wohingegen beim in dieser Studie eingesetzten Peptid [D]-K3H3L9 nach einer einmaligen systemischen Gabe von bis zu 30 mg/kg auch

(40)

konnten [108]. Das Peptid [D]-K6L9 war bereits knapp über der therapeutischen

Dosis ab einer einzelnen i.v. Gabe von 8 mg/kg toxisch [108]. Es konnte folglich durch die Senkung des gesamten pKs-Wertes die Tumor-gerichtete Aktivität verbessert und zugleich die systemische Toxizität reduziert werden.

Für eine erfolgreiche in vivo Applikation wurde zudem die Chiralität der einzelnen Aminosäuren bedacht (siehe 1.2.3.). So verglichen Papo et al. verschiedene Designer-HDPs bezüglich ihrer Aktivität in vivo miteinander [136]. Dabei wurden Peptide untersucht, die nur aus L-Aminosäuren (L-HDP) bestanden, und baugleichen HDPs gegenübergestellt, die aus einem Mix aus D- und L-Aminosäuren (D-L-HDP) bestanden, wie es bei dem in dieser Studie eingesetzten Peptid der Fall ist. Dabei zeigte sich, dass das L-HDP nur in vitro hochwirksam war, jedoch nicht zwischen Tumorzellen und normalen Zellen unterscheiden konnte. In vivo war es überhaupt nicht aktiv, da es im Serum und der extrazellulären Matrix sowohl an Serumkomponenten gebunden wurde als auch proteolytisch inaktiviert wurde. Im Gegensatz dazu behielt das D-L-HDP seine volle Aktivität im Serum und wurde nur zu 50 % durch die extrazelluläre Matrix inaktiviert. Darüber hinaus konnte das D-L-HDP 15-fach besser an negativ geladene Membranen binden und zeigte überdies bei einer Konzentration von 100 µM keinerlei hämolytische Aktivität [136, 139]. Bei derselben Konzentration wurden beim L-HDP 100 % der Erythrozyten lysiert [139]. Benkirane et al. demonstrierten darüber hinaus, dass die gemischten D-L-HDPs gegenüber baugleichen L-HDPs bzw. HDPs, die nur aus D-Aminosäuren (D-HDPs) bestanden merklich weniger immunogen sind [8]. Deshalb wurde bei dem in meiner Studie untersuchtem Peptid [D]-K3H3L9 bewusst eine AS-Anordnung nach

dem D-L-HDP-Prinzip gewählt.

Die Arbeitsgruppe um Yechiel Shai testeten [D]-K3H3L9 bereits auf seine

onkolytische Fähigkeiten gegenüber 22RV1 Prostatakarzinomzellen in vitro und in vivo [108]. In vitro war das Designer-HDP [D]-K3H3L9 gezielt aktiv gegenüber CL1

(41)

2. ZIELSETZUNG

(42)

3. MATERIAL UND METHODIK

Sämtliche Zellkulturarbeiten sowie die in vitro und in vivo Versuche mit entsprechender histologischer und statistischer Aufarbeitung und Auswertung wurden von mir persönlich durchgeführt.

3.1. LABORBEDARF

3.1.1. Reagenzien

7-Amino-Actinomycin (7-AAD) BD Biosciences, San Jose, CA, USA

25 mM Cobaltdichlorid (CoCl2) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,

Deutschland

1 mM dATP PJK Krauser GmbH, Kleinblittersdorf,

Deutschland

4′,6-Diamidin-2’-phenylindol- Invitrogen, Eugene, OR, USA dihydrochlorid (DAPI)

0,9 % Natriumchlorid-Lösung(NaCl) DeltaSelect GmbH, Dreieich, Deutschland

1 M Natriumhydroxid (NaOH) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

1 M Salzsäure (HCl) Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

1 % Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

Anti-[D]-K3H3L9-Antikörper NeoMPS SA, Straßburg, Frankreich

aus dem Kaninchen

Antigen Unmasking Solution Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA,USA

Anti-human-Ki67-Antikörper Acris Antibodies GmbH,

(43)

BD Matrigel Matrix BD Biosciences, San Jose, CA, USA Biotinylierter Anti-Kaninchen- Vector Laboratories Inc., Burlingame,

Antikörper aus der Ziege CA,USA

BrdU cell proliferation enzyme-linked Roche Diagnostics GmbH, immunosorbent assay (ELISA) Kit Mannheim, Deutschland

Chroma Tide ® Alexa Fluor ® Invitrogen, Eugene,OR, USA 488-5-dUTP

Citronensäure Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Dako Fluorescent Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA, USA

Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Distickstoffmonoxid (N2O) Air Products GmbH, Hattingen,

Deutschland

[D]-K3H3L9 PolyPeptide Laboratories,

Straßburg, Frankreich

DNAse I, RNAse-frei Qiagen Inc., Valencia, CA, USA

Doxorubicin-Hydrochlorid Ribosepharm, Gräfelfing, Deutschland

Dulbecco´s Modified Eagle Medium PAA Laboratories, Pasching, Österreich (DMEM) high Glucose (4,5g/l)

with L-Glutamine

Dulbecco’s Phosphat PAA Laboratories, Pasching, Österreich

gepufferte Kochsalzlösung (engl.:Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS)

(44)

Ethanol (C2H6O) Sigma, Aldrich Chemie GmbH,

München,Deutschland

Fetales Rinderserum Thermo Fisher Scientific Inc.,

(engl.: fetal bovine serum, FBS) Waltham, MA, USA

FITC Annexin V Apoptosis BD Biosciences, San Jose, CA, USA

Detection Kit I

Forene® Isofluran Abbott GmbH & Co.KG, Wiesbaden,

Deutschland

Formafix 5 % Methanal (HCHO), PathoMed Logistik GmbH, Viersen,

neutral gepuffert Deutschland

Glycin Sigma, Aldrich Chemie GmbH,

München, Deutschland

Ifosfamid Baxter Deutschland GmbH,

Unterschleißheim, Deutschland

Kollagenase Typ II Worthington Biochemical Corporation,

Lakewood, NJ, USA

Methotrexat-Dinatrium Gry Pharma GmbH, Kirchzarten,

Deutschland

Narcoren (Pentobarbital-Natrium) Merial GmbH, Hallbergmoos, Deutschland

Natriumchlorid (NaCl) AppliChem GmbH, Darmstadt,

Deutschland

Natriumcitrat Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

PBS-Tween-20 Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Penicillin/Streptomycin Laboratories, Pasching, Österreich

100x Konzentrat

Sauerstoff (O2) Air Products GmbH, Hattingen,

(45)

Streptavidin Alexa Fluor ® 488 Invitrogen, Eugene, OR, USA conjugate 2 mg/ml

Stickstoff (N2) Air Products GmbH, Hattingen,

Deutschland

Temgesic (Buprenorphin) MSD Sharp & Dohme GmbH, Haar,

Deutschland

Terminale Deoxynucleotidyl Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,

Transferase (TdT) Deutschland

TdT-Puffer Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,

Deutschland

Thiazolyl Blue Tetrazolium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA Bromide (MTT)

Tris (hydroxymethyl)-aminomethan Merck KG, Darmstadt, Deutschland -hdyrochlorid (Tris HCl)

Trypsin-EDTA PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Vincristinsulfat Gry Pharma GmbH, Kirchzarten,

Deutschland

Xylol Sigma, Aldrich Chemie GmbH,

München, Deutschland

(46)

3.1.2. Puffer und Lösungen Citratpuffer - 0,01 M Citronensäure - 0,01 M Natriumcitrat - pH-Wert: 3 Glycinpuffer - 0,1 M Natriumchlorid (NaCl) - 0,1 M Glycin

- pH-Wert: 10,5 > eingestellt mit 1 M Natriumhydroxid (NaOH)

Standard Saline Citrate (SSC)

- 3 M Natriumchlorid (NaCl) - 0,3 M Natriumcitrat

- pH-Wert: 7,0 > eingestellt mit 1 M Salzsäure (HCl)

TE-Puffer

- 10 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan-hdyrochlorid (Tris HCl), pH-Wert: 7,4 > eingestellt mit 1 M Salzsäure (HCl)

- 1mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)

pH-Wert: 8,0 > eingestellt mit 1 M Natriumhydroxid (NaOH)

Reaktions-Mix

- Terminale Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) bzw. TE-Puffer - TE-Puffer

- TdT-Puffer

- 25 mM Cobaltdichlorid (CoCl2)

(47)

3.1.3. Labormaterialien und Geräte

6-Well Zellkulturtestplatte TPP,Trasadingen, Schweiz

96-Well Zellkulturtestplatte Corning GmbH, Kaiserslautern

schwarz, transparenter, Deutschland

flacher Boden, mit Deckel

Athymische männlicheNacktmaus Harlan Winkelmann GmbH, Borchen,

Typ Foxn 1nu/nu Deutschland

Bachofer Ofen 400 HY Bachofer GmbH, Reutlingen,

Deutschland

BD CellQuestTM Pro BD Biosciences, San Jose, CA, USA

Version 5.2.1.

BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences, San Jose, CA, USA

Canon Power Shot S21S Canon Inc., Tokyo, Japan

Digitalkamera

CASY-1 Model TT Cellcounter Schärfe System, Reutlingen, Deutschland und Analyse System

Dampfsterilisator Varioklav Typ 400 HP Medizintechnik GmbH,

Garching-Hochbrück, Deutschland

Digitaler Messschieber Lux-Tools, Wermelskirchen, Deutschland

Diskus 32 – Technisches Büro Hilgers,

Mikroskopische Bilddarstellung Königswinter, Deutschland

Electrolux UF601Ultra Cold Freezer Electrolux, Stockholm, Schweden

Elx808 Ultra Microplate Reader Bio-Tek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Deutschland

(48)

Einmal-Pinzetten Servoprax GmbH, Wesel, Deutschland

Einmal-Skalpell Aesculap Ag&Co.KG, Tuttlingen,

Deutschland

FACS Röhrchen, BD Biosciences, San Jose, CA, USA

5 ml polysterene, Rundboden

Feinwaage Typ 1712 Sartorius GmbH, Göttingen, Deutschland

Exsikkator W. Feddeler, Laboratoriumsbedarf, Essen,

Deutschland

Glaskapillare Poulten&Graf GmbH, Wertheim,

Deutschland

Heidolph Inkubator 1000 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland

Heidolph Unimax 1010 Schüttler Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland

Heraeus Hera Safe Sterilwerkbank Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland

Heraeus Function Line Inkubator Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland

ImmEdge Pen Vector Laboratories Inc.,

Burlingame, CA, USA

Individuell ventilierter Käfig Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, (engl.: individually ventilated Niederlande

cage, IVC), Typ II

Kammerobjektträger, Lab-Tek II, Nalge Nunc International, Naperville,

8 Kammern IL, USA

KC4 3.01 Analyseprogramm Bio-Tek Instruments GmbH,

(49)

Kryoröhrchen Nalge Nunc International, Naperville, IL, USA

Narkosegerät Sulla 19 Drägerwerk AG, Lübeck, Deutschland

Magnetrührer RH Basic IKA Werke GmbH & Co. KG,

Staufen, Deutschland

Microsoft Office Excel 2003 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA

Mikrowelle Sharp 700w Sharp, Hamburg, Deutschland

Multifuge 3SR+Zentrifuge Heraeus Holding GmbH, Hanau,

Deutschland

Objektträger Superfrost Utra Plus Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA

Orion Microplate Luminometer Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland

Probenlagerbehälter für Stickstoff Messer Griesheim GmbH, Krefeld,

Messer Chronos Deutschland

Schüttelwasserbad GFL 1092 GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Deutschland

Simplicity 2.1. Analyseprogramm Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland

Softasept®N B.Braun Melsungen AG, Melsungen,

Deutschland

SW-872 humane Liposarkomzelllinie CLS, Eppelheim, Deutschland

Tecniplast Interactive Tecniplast Deutschland GmbH,

Safe Change Station Hohenpeißenberg, Deutschland

Tierfutter Ssniff R/M-H, Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest,

(50)

U-40 BD Micro Fine+ BD Biosciences, San Jose, CA, USA 0,5 ml Injektionsspritzen

Vakuumpumpstand Vacuubrand Vacuubrand, Wertheim, Deutschland

Versorgunsbehälter für Stickstoff Messer Griesheim GmbH, Krefeld,

Messer Apollo Deutschland

Zeiss AxioCam HRc Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,

Deutschland

Zeiss Axioskop 2 Plus Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,

Fluoreszenzmikroskopes Deutschland

Zeiss Axiovert 25 inverses Mikroskop Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland

Zeiss Axio Vision 3.1 Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,

Deutschland

Zellkulturflaschen 150 cm2 TPP,Trasadingen, Schweiz

Zellschaber 24 cm TPP,Trasadingen, Schweiz

Zellsieb, Nylon, 100 µM BD Biosciences, San Jose, CA, USA

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3.2. ZELLKULTUR

3.2.1. Zellen

In meiner Arbeit habe ich die humane SW-872 Liposarkomzelllinie (SW-872) im Vergleich zu primären humanen Fibroblasten (HFB) als Kontrollzellen untersucht. Beide Zellarten sind mesenchymalen Ursprungs, jeweils in maligne entarteter bzw. in physiologischer Form. SW-872 Zellen entstammen einem undifferenzierten Liposarkom eines 36-jährigen, männlichen Kaukasiers und wurden im Jahre 1974 isoliert. Primäre humane Fibroblasten wurden gemäß Protokoll (siehe 3.2.2.) im Jahre 2008 aus der Dermis eines 47-jährigen männlichen Kaukasiers gewonnen. Um bei der SW-872 Zelllinie eine eventuelle Krosskontamination auszuschließen, wurden die in meiner Studie eingesetzten Zellen auf ihre Authentizität hin geprüft. Hierfür wurde durch die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ GmbH, Braunschweig, Deutschland) aus den Zellproben genomische DNA isoliert und mit Hilfe einer nonaplex PCR ein DNA Profil von acht hoch polymorphen Orten von Short Tandem Repeats (STRs) erstellt. Die DSMZ GmbH bestätigte die Reinheit und Authentizität der in dieser Arbeit verwendeten Liposarkomzelllinie SW-872 (siehe 8.).

Beide adhärente Zellarten wurden in Zellkulturflaschen von 150 cm2 Wachstumsfläche zu 3000 Zellen/cm2 (SW-872) bzw. 5000 Zellen/cm2 (HFB) ausgesät und in einer 5 % CO2 Atmosphäre bei 37°C im Inkubator kultiviert.

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3.2.2. Isolierung primärer humaner Fibroblasten

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3.2.3. Peptide und Chemotherapeutika

Das in dieser Arbeit untersuchte Peptid [D]-K3H3L9 ist aus 15 D- und

L-Aminosäuren aufgebaut. Die Primärstruktur lautet LHLLHKLLKHLLKLL-NH2 (unterstrichene Buchstaben stehen für D-Aminosäuren). Das Peptid wurde extern durch Festphasenpeptidsynthese hergestellt und mit Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl.: reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) auf eine Konzentration von 99,4 % aufgereinigt. Das Molekulargewicht (MG) beträgt 1831,4 g/mol. Die Lagerung erfolgte bei -80°C als gelöste Suspension in Phosphat-gepufferte r Kochsalzlösung (engl.: phosphate buffered saline, PBS) zu 1 ml-Einheiten der Konzentrationen 1 mg/ml bzw. 10 mg/ml. Die Peptidsequenz wurde freundlicherweise von Herrn Professor Yechiel Shai, Department of Biological Chemistry, The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel zur Verfügung gestellt.

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3.3. IN VITRO ANALYSE

3.3.1. Proliferations-Analyse: BrdU-Assay

Die Zellproliferation wurde mit einem Bromdesoxyuridin-(BrdU)-Cell-Proliferation-Enzyme-linked-immunosorbent-Assay-(ELISA)-Kit ermittelt.

Hierfür wurden SW-872 Zellen bzw. primäre humane Fibroblasten wie oben beschrieben (siehe 3.2.1.) passagiert, zu 3x104 Zellen/Well in 96-Well Platten ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Nach einem

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oxidierte das Luminol, was zur Photonenfreisetzung und folglich zu Lumineszenz führte. Das Ausmaß dieser Chemilumineszenz stand in direkter Korrelation zur Menge an proliferierenden Zellen. Sie wurde mit Hilfe eines Orion Microplate Luminometer in Kombination mit dem Simplicity 2.1. Analyseprogramm ermittelt. Die mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) in Bezug auf die Zellproliferation

wurde jeweils für jede Zellart und Substanz durch graphische Extrapolation ermittelt. Dabei handelt es sich um die Stoffkonzentration, bei der die untersuchte Zellproliferation um 50 % reduziert ist. Alle Assays wurden in einem Dreifachansatz durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf die unbehandelte Negativkontrolle normalisiert.

3.3.2. Vitalitäts-Analyse: MTT-Assay

Die Zellvitalität wurde durch einen 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) - Assay ermittelt. Hierfür wurden SW-872 Zellen bzw. primäre humane Fibroblasten wie oben beschrieben passagiert (siehe 3.2.1.), zu 1x104 Zellen/Well in 96-Well Platten ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Nach einem anschließenden Mediumwechsel

wurden 90 µl/Well frisches Medium ohne FBS und 10 µl/Well der Peptid- bzw. Chemotherapeutikumverdünnung hinzugefügt (Tab. 5) und für weitere 24 Stunden bei 37°C im Inkubator kultiviert. Es wurden die gle ichen Kontrollsubstanzen wie beim BrdU-Assay verwendet (siehe 3.3.1.). Nach der Inkubation mit den Testsubstanzen wurde das Medium mit einer Glaskapillare abgesaugt und 200 µl/Well frisches Medium mit FBS hinzugefügt. Hierzu wurden 50 µl/Well MTT der Konzentration 5 mg/ml in PBS gelöst zugefügt. MTT wurde für weitere 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Dieser gelbe, wasserl ösliche Farbstoff wurde von

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Tabelle 5: MTT-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen

vitalen Zellen zu violettem, wasserunlöslichem Formazan reduziert und diente somit als Maßstab für die oxidative Stoffwechselaktivität der Zellen. Die Menge an integriertem Formazan stand dabei in direkter Korrelation mit der Stoffwechselaktivität der einzelnen Zelle. Zuletzt wurde das Medium abgesaugt und die Zellen in 200 µl/Well Dimethylsulfoxid (DMSO) sowie 25 µl/Well Glycin-Puffer resuspendiert. Die Menge an reduziertem Formazan wurde bei 562 nm in einem Elx808 Ultra Microplate Reader in Kombination mit dem KC4 3.01 Analyseprogramm quantifiziert. Die mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) in

Bezug auf den oxidativen Stoffwechsel wurde jeweils für jede Zellart und Testsubstanz durch graphische Extrapolation ermittelt. Alle Assays wurden in einem Dreifachansatz durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf die unbehandelte Negativkontrolle normalisiert.

3.3.3. DNA-Fragmentierung: TUNEL-Assay

Brüche in den DNA-Einzelsträngen wurden durch einen Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-mediated 2'-Deoxyuridine 5'-Triphosphate (dUTP) Nick-End labeling (TUNEL)-Assay nachgewiesen. Hierfür wurden SW-872 Zellen bzw. primäre humane Fibroblasten wie oben beschrieben passagiert und entsprechend einer Zelldichte von 5000 Zellen/cm2 in Kammerobjektträger (0,7 cm2/Kammer) ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Nach einem

anschließenden Mediumwechsel wurden 225 µl/Kammer frisches Medium ohne FBS sowie 25 µl/Kammer der Peptidverdünnung hinzugefügt (Tab. 6) und für weitere 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die eingeset zte Maximaldosis des Peptids

entsprach der zuvor im MTT-Assay ermittelten Letaldosis von

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Tabelle 6: TUNEL-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen

2-8°C gelagert. Die dUTP-markierten Zellen wurden s chließlich mittels eines Zeiss Axioskop 2 Plus Mikroskops analysiert. Bilder wurden mit der Digitalkamera Zeiss AxioCam HRc in Kombination mit dem Programm Zeiss Axio Vision 3.1 erstellt.

3.3.4. Zelltod-Differenzierung: FACS-Analyse

Um das genaue Verhältnis von apoptotischen zu nekrotischen Zellen zu bestimmen, wurde eine Fluorescence-activated cell sorting (FACS)-Analyse unter Verwendung des FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I und 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) durchgeführt. Bei FITC Annexin V handelt es sich um ein Calcium-Ionen abhängiges Zellprotein, welches mit hoher Affinität an das Phospholipid Phosphatidylserin (PS) bindet und welches zudem an den Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (FITC) gekoppelt ist. Ein Zeichen der frühen Phase der Apoptose ist die Translokation von PS von der inneren auf die äußere Plasmamembran der Zelle. Mittels FITC Annexin V konnten somit Zellen in der frühen Apoptose detektiert werden. 7-AAD ist ein Peptid, welches in der FACS-Analyse als Avitalfarbstoff Verwendung findet. Es kann in der DNA der Zellen interkalieren und diese somit markieren. Dies ist jedoch nur bei abgestorbenen Zellen ohne intakte Zellmembran möglich. 7-AAD markierte daher tote Zellen. Entsprechend der unterschiedlichen Markierungsmöglichkeiten mit diesen zwei Farbstoffen konnte in der FACS-Analyse auf den Zustand der einzelnen Zellen bzgl. Nekrose oder Apoptose geschlossen werden. FITC Annexin V – und zugleich 7-AAD-negative Zellen waren vital bzw. es konnte keine Apoptose gemessen werden. FITC Annexin V-positive und gleichzeitig 7-AAD-negative Zellen befanden sich in der frühen Phase der Apoptose bei intakter Zellmembran. FITC Annexin V – und zugleich 7-AAD-positive Zellen befanden sich in der Spätphase der Apoptose oder waren bereits abgetötet. Für die FACS-Analyse wurden SW-872 Zellen wie oben beschrieben (siehe 3.2.1.) passagiert und entsprechend einer Zelldichte von 1,5x105 Zellen/Well in einer

Testsubstanz Konzentration [µM]

Abbildung

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Referenzen

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