(GYV)2015 BME- VBK, Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék, HPLC csoportAnalitikai Kémia II (BIO)Gyógyszeranalitika BobályBalázs Fehérjekromatográfia

(1)

Fehérjekromatográfia

Bobály Balázs

BME-VBK, Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék, HPLC csoport

Analitikai Kémia II (BIO) Gyógyszeranalitika (GYV)

2015

(2)

Tematika

1. Bevezető

2. Molekulaszerkezetből adódó, eltérő kromatográfiás alapjelenségek

3. Heterogenitás jellemzésére szolgáló kromatográfiás módszerek

Sok empirikus adat lesz, csak az alapelveket kell

megtanulni!

(3)

1. Miért kell a fehérjéket analizálni?

- Biológiai rendszerek működésének megértése

koncentráció/szerkezet/aktivitás időbeli/térbeli változása - Hatásos fehérjealapú gyógyszerek előállítása

szerkezet-funkció-aktivitás kapcsolat megértése, hatóanyag/termék minőségének ismerete

Nehézségek:

- A minták általában összetettek: szövetek, testfolyadékok, sejtkultúra szükség van a mátrix egyszerűsítésére

- Adott szekvenciával definiált fehérjemolekulák is nagymértékű heterogenitást mutatnak:

mutációk (pl. aminosavcsere a láncban)

transzlációs módosítások (pl. foszforiláció, glikoziláció) környezeti hatások (pl. oxidáció, aggregáció)

- A nagyfokú variabilitás miatt nem érhetőek el homogén analitikai

standardek

(4)

1. Miben segítenek az elválasztástechnikai módszerek?

- Mátrix egyszerűsítése:

analitikai (pl. MS vizsgálatok)/preparatív céllal (további vizsgálatok) - Heterogenitás jellemzése:

megfelelő módszer megválasztása - Mennyiségi meghatározás:

referenciaanyag megválasztása alapvető Technikák:

- elektroforézis (2D-gél, CGE, cIEF, CEC, CZE)

- folyadékkromatográfia 1. (SEC, IEC, RP, HIC, HILIC):

analitikai módszerek

- folyadékkromatográfia 2. (HIC, AC, IEC):

preparatív módszerek

- „tömegspektrometria” (ionok elválasztása)

- GC: NEM!! SFC: NEM!!

(5)

2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió

kismolekula közepes méretű molekula (peptid) makromolekula (fehérje)

MW [Da] <1000 1000-5000 >5000

D_h(Å) 5-10 10-15 >10-15

D_m[cm²/s] 10^-5 5*10^-6 5*10^-7

konformáció jól definiált „rugalmas” molekula statisztikus eloszlású (környezet)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000

Dh(Å), DLS

MW (Da)

Molekulaméret növekedése a molekulatömeggel

J. Pharm. Biomed. Anal. 54 (2011) 482.

A diffúziós állandócsökken a molekulamérettel:

Meghatározza a mérés sebességét az anyagátadási ellenállás

növekedése miatt A hidrodinamikai átmérő nő a molekulasúllyal:

Meghatározza a töltet pórusméretét

(6)

2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió

Kis- molekula

közepes méretű molekula

(peptid)

makromolekula (fehérje)

d_p(Å) 60-100 100-150 150-500 (ált. 200-300)

C-tag nagyon megnő (D

_m

miatt)

Kompromisszum: R

_s

vs. mérési idő

(7)

2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió

C-tag csökkentése=hatékonyság növelése R

_mag

R

_szemcse

Kis szemcseméret, héjszerű, nagyobb pórusméretű töltetek, magasabb hőmérséklet B-tag kisebb: diffúziós úthossz (kék nyilak) ~5%

C-tag kisebb: diffúziós úthossz (piros vonalak) ~5%

A-tag kisebb: találgatások ~30-40%

Nemporózus töletetek:

- Nagy hatékonyság - Kis terhelhetőség - Kis visszatartás

Csak indokolt esetben:

ha a felületi kölcsönhatás kinetikája lassú és így kisebb

a hatékonyság

(8)

2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió

Molekulaméret csökkentése: (bővebben fehérje MS) - Nagyobb hatékonyság

- Variabilitás jobban elemezhető-kis különbsége relatíve nagyobbak lesznek

(9)

2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól - visszatartás

fehérje: sztöchiometrikus kiszorítás - Z számú szolvens molekula szükséges az elúcióhoz:

I/O viselkedés

~1% változás φ-ben eldöntheti, hogy k≈0, vagy k≈∞

gradiens elúció szükséges!

kismolekula: a megoszlás (visszatartás) jól szabályozható a mozgófázis összetétellel: alkalmazható izokratikus elúció (nagyobb szelektivitás hasonló vegyületek esetén).

(10)

2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól - adszorpció

0 100 200 300 400 500 600

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

EU

Time (min) Intact Palivizumab

50mM formate pH3 25mM formate pH3 10mM formate pH3 0.1% TFA

A

0 50 100 150 200 250

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

EU

Time (min) B

B

0 200 400 600 800 1000 1200

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5

EU

Time (min) Intact Rituximab

C

0 50 100 150 200 250 300 350 400

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5

EU

Time (min) Reduced Rituximab

D

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5

EU

Time (min) Intact Bevacizumab

E

0 50 100 150 200

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5

EU

Time (min) Reduced Bevacizumab

F

Adszorpció mértéke:

- Mérési körülmények oldaláról: T, C_additív, P, kolonna, stb…

- Molekula oldaláról: ???

Valószínűleg a kölcsönható felület minősége a döntő:

konformációfüggő (mérési körülmények)

(11)

3. Mit hoznak a konyhára az egyes LC módszerek?

- Méretkizárásos kromatográfia (SEC):

aggregátumok, fragmensek és kismolekulák elválasztása a natív fehérjétől

- Ioncserés kromatográfia (IEC):

anion és kation töltésvariánsok elválasztása - Fordított fázisú kromatográfia (RP):

oxidált/redukált variánsok, valamint fragmensek elválasztása - Hidrofil kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HILIC):

RP-re nagyjából ortogonális, főleg peptidek esetén használható - Hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC)

alternatív RP, főleg tisztításra használják

Gyógyszeripari környezetben a megfelelő jellemzéshez különböző módszerek együttes alkalmazása szükséges.

A feladat komplexitása miatt nem elvárás az exakt jellemzés, de az elérhető

legrészletesebb, koherens információval kell rendelkezni.

(12)

3. LC módszerek – SEC

(bioaktív forma izolálása lehetséges)

- Aggregáció/fragmensek: terápiás hatékonyság változása, immunreakció - Kiváltó ok: fizikai/kémiai behatások, tárolás

- Elválasztás hidrodinamikai rádiusz alapján (nem MW!)

- Főleg diol fázisok: ne legyen adszorpció!

- d_p: 3-20 µm, d_c: 4.6-8 mm, L: 30 cm - mérési idő: 20-30 min

teljes kizárás

teljes áteresztés 2-3

nagyságrend

pórusméret (Å) MW (kDa) példa 100-150 10-100 Interferon

200-300 100-500 mAb

500-1000 >500 PEGilált f.

- Eltérések a kalibrációs görbétől:

- adszorpció

- elektrosztatikus repulzió - konformációs változások pH≈pI beállítása

50-100mM puffer + 50-100mM só 5-10% MeOH/MeCN

repulzió adszorpció

(13)

3. LC módszerek – SEC

főcsúcs(mAb, ~150 kDa) 2: dimer (~300 kDa) 1: nagyobb aggregátumok 1: monomer (Interferon, ~19 kDa)

2: dimer (~38 kDa) 3: nagyobb aggregátumok Aggregátumok jellemzése:

- moltömeg meghatározása fényszórás detektorral (nehéz, sok a hibalehetőség) - moltömeg meghatározása off-line MS-sel (egyszerű, lassú)

- moltömeg meghatározása on-line SEC-MS-sel (egyszerű, gyors, kevés tapasztalat:

MS barát körülmények)

(14)

3. LC módszerek – IEC

-Elsősorban erős kationcserélő töltetek:

nemporózus, szilika/polimer, vagy gyanta

- 5-10 µm-es szemcsék, kolonnahossz nem kulcskérdés R_sszempontjából - pH<pI-1, gradiens: 1-2M NaCl, vagy kereskedelmi pH gradiens puffer -Töltésvarinasok: pl. C_term-lizin, N_term-glutamin/piroglutamát variábilitás

→eltérő bioaktivitás

-Molekulaméret csökkentésével javul a szelektivitás: limitált proteolízis

Töltésvariánsok

(aminosavcsere/transzlációs módosítás) elválasztása

pH vagy só gradiens alkalmazásával Ioncserélő (kation v. anion) tölteten A töltet töltése ellentétes a variánsok

töltésével!

(15)

3. LC módszerek – IEC

pH gradiens só gradiens

- Szelektivitás egyes esetekben változik

- Sógradiens mellett ált. nagyobb a hatékonyság - Sógradiens mellett ált. mérsékelt adszorpció - Sógradiens egyszerűbben megvalósítható

(16)

LC módszerek – RP

(bioaktív forma izolálása ált. nem lehetséges)

- Fragmensek, oxidált/redukált variánsok, peptidtérkép: főként minőségellenőrzési vizsgálatokban - Elválasztás: főként hidrofób, kisebb mértékben poláris szelektivitás alapján (állófázisfüggő)

- Kapcsolható MS-sel!

- Robusztus, nagy felbontó erő jellemzi - Alapvető körülmények:

- 200-300 Å C4-C18, bifenil, stb…

- héjszerű (hatékonyág) - T: 50-90°C

- MeCN gradiens (0,1% trifluorecetsav) - 200-400 µl/min (2.1 mm i.d.)

- Problémák:

- ált. denaturáló körülmények: aktív formában nem frakcionálható a fehérje (SEC, IEX OK.) - magas hőmérséklet: hődegradáció veszélye

- konformáció nagyon függ a mérési körüményektől (additívek, P, T):

adszorpció, retenció változhat

- A nagy hatékonyság érzékeny az anyagátadási ellenállásra: nagy MW→kis D_m - limitált proteolízissel jelentősen javítható (az adszorpciós hajlam is)

(17)

LC módszerek – RP

(bioaktív forma izolálása ált. nem lehetséges)

LC-GC Eur. 25 (2012) 540.

Filgrastim (18,8 kDa) variánsok, BEH300 1.7 µm, 50*2,1 mm

ox

nat

ox red Papain emésztmény

Fc+Fabvariánsok

DTT redukció LC+HC variánsok

(18)

3. LC módszerek – HIC

- Hidrofób az állófázis felületete

- Kezdeti magas sókoncentrációval „kisózzuk” a fehérjéket az állófázis felületére - A sókoncentráció csökkentésével megtörténik a deszorpció/elúció

- Főként preparatív elválasztásokban használják: bioaktív RP

- Nagyon érzékeny a fehérje felületi hidrofóbicitásának változásaira

Analitikai elválasztásban:

pH≈pI, 50mM puffer + 1-2 Mm sógradies

nemporózus töltet (polimer/módosított szilikagél), kis szemcseméret, kis kolonnatérfogat

(19)

3. LC módszerek – HIC: ADC-k jellemzése

- Ha a kapcsolás (linker) és a konjugált drog neutrális, egyébként IEC

- Igéretes módszer antitest-drog konjugátumok jellemzésére: érzékeny a felületi hidrofóbicitás változására (Drug-Antibody Ratio: DAR – nagymértékben befolyásolja a szer hatékonyságát) - Eddig kevés a tapasztalat…

(20)

3. LC módszerek – AC

- Rendkívül sokféle állófázis, igényre szabható ($) - Főbb típusok:

- immunaffinitás (antigén megkötése immobilizált antitesttel, vagy fordítva) - immobilizált fémion affinitás (IMAC): Co/Cu/Ni: hisztidintartalmú fehérjék

Fe/Zn/Ga: foszfopreoteinek - lektin: glikoproteinek

- stb…

- Adott fehérje kinyerése további vizsgálatra, vagy mátrix tisztítása zavaró fehérjéktől.

- Kolonnában, SPE, vagy spin-cartridge-ként is elérhető

(21)

3. LC módszerek – frakcionálás fehérje és peptid szinten

Humán plazma fehérjék (Alb, IG depletálva) RP: nincs glikoformelválasztás

Helyspecifikus glikoziláció minor glikoformokra is

Transzferrin triptikusemésztmény HILIC: glikopeptiddúsítás

- Megfelelő szelektivitás kiválasztása - Frakciószedés, mintaelőkészítés, analízis

- Minor komponensek szelektív dúsítása,

„tetszőleges” mértékben.