• Nem Talált Eredményt

Madár-botulizmus vizsgálata a Kis-Balaton területén

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Ossza meg "Madár-botulizmus vizsgálata a Kis-Balaton területén"

Copied!
131
0
0

Teljes szövegt

(1)

DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

BABINSZKY GERGELY

KESZTHELY 2011

(2)
(3)

PANNON EGYETEM

GEORGIKON MEZİGAZDASÁGTUDOMÁNYI KAR Növénytudományi és Biotechnológia Tanszék

Állat-és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskola Iskolavezetı:

Dr. habil. Anda Angéla Egyetemi tanár, az MTA doktora

Témavezetı:

Dr. Csitári Gábor Egyetemi docens

Madár-botulizmus vizsgálata a Kis-Balaton területén

DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

Készítette:

Babinszky Gergely

Keszthely 2011

(4)

Madár-botulizmus vizsgálata a Kis-Balaton területén

Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében

Írta:

Babinszky Gergely

Készült a Pannon Egyetem Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskolája keretében

Témavezetı: Dr. Csitári Gábor

Elfogadásra javaslom (igen / nem)

(aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton …... % -ot ért el,

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom:

Bíráló neve: …... …... igen / nem

……….

(aláírás) Bíráló neve: …... …... igen / nem

……….

(aláírás) ***Bíráló neve: …... …... igen / nem

……….

(aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …...% - ot ért el

Veszprém/Keszthely, ……….

a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minısítése…...

………

Az EDT elnöke

*** esetleges

(5)

TARTALOMJEGYZÉK

KIVONAT... 7

ABSTRACT... 8

INHALTSANGABE... 9

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 10

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŐZÉSEK... 12

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 15

2.1. A baktérium története... 15

2.2. A baktérium rendszertani besorolása... 15

2.3. A baktérium morfológiája, törzseinek csoportosítása, biokémiai jellemzıi... 16

2.4. A toxin jellemzése... 21

2.4.1. A botulinum toxin... 21

2.4.2. A C2 és C3 toxinok... 25

2.4.3. A botulinum toxinnal szembeni természetes immunitás... 27

2.5. Madár-botulizmus... 28

2.5.1. Történet, elıfordulás... 28

2.5.2. Kóroktan, járványtan... 29

2.5.3. Kórfejlıdés, tünetek... 30

2.5.4. Kórbonctan, kórjelzés... 31

2.5.5. Gyógykezelés, megelızés... 31

2.5.6. Humán kórtani jelentıség... 32

2.5.7. Környezeti faktorok szerepe a madár-botulizmus megbetegedésekben... 32

2.5.7.1. Spórák... 34

2.5.7.2. A C típusú Clostridium botulinum szaporodásának környezeti feltételei.... 37

2.5.7.2.1. Levegı- és vízhımérséklet... 37

2.5.7.2.2. Szervesanyag-tartalom... 39

2.5.7.2.3. pH, redoxpotenciál, sótartalom (vezetıképesség), oldott oxigén-szint. 39 2.5.7.2.4. Gerinctelen biomassza... 41

2.5.7.2.5. Egyéb mikroorganizmusok gátló hatása... 42

2.5.7.3. Fágok... 42

2.5.7.4. A lehetséges áldozat toxinfelvétele... 45

2.5.7.5. A baktériumok és a toxin szétterjesztése... 46

2.5.7.6. Egyéb faktorok... 49

2.5.8. Madár-botulizmus Magyarországon... 50

2.5.8.1. Madár-botulizmus a Kis-Balatonon... 53

2.6. A baktérium illetve toxinja jelenlétének kimutatása... 58

2.6.1. Egéroltás (mouse bioassay)... 58

2.6.2. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)... 59

2.6.3. Molekuláris biológiai technikák... 59

2.6.3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction)... 59

2.6.3.2. Ribotipizálás... 63

2.6.4. Biokémiai tesztek... 63

2.6.4.1. API... 64

2.6.4.2. RapID ANA II... 64

3. ANYAG ÉS MÓDSZER... 65

3.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata... 65

3.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval... 67

(6)

3.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján... 67

3.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 69

3.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 69

3.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók... 71

3.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel... 72

4. EREDMÉNYEK... 73

4.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata... 73

4.1.1. Vízminıségi adatok... 73

4.1.2. Meteorológiai adatok... 75

4.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval... 76

4.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján... 76

4.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 79

4.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 79

4.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók... 86

4.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel... 86

5. KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK... 87

5.1. A környezeti tényezık statisztikai vizsgálata... 87

5.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval... 87

5.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján... 87

5.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 88

5.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 88

5.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók... 89

5.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel... 89

5.4. Javaslatok a madár-botulizmus megbetegedések megelızése illetve kártételének csökkentése érdekében... 90

6. ÖSSZEFOGLALÁS... 92

7. FELHASZNÁLT IRODALOM... 94

8. TÉZISPONTOK... 114

8.1. Tézispontok magyarul... 114

8.2. Thesis statement... 115

9. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK, ELİADÁSOK... 116

10. FÜGGELÉK... 120

10.1. A diszkriminancia analízis vázlatos menete, GAÁL /2004/ alapján... 120

10.2. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, PCR reakcióval... 126

10.2.1. Nested PCR reakció WILLIAMSON és mtsai. /1999/ alapján... 126

10.2.2. Hagyományos PCR reakció FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 126

10.2.3. Módosított real-time PCR reakció, FRANCIOSA és mtsai. /1996/ alapján... 127

10.2.4. Lux primer-alapú real-time PCR reakciók... 128

10.3. A C típusú Clostridium botulinum kimutatása Kis-balatoni iszapmintákból, tenyésztéssel... 130

11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 131

(7)

KIVONAT

A Clostridium botulinum egyes toxintípusai által okozott madár-botulizmus világszerte a vízimadarak egyik legjelentısebb bakteriális eredető megbetegedése. Közismert, hogy e kórforma kialakulását bizonyos környezeti tényezık nagyban segíthetik. Jelen kutatási programban ezért célul tőztük ki e faktorok és a madár-botulizmus kitörések közti kapcsolat feltérképezését a megbetegedések szempontjából endémiásnak tekinthetı Kis- Balaton területén, statisztikai számítások segítségével. Emellett kísérletet tettünk a kórokozó iszapmintákból, hagyományos mikrobiológiai valamint molekuláris biológiai módszerekkel történı detektálására, illetve utóbbi technikák alkalmazhatóságának összehasonlítására.

A vizsgálatok során hazánkban elsıként mutattunk ki szoros összefüggéseket néhány környezeti paraméter (levegı- és vízhımérséklet, pH, oldott oxigén- és szervesanyag- tartalom) és a madár-botulizmus fellépése között.

A Kis-balatoni iszapmintákból több, Clostridium botulinum-ra emlékeztetı Clostridium-fajt különítettünk el, ezek további vizsgálata azonban nem utalt botulinum toxin termelésére.

Az általunk használt molekuláris biológiai módszerek egyikével kapcsolatban elıször számoltunk be fals pozitív eredményekrıl. E mellett elsıként ültettünk át egy hagyományos, PCR alapú diagnosztikai módszert egy olvadáspont-analízissel kiegészített, LightCycler-alapú real-time környezetbe, ezzel tovább növelve annak gyorsaságát, egyszerőségét és érzékenységét. Végül kísérletet tettünk egy, a madár- botulizmus kitörések igazolására használható, több szempontból új megközelítéső real- time PCR reakció kidolgozására.

(8)

ABSTRACT

The aims of this research project were to compare some water quality parameters of high and low botulism risk areas of Lake ‘Kis-Balaton’ using statistical methods to determine their significance in the occurrence of avian botulism epizootics, and to detect and isolate the etiological agent Clostridium botulinum from mud samples derived from the above mentioned wetland site by conventional microbiological and various molecular techniques including a new LightCycler-based real-time PCR reaction.

(9)

INHALTSANGABE

Die Ziele dieses Forschungsprogrammes waren, einige Einflussfaktoren der Wasserqualität auf Gebieten hohen und niedrigen Botulismusrisikos des Kleinen Plattensees mit Verwendung von statistischen Methoden zu vergleichen, sowie den Krankheitserreger des Clostridium botulinum aus den aus diesem Feuchtgebiet stammenden Schlammmustern mit konventionellen mikrobiologischen und verschiedenen molekularen Techniken, einschliesslich einer neuen LightCycler- basierten Realtime-PCR-Reaktion, nachzuweisen und zu isolieren.

(10)

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ADP adenozin-difoszfát

ANOVA varianciaanalízis (analysis of variance) BoNT/C1 C1 típusú botulinum neurotoxin (termelés)

bp bázispár

BSA bovin szérum albumin (bovine serum albumin)

BSM botulinum szelektív tápközeg

(botulinum selective medium)

CBI Clostridium botulinum izolációs agar

CCFA cikloszerin-cefoxitin-fruktóz agar

CM fıtt hús (cooked meat)

dNTP dezoxinukleotid-trifoszfát

DRCM megerısített differenciáló clostridium tápközeg (differential reinforced clostridial medium)

EYA tojásagar (egg yolk agar)

GTP guanozin-trifoszfát

IEW ioncserélt víz (ion-exchanged water)

ip. intraperitoneális(an)

iv. intravénás(an)

kDa kilodalton

MLD minimális letális dózis

NAD nikotinsavamid-adenin-dinukleotid

ppt trilliomod-rész, 10-12-ed rész (parts per trillion)

rDNS riboszómális DNS

SNAP-25 szinaptoszómához kapcsolt fehérje

(synaptosomal associated protein)

SNARE oldható N-etilmaleimid-érzékeny faktorhoz kapcsolódó fehérje-receptorok

(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)

TBE trisz-bór-EDTA

(11)

TPGY tripton-pepton-glükóz-élesztıkivonat agar (tryptone-peptone-glucose-yeast agar)

ttkg testtömeg-kilogramm

U egység (unit)

USGS Az Egyesült Államok Geológiai Kataszteri Hivatala (United States Geological Survey)

(12)

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŐZÉSEK

Az obligát anaerob Clostridium botulinum toxinjai által kiváltott madár-botulizmus az érintett madárfajok száma és a mortalitási adatok alapján világszerte a vízimadarak legjelentısebb bakteriális eredető megbetegedése, amely az 1994 és 1997 közötti idıszakban, csak az Egyesült Államok és Kanada területén több mint négymillió vízimadár életét követelte. Egyetlen, 1996-ban bekövetkezett kaliforniai kitörés során az orrszarvú pelikán (Pelecanus erythrorhynchos) teljes nyugati populációjának mintegy 15%-a pusztult el /ROCKE, 2006/.

Az anyagi kár mellett a védett illetve veszélyeztetett fajok egyedeinek elhullásából adódó eszmei kár ugyancsak hatalmas lehet. Ebbıl a szempontból kiemelkedı jelentıségőek azok a védett területek, melyeken a madár-botulizmus esetek visszatérıen jelentkeznek. Hazánkban ezek közé tartozik a Balaton-felvidéki Nemzeti Park részét képezı Kis-Balaton régiója, ahol egy-egy kitörés vízimadarak ezreivel, olykor tízezreivel végzett /MAGYARI; szóbeli közlés/.

Régóta ismert, hogy a megbetegedések kialakulását különféle biotikus és abiotikus tényezık kedvezıen befolyásolhatják. Amint azt WOBESER /1987/ megjegyezte, e feltételeknek nincs olyan egyszerő együttállása, ami az összes kitöréssel összefüggésbe hozható, de meghatározta azt az öt tényezıt, amely ebbıl a szempontból alapvetı fontosságú. Ezek a spórák megléte, a Clostridium botulinum szaporodásához szükséges környezeti faktorok, a baktériumok specifikus bakteriofággal történı fertızıdése, a lehetséges áldozat toxinfelvétele illetve a kórokozó és a toxin megfelelı vektorok által történı elterjesztése.

Mindezek fényében meglepı lehet madár-botulizmus esetekrıl olvasni akkor, amikor ezt a környezeti tényezık egyáltalán nem indokolják, illetve a kitörések elmaradását tapasztalni a korábban említett feltételek akár legkedvezıbb együttállása során.

A hazai és nemzetközi tapasztalatok alapján kijelenthetı, hogy a jelenség háttérben olyan komplex, élıhelyenként változó rendszerrel állunk szemben, melyben a kulcselemek mellett egyéb, eddig ismeretlen, vagy kevésbé jelentısnek tartott tényezık hatásaival is számolni kell.

Bár a betegség etiológiája már csaknem egy évszázada ismert, a Clostridium botulinum természetes mintákból történı izolálásának nehézségei a madár-botulizmust a baktérium

(13)

oldaláról megközelítve is rejtélyessé teszik. Példaként megemlíthetı, hogy mindmáig nem létezik olyan szelektív táptalaj, melynek segítségével a C típusú, nem proteolitikus Clostridium botulinum törzsek nagy biztonsággal elkülöníthetık volnának a társflórától, s ezt csak tetézik a kórokozó szigorú anaerob voltából adódó módszertani komplikációk.

E problémakört megkerülve, a diagnosztikai gyakorlatban a baktérium kimutatása helyett megelégszenek az általa termelt toxin detektálásával. Az egéroltáson alapuló toxinsemlegesítési vizsgálat a mai napig az egyetlen, széles körben elfogadott illetve alkalmazott diagnosztikai metódus, legyen szó akár humán, akár állati megbetegedésekrıl. Az állatkísérletekkel szemben felmerülı aggályok azonban idırıl- idıre új, etikai, gazdasági és módszertani szempontból is megfelelıbb eljárások kifejlesztését sürgetik. Az immunológiai alapú vizsgálatok mellett ilyenek lehetnek a polimeráz-láncreakción (PCR) alapuló meghatározások, melyek a madár-botulizmus kitörések megerısítésében is egyre nagyobb tért hódítanak. Nem szabad azonban elfeledni, hogy e technikák zöme egyelıre csak egymással kombinálva nyújt kellı biztonságot a megbetegedések tényének igazolása során.

Az értekezésben ismertetett kutatási program legfontosabb célja különféle biotikus és abiotikus környezeti tényezık, és a madár-botulizmus kitörések közötti kapcsolat feltárása a megbetegedések szempontjából endémiásnak tekinthetı Kis-Balaton területén. E vizsgálatok alacsony illetve magas kockázatú mintavételi pontok vízhımérséklet, szervesanyag-tartalom, pH, vezetıképesség és oldott oxigén-tartalom értékeinek, illetve a térség léghımérsékleti és csapadékeloszlási adatainak összevetését foglalják magukban, alacsony (kitörésmentes) illetve magas kockázatú (elhullással járó) években.

Továbbá célul tőztük ki a Kis-balatoni megbetegedéseket kiváltó C típusú, neurotoxin- termelı Clostridium botulinum baktériumok jelenlétének kimutatását, helyben győjtött iszapmintákból, hagyományos és real-time polimeráz-láncreakció segítségével; egyben elvégezve e technikák alkalmazhatóságának összehasonlítását. Mindezek mellett kísérletet kívántunk tenni a kórokozó klasszikus mikrobiológiai módszerek felhasználásával történı izolálására is.

Az e tárgykörben magyar nyelven olvasható csekély számú publikáció arra sarkallt bennünket, hogy az értekezés témájának szakirodalmi feldolgozása a lehetı legteljesebb

(14)

képet nyújtsa, a kórokozó oldaláról tekintve éppúgy, mint az általa kiváltott megbetegedésérıl.

A kutatási program eredményei reményeink szerint közelebb visznek a madár- botulizmus kialakulásának jobb megismeréséhez, a kitörések biztosabb elırejelzéséhez illetve az általuk okozott anyagi és eszmei károk mérsékléséhez.

(15)

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. A baktérium története

Bár a betegség tüneteit már a XIV. század elején leírták Német- és Oroszországban /NIKODÉMUSZ és mtsai., 1960/, az elsı adatokat errıl a baktériumfajról KERNER /1822/ publikálta. A botulizmus elnevezés is tıle származik, mivel összefüggést talált bizonyos kolbászféleségek fogyasztása (botulus = kolbász; latin) és egyes csoportos ételmérgezések között. A toxikoinfekcióért felelıs kórokozóról szóló bıvebb információkat elıször VAN ERMENGEM /1897/ írta le egy botulizmus járvány kapcsán, mely 1895. decemberében, a belgiumi Ellezelles városában egy zenés összejövetelen tört ki. Ötven ember betegedett meg, közülük hárman meghaltak. A baktériumot nyers sonkából tenyésztette ki és elnevezte Bacillus botulinus-nak, ami késıbb a Clostridium botulinum elnevezést kapta. Alig száz évvel KERNER elsı publikációját követıen bebizonyosodott, hogy e baktériumfaj egyes típusai különbözı állatokban is képesek megbetegedéseket okozni.

2.2. A baktérium rendszertani besorolása

A Clostridium botulinum faj rendszertani besorolása a Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2. kiadása szerint /GARRITY és mtsai., 2004/, amely a 16S rRNS gén szekvenciahomológiák és eltérések alapján osztályozza a mikroorganizmusokat, a következı:

Domén: Bacteria Törzs: Firmicutes Osztály: Clostridia Rend: Clostridiales Család: Clostridiaceae Nemzetség: Clostridium

Faj: botulinum

(16)

2.3. A baktérium morfológiája, törzseinek csoportosítása, biokémiai jellemzıi

A botulizmus kórokozóit a rendszertan egy speciesbe sorolja a tenyésztésbeli és biokémiai eltérések ellenére, mivel farmakológiailag azonos hatású neurotoxint termelnek. A fajt a toxinok szerológiai specificitása alapján osztották fel A, B, C1, D, E, F, G típusokra. Kezdetben a C2 típust is ide sorolták, de ma már nyilvánvaló, hogy a C2 toxin nem okoz idegrendszeri tüneteket. Eltekintve a toxinok szerológiai specificitása alapján elvégzett felosztástól, más, fıként biokémiai tulajdonságai alapján a Clostridium botulinum fajt négy csoportra osztották:

I. proteolitikus, A, B, F toxintípusú törzsek II. nem proteolitikus, B, E, F toxintípusú törzsek III. nem proteolitikus, C, D toxintípusú törzsek

IV. gyengén (egyáltalán nem) proteolitikus és nem szacharolitikus, G toxintípusú törzs (1. táblázat).

1. táblázat. A Clostridium botulinum törzseinek csoportosítása fenotípusos jellemzıik alapján (HATHEWAY /1990/ nyomán, módosítva).

illó nem illó

I A, B, F + + + E, iVaj, V, iVal FP

II B, E, F - + + E, V

III C, D +/- + + E, P, V

IV G + - - E, iVaj, V, iVal FE

Csoport Toxintípus Proteolitikus aktivitás

Glükóz- bontás

Lipáz reakció

Anyagcseretermékek* Fenotípusosan rokon Clostridium-ok C. sporogenes C. novyi C. subterminale

*Savas anyagcsere-végtermékek PYG tápközegben. E: ecetsav, P: propionsav, iVaj: izo-vajsav, V: vajsav, iVal: izo- valeriánsav, FP: fenil-propionsav, FE: fenil-ecetsav

A III. csoportba tartozó, nem proteolitikus C és D toxintípusú törzseknél, melyek közül elıbbiek a madár-botulizmus fı kórokozói /REILLY – BOROFF, 1967/, 0,5-0,7 x 3,4- 7,9 µm nagyságú, peritrich csillóik segítségével mozgó egyenes pálcákat találunk.

Gram-pozitívak, sejtfaluk DL-diamino-pimelinsavat tartalmaz. Spóráik oválisak, szubterminálisak.

Felületi telepei kerekdedek, enyhén szabálytalanok, gyengén csipkézett szélőek, kissé kiemelkedık; áttetszı, szürkésfehér, sima, matt felületőek (1. kép).

Nutrient vagy CM buillon-ban erjeszthetı szénhidrátok jelenlétében is mérsékelten növekednek. Fermentációs termékeik az ecetsav, propionsav és a vajsav. A zselatint

(17)

hidrolizálják; a tejet nem emésztik. Szaporodási optimum hımérsékletük 30-37°C.

DNS-ük GC tartalma 26-28 mol % /BERGEY, 1974/. A pH-optimummal kapcsolatban pontos adatok a feldolgozott hazai és nemzetközi irodalomban nem találhatók.

1. kép. Lecitináz- és lipáz-aktív, C típusú Clostridium botulinum telepek (72h, EYA) /a szerzı felvétele/.

Az I. csoport törzsei A, B és F típusú toxint termelhetnek (1. táblázat). Az A típusú toxint termelı törzsek a kevéssé lakott, mezıgazdasági mővelésbe nem vont, nagy kiterjedéső füves pusztákon élnek. Az USA-ban a Mississippi-tıl nyugatra, valamint Argentína és Kína területén írták le jelenlétüket. A talajmővelés intenzívebbé válása elpusztítja ıket. A kórokozók fennmaradásában a legelı, illetve füves pusztán élı állatok játszanak szerepet, amelyek bélflórájából az ott jelenlévı – nem szaporodó – baktérium az állat elhullásakor kiszabadul, és a bomló szöveteket nagy tömegő vegetatív forma árasztja el, amely a tetem belsejében spórásodik. A spórák terjesztésében a dögbıl táplálkozó ragadozók, rovarok, rágcsálók egyaránt szerepet játszhatnak, ürülékükkel szennyezve a talajt /GULYÁS és mtsai., 1998/.

A B toxintípusú törzsek a lombos erdık éghajlati övében, túlnyomórészt savanyú talajokon fordulnak elı. Ez a típus váltja fel az A toxin-termelı törzseket a mezıgazdasági mővelésbe fogott területeken. A proteolitikus B típus foglalja el a földmővelésbe vett, kiszárított tengerfenéken az E típus helyét. A természetben való fennmaradás mechanizmusa az A típuséhoz hasonló. A baktérium a bomló állati

(18)

szövetekben szaporodik jól, de növényi szövetekben is képes növekedni, és toxint termelni /GULYÁS és mtsai., 1998/.

Európában – így hazánkban is – a B toxintípus okozza a humán megbetegedések többségét, mely általában házi állatvágások során kerül be a különbözı húskészítményekbe. Ha a Clostridium botulinum okozta ételmérgezés földrajzi elıfordulását figyeljük, azt tapasztalhatjuk, hogy az esetek zöme a Dunántúl déli megyéire, elsısorban Baranya és Tolna megyére korlátozódott egészen a legutóbbi évekig. 1993 óta azonban a Nyírségbıl is számos ételmérgezést jelentettek /GULYÁS és mtsai., 1998/.

A II. csoport törzsei B, E és F típusú toxint képezhetnek. A két utóbbi toxint termelı törzsek a hideg éghajlati övezet édesvizeinek és tengerpartjainak lakói. Dán szerzık vizsgálatai alapján az E típus Európában a Balti-tenger sekély öbleiben és az édesviző, gazdag állatvilággal benépesített tavakban tenyészik /HUSS, 1980/. Valódi vízi organizmus, mely a vízben és az iszapban 102/g csíraszámot is elérhet. Jelen van a vízi gerinctelen élılények és a halak bélcsatornájában, és az állat pusztulása után a tetemben elszaporodva toxint termel. A spórákat a halak és a vízáramlatok terjesztik. Az E típus Alaszka, Kanada és Szibéria területén is igen elterjedt. Az F típus Japán tengerpartjain és az USA-ban fordul elı.

A III. csoportba tartozó törzsek C és D típusú toxint állíthatnak elı. E törzsek a meleg éghajlaton, az iszapban és madarak, illetve emlısök bélcsatornájában élnek. A víz felmelegedése esetén a baktérium 15°C felett képes az iszapban levı elhalt élılények tetemein szaporodni, és toxint termelni. A gerinctelenekre a toxin hatástalan, ezek baktériumhordozóként szerepelnek. Az iszapban élı férgekbıl, rovarokból táplálkozó madarak a kórokozót, illetve a toxint elfogyasztják, beteggé és tartós baktériumürítıvé válnak, a fertızést nagy területeken széthurcolhatják. Az elhullott madártetemeken élı légyálcák a toxint nagy mennyiségben tartalmazzák. Ezek elfogyasztása ismét a madarakat mérgezi. A végeredmény tömeges madárpusztulás, amely mindaddig tart, amíg a fertızési lánc meg nem szakad. A madarak, elsısorban a fiatal egyedek, igen érzékenyek a toxinnal, és fogékonyak a baktériummal szemben.

A IV. csoport törzsei G típusú toxint termelhetnek, melyek fıleg kísérleti állatok megbetegedését, s igen ritkán emberi mérgezést is okoznak /GULYÁS és mtsai., 1998/.

(19)

A C típusú Clostridium botulinum törzsek biokémiai tulajdonságainak vizsgálatával kapcsolatban viszonylag kisszámú közlemény olvasható. Ennek okai egyrészt a baktérium izolálásának, fenntartásának és tenyésztésének nehézségében, másrészt pedig – valószínőleg épp ebbıl adódóan – a tenyésztést „megkerülı” diagnosztikai eljárások elterjedésében keresendık (lásd késıbb). A nemzetközi irodalomban, e témakörben fellelhetı eredményeket, melyek enzimreakciók, szénhidrát-hasznosítás és különféle anyagcseretermékek vizsgálatán alapulnak, a 2. táblázat foglalja össze.

A táblázat adatait szemlélve szembetőnı eltérések figyelhetık meg az egyes törzsek biokémiai jellemzıi között. OGUMA és mtsai. /1986/ szerint például néhány munkában negatív lecitináz aktivitásról, illetve indolképzésrıl számolnak be, míg mások /SEGNER és mtsai., 1971a; NAKAMURA és mtsai., 1983/ minden esetben pozitív lecitináz reakcióról, egy törzs esetében pedig indol-pozitivitásról írnak. Bár a szénhidrát-fermentációs mintázatban az egyes izolátumok között tapasztalható különbségek – az eltérı enzimkészlet okán – még csak-csak magyarázhatók, azonos törzsek között azonban már aggodalomra adhatnak okot (468-as törzs: indolképzés, fruktóz- és maltózbontás; 6813-as és 6814-es törzsek: fruktózbontás – 2. táblázat).

OGUMA és mtsai. /1986/ szerint e meglepı eredmények okai az eltérı vizsgálati módszerekben keresendık.

E tények figyelembevételével szerencsés volna egy olyan nyilvános, világszerte követendı módszertani útmutató létrehozása, melynek segítségével az efféle anomáliák kiküszöbölhetık lennének. A fenti kételyek ellenére a különféle biokémiai alapú rendszerek (pl. API, Biolog) használata meglehetısen elterjedt.

(20)

2. táblázat. Szárazföldi és tengeri eredető, C típusú Clostridium botulinum törzsek biokémiai tulajdonságai.

BERGEY, 1974

H2S-termelés - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. + + (+) + (+) - -

Ureáz - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Zselatin hidr. + + + + + + + + + + + + + +

Kazein hidr. - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. - - - - - - -

Nitrátred. - - - - - - - - - - - - - -

Acetoin (VP) - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Indol-képzés - - - - - - - + + (+) + (+) - -

Hemolízis + n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. + + + + + + +

Lecitináz v + + + + + + + + + + + + +

Lipáz + + + + + + + + + + + + + +

Adonit n.v. - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Amygdalin d n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Arabinóz d - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Cellobióz - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Dextróz n.v. - - (+) (+) (+) (+) n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Dulcit - - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Eszkulin - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Fruktóz + - - - - - - + + + + + + +

Galaktóz d - - + + + + - - - - - + +

Glükóz + + + + + + + n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Glicerin d - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Glikogén - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Inozit d - - (+) (+) (+) (+) n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Inulin - - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Laktóz - - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Maltóz d - - (+) (+) (+) (+) + + + - - + +

Mannit - - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Mannóz + + + + + + + + + + (+) (+) + +

Melezitóz - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Melibióz - - - (+) (+) (+) (+) - - - - - + +

Raffinóz - - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Rhamnóz - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Ribóz d - - + + + + n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Szalicin - - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Szorbit d - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Szorbóz - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Keményítı - - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Szacharóz d - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Trehalóz d - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

Xylóz - - - - - - - n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v.

d: a törzsek 11-89%-a pozitív; v: változó; n.v.: nem történt vizsgálat; (+): gyenge pozitivitás; (T): tengeri törzs; (Sz):

szárazföldi törzs; (G. I-IV.): biokémiai tulajdonságok alapján történı csoportosítás (OGUMA et al., 1986)

D6F (?) (G. II.)

6813 (T) (G. IV.) 6813

(T) (G. IV.)

6814 (T) (G. IV.)

Stockh.

(?) (G. I.)

468 (Sz) (G. I.)

CB19 (Sz) (G. I.)

203 (?) (G. II.) 6816

(T) (?)

6814 (T) (G. IV.) 468

(Sz) (G. I.)

571 (Sz)

(?) 6812

(T) (?)

OGUMA et al., 1986 SEGNER et al., 1971

nem proteolitikus B, C, D, E, F

(21)

2.4. A toxin jellemzése

2.4.1. A botulinum toxin

A Clostridium botulinum háromféle toxint termel (botulinum toxin, C2 és C3 toxin).

Mielıtt ezt felfedezték, egyes sajátosságokat, mint az ADP-riboziláció, ami valójában a C2 és C3 toxinokkal kapcsolatos, a botulinum toxinnak tulajdonították, mivel a botulinum toxin-készítmények e másik két toxinnal voltak szennyezve.

Az ADP-riboziláció során a NAD-molekuláról szabaddá válik a nikotinsav-amid, a ribozilált fehérje amino-csoportjához pedig kovalens kötéssel egy ADP-ribóz molekula kapcsolódik.

Az ADP-ribozilációs aktivitás a C2 és C3 toxinok mellett más toxinokra is jellemzı.

Ilyenek például a diphteria- és a cholera-toxinok. Botulinum-toxin esetében a ribozilált aminosav arginin helyett aszparagin /SEKINE és mtsai., 1989/.

A botulinum toxin az egyetlen a három közül, amely a neuronokra hat, így kétségtelenül ez a toxin a felelıs a betegség tüneteiért. Jóval toxikusabb is a másik kettınél.

A botulinum toxinnak legkevesebb hét, szerológiailag eltérı típusa van (A, B, C1, D, E, F, G). Élettani hatásuk azonos: az idegvégzıdésen egy neurotranszmitter, az acetil-kolin felszabadulását gátolják /SALYERS – WHITT, 1994/.

A dolgozatban – a könnyebb átláthatóság kedvéért – ahol erre csak mód nyílt, a „C1

toxin” kifejezés „C toxin”-ra lett változtatva, így a továbbiakban ezek egymás szinonimáinak tekintendık.

A neuromuszkuláris szinapszisban az acetil-kolint tartalmazó vezikulumokat a synaptobrevin szállítja a preszinaptikus membrán felé. Ezt a fehérjét hasítja a toxin B, D, F, G típusa. A membránon a syntaxin és a SNAP-25 alkotják azt az aktív kötıhelyet, ahol a vezikulumok rögzítése és kiürítése végbemegy. Az A és E toxinok szubsztrátja a SNAP-25 molekula, míg a C toxin a syntaxint támadja meg /BENFENATI – VALTORTA, 1995/, bár ARNON és mtsai. /2001/ szerint utóbbi szubsztrátjaként a SNAP-25 szintén elképzelhetı (1. ábra).

A botulinum toxin mindegyik típusa cink-dependens metalloproteáz, így képes arra, hogy a neuroexocitózis folyamatában résztvevı fehérjekomponenseket jellegzetes helyeken hasítsa. A cink-ionok központi szerepet játszanak a peptid-kötések hidrolízisében /HUNTER – POXTON, 2002/. A „négykarú” cink-kötı hely, mely két

(22)

Ugyancsak itt helyezkedik el a HELIH konszenzus aminosav-szekvencia, amely más, cink-függı metalloproteázokra szintén jellemzı (2. ábra) /PESTRONK, 2008/.

1. ábra. A botulinum toxinok hatásmechanizmusa és támadáspontjai a kolinerg idegvégzıdésen (ARNON és mtsai./2001/ nyomán).

(23)

A botulinum toxin egy 150 kDa molekulasúlyú fehérje, amely része egy, a toxin mellett egyéb proteineket is tartalmazó komplexnek. A komplexet progenitor toxinnak, magát a toxint pedig derivatív toxinnak hívják. A derivatív toxin orálisan bejutva a szervezetbe a progenitor toxinnál kevésbé hatásos, injektálva viszont ennek épp a fordítottja tapasztalható. Ez vezetett ahhoz a feltételezéshez, hogy a progenitor toxin nem toxikus komponensei szerepet játszanak a derivatív toxin gyomorsavtól és a proteázoktól való védelmében, illetve a gyomor nyálkás felszínén történı átjutásban, majd a megkötıdésben.

Az aktív derivatív toxin – csakúgy, mint oly sok más exotoxin – két fehérje alegységbıl áll, egy nehéz láncból (100 kDa) és egy könnyő láncból (50 kDa), melyek egy diszulfid- híddal kapcsolódnak. A nehéz lánc két további alegységbıl áll (HcN (Hc1) és HcC (Hc2); 2. ábra), ezek közül az utóbbi felelıs a megkötıdésért /HUNTER – POXTON, 2002/.

A derivatív toxint a baktérium inaktív fehérje formájában szintetizálja és választja ki. A fehérje proteolitikus hasítása aktiválja a toxint, amely megvalósulhat a Clostridium-ok által termelt és a gyomorban keletkezı proteázoktól is.

A toxin kötıdési helye a nehéz lánc C-terminálisa közelében található. Úgy gondolják, hogy a lánc N-terminálisa egy csatornát képez a neuron membránjában, lehetıvé téve a könnyő lánc belépését a sejtbe /SALYERS – WHITT, 1994/.

A botulinum toxin igen mérgezı anyag. Nemzetközi egysége (1 U=1 LD50) az a mennyiség, amely 20 g-os nıstény Swiss-Webster egereknek beadva a kísérleti csoport felét 4 napon belül elöli. Az A típusú tisztított neurotoxin 1 ng-ja 2,5 LD50 hatáserısségő1 a Botox (USA) készítményben, a brit Dysport toxin pedig 40 MLD/kg erısségő. Az ember letális dózisa 30-40 MLD/kg az A toxintípusból /GULYÁS és mtsai., 1998/. Az A, B és D típusok egéren mért toxicitása azonos mértékő, a C, E és F típusú toxinok negyed-, illetve tizedakkora toxicitási értékek között mozognak /TOPLEY – WILSON, 1990/.

1 LD : az a méregadag mg/testtömeg kg-ban (vagy ml/kg-ban, mmol/kg-ban) kifejezve, amely a kezelt,

(24)

A C típusú toxin 4,4x107 MLD/mg protein toxicitású; a tisztított toxin molekulasúlya 141 kDa (98 kDa (nehéz lánc) + 53 kDa (könnyő lánc)) /SYUTO – KUBO, 1977/.

2. ábra. A botulinum toxin szerkezete (PESTRONK /2008/ nyomán).

A C és D típusú toxinok molekulái a neurotoxin és egy nem toxikus, nem hemagglutináló, vagy egy nem toxikus, hemagglutináló komponensbıl állnak.

Disszociációjukat lúgos közegben (pH=8-nál) figyelték meg.

A nem toxikus, hemagglutináló komponens egy nem toxikus, nem hemagglutináló komponensbıl és a hemagglutinációs aktivitást biztosító alkomponens(ek)bıl tevıdik össze. A C és D típusú toxinok, illetve a nem toxikus rész termelése bakteriofágok által irányított /OGUMA és mtsai., 1980/ (bıvebben lásd késıbb).

Annak ellenére, hogy több szerzı szerint a Clostridium botulinum C és D típusai csak állatokat betegítenek meg /ROCKE, 1983; SALYERS – WHITT, 1994/, beszámoltak néhány olyan humán esetrıl, melyet a C típus okozott. Kettı az 1960-as években, a Szovjetunióban; egy Franciaországban, egy pedig az Egyesült Államokban történt

(25)

/JENSEN – PRICE, 1987/, de HOLEMAN /1970/ szerint ezek nem voltak kellıen alátámasztva.

OGUMA és mtsai. /1990/ ezzel szemben C típusú botulizmusról számoltak be egy 171 napos leánycsecsemınél, akit hirtelen légzésbénulással szállítottak kórházba. A beteg székletébıl kitenyésztették a Clostridium botulinum C típusát, s a kísérleti egéroltások is ugyanerre az eredményre vezettek.

MAKSYMOWYCH és SIMPSON /1998/ szerint a megbetegedések az emésztırendszerben található C típusú toxin-receptorok jelenlétéhez köthetık, s a csekély humán esetszám egyik lehetséges magyarázata épp e receptorok hiánya, melynek okán a toxin nem tud a keringésbe transzlokálódni.

2.4.2. A C2 és C3 toxinok

A C2 és C3 a botulinum toxinnal együtt található meg néhány Clostridium botulinum törzsben. Klinikai jelentıségük tisztázatlan. A C2, amely csak sporuláció idején termelıdik (lásd késıbb), s melynek génje a bakteriális kromoszómán helyezkedik el, egy A-B toxin, tehát könnyő lánc-nehéz lánc struktúrájú. Az A részt I-es, a B-t pedig II- es komponensnek is nevezik. A C2 B része (tehát a II-es komponens) kötıdik a különféle sejtekhez, az A rész pedig ADP-ribozilálja az intracelluláris aktint. Ez megzavarja a normális, mikrofilamentumok által biztosított szerkezetet, s a toxin a sejt roncsolódását okozza /SALYERS – WHITT, 1994/.

OHISHI és mtsai. /1980/ számításai szerint az I-es komponens molekulasúlya 55 kDa, a II-es komponensé pedig 105 kDa.

A C2 protoxinként keletkezik, toxicitása tripszinezve több mint 2000-szeresére növelhetı (az alap-toxicitás 1:2,5 arányú I-II keveréknél a legmagasabb: 2,2x104 egér ip. LD50/mg). A tisztított C2 iv. hatásosabb, mint ip. (5,4 ng ill. 49 ng egér LD50) /OHISHI és mtsai., 1980/.

A C2 két komponense külön-külön nem, vagy alig toxikus (még tripszinezést követıen sem), együttmőködve viszont halálosak: tripszinezést követıen a II-es komponens nagyon alacsony toxicitású volt, az I-es pedig nem bizonyult toxikusnak, sem tripszinezés elıtt, sem azután.

A tripszinezett I-es és a nem tripszinezett II-es komponens keveréke nem halálos egerekben, fordítva viszont a tripszinezett C2 toxicitásának 82%-át mérték. A maximális

(26)

aktiválás 1:2 arányú toxin-tripszin keveréknél, 30 perces inkubáció után, pH=8-nál jött létre /OHISHI és mtsai., 1980/.

A C2-nek számos hatása van: amellett, hogy úgy hat, mint egy klasszikus enterotoxin (azaz elısegíti a folyadékok kiszabadulását a bél nyálkahártyáján), ún. vaszkuláris permeabilitási (VP) aktivitással bír, mely az erek áteresztıképességének növekedésével jár. OHISHI és SAKAGUCHI /1982/ kísérletükben 14-féle C és D típusú törzset vizsgáltak. A 14 törzsbıl 10-nek volt VP aktivitása, mely minden esetben semlegesíthetı volt anti-C2 szérummal, illetve az I-es és II-es komponensekre specifikus antiszérumokkal, de anti-C-vel és anti-D-vel nem.

Annak a 4 törzsnek, amelynek nem volt VP aktivitása, tripszinezve sem volt semmilyen hatása (még úgy sem, hogy tripszinezett I-es, illetve II-es komponenst adtak hozzájuk), tehát e törzsek sem I-es, sem II-es komponenst nem termeltek. Ezekbıl az eredményekbıl is világosan kitőnik, hogy a VP aktivitás csak a C2-termelı C és D típusú törzsek jellemzıje.

A C2 talán segít a botulinum toxin szervezetben történı terjedésében azzal, hogy növeli az erek permeabilitását, de önmagában – mivel nem neurotoxin – nem játszik fontos szerepet a botulizmus tüneteinek létrehozásában.

A C3 (25 kDa) jóval kisebb a C2-nél és a botulinum toxinnál. A toxin – mely valójában egy exoenzim – génje a C1 és D típusú toxinokéhoz hasonlóan bakteriofágon kódolt.

/HUNTER – POXTON, 2002/

A C2 A részéhez hasonlóan a C3 is ADP-ribozilációs aktivitással bír. Eddig ismeretlen módon egy 21 kDa molekulasúlyú GTP-kötı fehérjét ribozilál, ahogy azt a gazdasejtek több típusánál is észlelték. A C3 toxikus hatásával megakadályozza néhány GTP-kötı fehérje jelátalakítását és –közvetítését, ezzel befolyásolva az emlısök sejtjeinek metabolizmusát, amelyet épp ezek a fehérjék szabályoznak. A tényt, amely szerint a C3

szervezeten kívülrıl bejuttatva nem toxikus az emlısök sejtjeire, azzal magyarázzák, hogy képtelen e sejtekhez kötıdni, majd beépülni.

A C3 olyan, mint egy toxin A alegysége, mely elvesztette B alegységét. A C3 emlıs sejtekbe történı bejuttatása elektroforetikusan vagy ozmotikus sokk létrehozásával megváltoztatja a sejtszerkezetet, de nem ismert, hogy e változásoknak bármilyen

(27)

patológiai jelentısége lenne. Ezért, ha lehet, a C3 botulizmusban játszott szerepe még kevésbé meghatározható, mint a C2-é /SALYERS – WHITT, 1994/.

Régebben sok zavar támadt a Clostridium botulinum különbözı típusai, különösen a Cαααα, Cββββ és D izolálásával kapcsolatban. A C típust szinte egyszerre különítette el BENGSTON /1922/ a fémzöld döglégy (Lucilia caesar) lárváiból az Egyesült Államokban és SEDDON /1922/ szarvasmarhákból Ausztráliában. Az izolátumok két szubtípust tartalmaztak, melyek Cαααα és Cββββ néven váltak ismertté.

SMITH, L. DS. és SUGIYAMA egy 1988-ban megjelent munkájukban nem javasolják az αααα és ββββ terminológiát, helyette inkább csak C típus-t használnának, s egyben rámutatnak arra, hogy a Cαααα törzsek C1 és C2 toxint is termelnek, melyek közül csak egy (C1) a neurotoxin, a Cββββ törzsek egyedül C2 toxint termelnek, elhagyva a C1-termelést irányító bakteriofágot.

2.4.3. A botulinum toxinnal szembeni természetes immunitás

A fogékony állatokban és az emberben az ellenanyag-válasz elindításához a letális dózisnál nagyobb toxinmennyiség szükséges, ezért a halál a humorális védelem kialakulása elıtt következik be, és a botulizmusból gyógyultak általában nem mutatnak védettséget a toxinnal szemben. Bizonyos dögevı madarak és emlısök azonban képesek ilyen hullákkal táplálkozni szemmel látható megbetegedés nélkül.

OHISHI és mtsai. /1979/ Clostridium botulinum toxinokal szemben természetesen megjelenı ellenanyagokat találtak pulykakeselyőben (Cathartes aura), prérifarkasban (Canis latrans) és rövidcsırő varjúban (Corvus brachyrhynchos) passzív hemagglutinációval, és ezt szérumneutralizációs próbával is megerısítették.

A passzív hemagglutinációval a 20 pulykakeselyőbıl 18 (90%), a 12 rövidcsırő varjú közül 5 (42%) és a 110 prérifarkasból 25 (23%) savója adott pozitív reakciót az egyes botulinum toxin típusokkal. Valamennyi szeropozitív keselyő protektív ellenanyagokkal rendelkezett a C és D típusú toxinokkal szemben, míg az E, A és F típusokkal szemben 33-42%-uk. A B típusú toxin esetében ez az érték csak 22% volt. A prérifarkasok 14- 57%-a rendelkezett szérumneutralizációs ellenanyagokkal az A, C, D, E típusú toxinokkal szemben, de nem voltak antitestjeik a B és F típusokkal szemben.

Bizonyos dögevı állatok tehát ismeretlen természető szerzett immunitás révén védettek.

(28)

ıket, de a védelemnek nem ez lehet az egyedüli mechanizmusa. KALMBACH /1939/

azt találta, hogy a pulykakeselyők nagymértékben rezisztensek parenterálisan adott botulinum toxinokkal szemben. Ezt a megállapítást PATES /1967/ erısítette meg, aki a rezisztenciát nem tudta a vérben levı ellenanyagoknak vagy nem specifikus detoxikáló anyagoknak, esetleg a keringésbıl eltőnt toxin hiányának tulajdonítani. COHEN /1970/

szerint a keselyők A típusú toxinnal szembeni toleranciája a paraszimpatikus idegvégzıdések rezisztenciájával magyarázható.

Nem ismeretes, hogy vajon az antitest-termelés az elfogyasztott preformált toxinra, vagy a keselyők béltraktusában növekvı Clostridium botulinum által termelt toxinra alakul-e ki válaszul. A kísérletben a baktérium kitenyésztésére irányuló vizsgálatok negatív eredménnyel zárultak.

Az antitoxin jelenléte más fajokban aligha magyarázható szerzett rezisztenciával. Az egyik lehetséges feltételezés szerint a szeropozitív madarak és emlısök életük korai szakaszában toxinhatásnak voltak kitéve, amikor a rezisztencia – ismeretlen okból – magas lehetett. SUGIYAMA /1977/ közölte, hogy újszülött egér béltraktusában a Clostridium botulinum könnyen tenyészthetı, de az állaton a toxintermelés ellenére sem fedezhetık fel a botulizmus tünetei. Humán újszülöttekrıl is ismert, hogy tolerálják az intestinalis Clostridium botulinum fertızést, bár közülük néhány klinikai tüneteket mutat /OHISHI és mtsai., 1979/.

2.5. Madár-botulizmus

2.5.1. Történet, elıfordulás

A kacsákat és egyéb vízimadarakat érintı botulizmus évenkénti kitöréseirıl az 1900-as évek elsı felétıl kezdıdıen jelentek meg publikációk, melyek Kanada és az Egyesült Államok nyugati államainak vizes élıhelyein fordultak elı /HOBMAIER, 1932/.

A megbetegedés akkoriban „nyugati kacsa-betegség” néven volt ismert, melyrıl úgy gondolták, hogy nagy koncentrációban jelen levı lúgos sók által kiváltott vegyi toxikózis. A betegség etiológiája csak az elsı leírások után 20 évvel tisztázódott.

Észak-Amerikán kívül a vadmadarakat érintı elsı megbetegedésekrıl 1934-ben Ausztráliából /PULLAR, 1934/, 1957-ben a Szovjetúnióból /KUZNETZOV, 1992/, majd 1963-ban Svédországból /JENSEN – PRICE, 1987/, röviddel késıbb pedig Dániából (1965), Nagy-Britanniából (1969) és Hollandiából (1970) számoltak be.

(29)

Megerısített eseteket jelentettek Dél-Afrikából (1965), Új-Zélandról (1971), Japánból (1973), Argentínából (1979) és Brazíliából is (1981). Mára a C típusú botulizmust a világ legkevesebb 28 országában, az Antarktisz kivételével minden földrészen diagnosztizálták /ROCKE, 2006/. Ezek a kitörések gyakran több százezer, esetenként egy millió madár életét követelték (3. táblázat).

3. táblázat. Az 50000 egyednél nagyobb mértékő elhullással járó, C típusú madár- botulizmus kitörések (ROCKE/2006/ nyomán).

Helyszín Idıpont Becsült elhullás

Utah és Kalifornia, USA 1910 > 1 000 000

Malheur-tó, Oregon, USA 1925 100 000

Nagy Sós-tó, Utah, USA 1929 100 000 - 300 000

Tulare-medence, Kalifornia, USA 1941 250 000

Tule-tó, Kalifornia, USA 1948 65 000 - 150 000

Kalifornia, USA 1969 140 000

Montana, USA 1970 100 000

Nagy Sós-tó, Utah, USA 1980 110 000

Kaszpi-tenger, az egykori Szovjetúnió 1982 1 000 000

Pakowki-tó, Alberta, Kanada 1995 100 000

Whitewater-tó, Manitoba, Kanada 1996 117 000

Old Wives-tó, Saskatchewan, Kanada 1997 1 000 000

Nagy Sós-tó, Utah, USA 1997 514 000

2.5.2. Kóroktan, járványtan

A botulizmus által megbetegített madárfajok száma igen nagy: KALMBACH és GUNDERSON /1934/ 69 fajt sorolnak fel, amelyek 21 rendszertani családba tartoznak, ROCKE /2006/ azonban már 264 fajról és 39 családról tesz említést, melyek közül 22-ben találhatók vízimadarak. Legérzékenyebbek a kacsafélék (Anatidae), az érintett, hazánkban is honos fajok közül a nyílfarkú réce, böjti réce, tıkés réce, kanalas réce említhetı meg, de érzékenyek a sirályok, szárcsák, gulipánok, kormoránok is /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. A londoni, St. James’s Park-beli kitörésben, melynek során több mint 400 madár pusztult el, a megbetegedés legalább 21 fajt, fıleg kacsákat érintett /KEYMER és mtsai., 1972/.

REILLY és BOROFF a témában mérföldkınek számító, 1967-ben lefolytatott kísérleteik során igazolták, hogy a vízimadarak botulizmusának fı kórokozója a C típusú Clostridium botulinum C1 toxin-termelı Cαααα szubtípusa, bár a Michigan-tó partján

(30)

élı vöcskök és sirályok botulizmusáért E típusú kórokozó volt felelıs, pelikánokban pedig D típusú baktérium okozta megbetegedésekrıl számoltak be.

Bár a botulizmus nem fertızı eredető betegség, lefolyása nagyban hasonlít azokéhoz.

Ebben nagy szerepet játszanak az érintett területen található, toxintartalmú madártetemek, illetve azok a megbetegedett, legyengült egyedek, amelyek csipkedésével a még egészséges madarak szintén toxint vehetnek fel (bıvebben lásd a 2.5.7.4. és a 2.5.7.5. fejezetben).

2.5.3. Kórfejlıdés, tünetek

Amint az a 2.4. fejezetben részletesen olvasható, a megbetegedést a szájon át felvett toxin okozza, a neuromuszkuláris szinapszisokban gátolva az acetil-kolin felszabadulását. Ebbıl fakadóan a madár-botulizmus legjellemzıbb tünete a mozgásképtelenség; az állatok szárnya lóg, fejüket jellegzetesen, petyhüdten tartják (limberneck vagy limp neck (puha nyak); 2. kép), erıs könnyezés tapasztalható, a pislogóhártya bénult, rendellenes pupillamozgások figyelhetık meg, a kloáka nyílásából nagy mennyiségő, vízszerő ürülék távozik /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/.

2. kép. Limberneck vagy limp neck – a madár-botulizmus egyik jellegzetes tünete (LEIGHTON /2000/; fotó: WOBESER).

(31)

KURAZONO és mtsai. /1987/ kísérletileg bizonyították, hogy csirkékben és fácánokban az egyes toxintípusok közül kizárólag C2 okoz folyadék-felhalmozódást és nyálkahártya-elhalásokat a bélben, ezzel nagymértékben elısegítve a hasmenés kialakulását.

2.5.4. Kórbonctan, kórjelzés

A madár-botulizmusban elhullott madarak kórboncolása során szerzett hazai és nemzetközi tapasztalatok egybevágnak a tekintetben, hogy a heveny szívgyengeségre utaló nagyvérköri pangáson kívül elváltozást általában nem lehet megállapítani (2.5.8.

fejezet). A parenchymás szervek, valamint a központi idegrendszer kórszövettani vizsgálata szintén negatív eredményre vezet /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/.

A megbetegedés kórjelzésének jelenlegi egyetlen elfogadott módszere a toxinkimutatás, amelyet egyéb, molekuláris biológiai illetve immunológiai alapú vizsgálatokkal lehet kiegészíteni (2.6. fejezet).

2.5.5. Gyógykezelés, megelızés

A megbetegedett madarak kezelésében az elveszített folyadék pótlása kulcsfontosságú.

Az állatok ugyanis részben az izombénulásból fakadó nyelési nehézség, részben a hasmenés folytán igen gyorsan kiszáradnak. Ebbıl következıen vérük koncentráltabbá válik, ez pedig szívbénuláshoz, s a madarak elhullásához vezet /BARTHA – SZTOJKOV, 1978/. A hazai tapasztalatok alapján, a kondíció javítására, az ivóvízzel mindenképp érdemes fehérjekoncentrátumot adni, amelyet késıbb már darabos táplálékkal is ki lehet váltani (2.5.8.1. fejezet).

Tenyésztett állományokban, megelızés céljából hazánkban is használják az eredetileg nyércek immunizálására kifejlesztett, C illetve D típusú toxoidot tartalmazó vakcinát (Botumink®, USA). Ennek alkalmazásakor azonban figyelembe kell venni, hogy az állatokat két ízben kell beoltani a szükséges védettség kialakulásához. Könnyen belátható, hogy a gyakran hatalmas, nyílt területeken, nagy számban élı vadmadarak ily módon történı védelme – a finanszírozás nehézségei mellett – gyakorlatilag is kivitelezhetetlen.

(32)

2.5.6. Humán kórtani jelentıség

Amint az a 2.4.1. fejezetben már említésre került, a C típusú botulizmus humán kórtani jelentısége – ellentétben más (A, B, E, F) toxintípusokéval – igen csekély. Ezt a kijelentést az a tény is bizonyítja, hogy napjainkig mindössze egyetlen, toxinkimutatással is megerısített eset került publikálásra /OGUMA és mtsai., 1990/, amelyben a C típus szerepe volt igazolható.

2.5.7. Környezeti faktorok szerepe a madár-botulizmus megbetegedésekben

Ahhoz, hogy egy adott élıhelyen madár-botulizmus kitörések forduljanak elı, számos elıfeltételnek kell teljesülnie. Az ebben a témakörben végzett vizsgálatok jó néhány ilyen faktor szerepét erısítették meg, vagy vetették el. A jelenleg ismert elképzelések három fı elméletre vezethetık vissza:

1) az ún. „iszapágy-elmélet” szerint a nyári, csapadékszegény idıszakban a tavak vízszintje lecsökken, így a víz könnyebben átmelegszik. A felmelegedı, oxigénszegény víz és a bomló vízi növényzetbıl származó szerves anyag kedvezı feltételeket teremt a spórák kicsírázásához és a vegetatív alakok toxintermeléséhez, mely tömeges vízimadár-pusztulásokhoz vezet /HAAGSMA és mtsai., 1972/;

2) tavaszi áradások alkalmával az elárasztott terület víz alá került növényzete, ezek és az elpusztult állatok bomlásából következı anaerob körülmények, illetve az iszapban vagy a kérdéses területen elıforduló spórák jelentik a kitörések forrását, a „spóra-hordozóként” szereplı talajlakó, vagy talajjal táplálkozó élılények mellett /„mikrokörnyezet-elmélet”; BELL és mtsai., 1955/;

3) a talajból felvett spóra a madarak bélcsatornájába kerül, s azok bármilyen okból történı pusztulását követıen kicsírázik, a dögökben, mint fertızési forrásokban nagy mennyiségő toxint termelve. Ebben az esetben – ellentétben az elızı kettıvel – a spóráknak nem kell jelen lenniük a helyszínen, hiszen azokat a madarak testükben vagy ürülékükkel „szállítják” a kitörés helyszínére. Részben ezzel magyarázható madár-botulizmus fellépése olyan területeken is, ahol korábban efféle megbetegedésekre nem volt példa /”madártetem-elmélet”;

ROSEN, 1971; SMITH és mtsai., 1975/.

(33)

Jól látható, hogy az elméletek a környezeti igények tekintetében nem különböznek – ez érthetı is, hiszen a kórokozó fejlıdése (és ezzel együtt toxintemelése) elengedhetetlen a megbetegedések létrejötte szempontjából. A kitörések kialakulásában valószínősíthetıen szerepet játszó egyéb faktorokról a 3. ábra tájékoztat.

3. ábra. A madár-botulizmus kitörések kialakulására ható biotikus és abiotikus környezeti tényezık (WESTPHAL /1991/ nyomán, módosítva).

Ábra

2. ábra. A botulinum toxin szerkezete (PESTRONK /2008/ nyomán).
3. kép. A típusú Clostridium botulinum sejt hosszmetszete, a benne fejlıdı spórával.
4. kép. A Clostridium  botulinum C és D típusának fágjai: 1) 3C tox+ , 2) 4C tox+ , 3) 1D tox+ ,  4)  2D tox+
5. kép. Madár-botulizmusban elpusztult kacsa tetemén kifejlıdött légyálcák tömege – a  megbetegedés újabb forrásai (LEIGHTON /2000/; fotó: BOLLINGER)
+7

Hivatkozások

KAPCSOLÓDÓ DOKUMENTUMOK

In the present study, to gain insight into the cellular basis of differential behavioral responses, we used a P2rx72/2 mouse model to demonstrate that (1) the genetic deletion of

To demonstrate if the selected spiegelmers are functional and suitable for cTnI detection in a sandwich type arrangement, AlphaLisa technology was leveraged and the obtained

As shown in Fig 4a, anti-C7 antibodies triggered dramatic influx of neutrophils to the ear of wild-type bone marrow chimeras, which appears to be a peculiarity of this mouse model

In order to select the most suitable number and combination of spectral bands to be used in the GPR model for estimating Chl-a content of Lake Balaton, we applied the recently

Types C and B developed in con fi ned fl oodplain areas: type B fl uvial levees began to evolve during the arti fi cial levee constructions on the embanked fl oodplain, while type

Finally, observe that the approach used to prove our main result as well as the weak mechanism can be extended for KdV-type equation and for a model of strong interaction

In summary, the use of dairy bull with higher dairy type could lead to positive effect on offspring dairy type and overall classification, although it has a pronounced negative

Based on the conducted research it could be concluded that all effects included in used statistical model (time-independent fixed effect of time from 1st calving to the culling or