Centrális dogma és a bioinformatika főbb területei a molekuláris biológiában

1

transzkriptomika

proteomika

biokémiai aktivitás

metabolikus útvonalak

Centrális dogma és a bioinformatika főbb területei a molekuláris biológiában

degradáció

DNS Gén

transzkripció, RNS szerkesztés RNS

degradáció

fehérje

transzláció, poszttranszlációs módosítás

metabolomika

2

A BIOLÓGIAI INFORMÁCIÓ HORDOZÓ MEGFEJTÉSE

GENOMIKA

A teljes genetikai állomány szekvenciájának meghatározása, A szekvenciákon elhelyezkedő funkcionális régiók számítógépes

jóslása: annotálás

3

Funkcionális genomika RNS szinten

TRANSZKIPTOMIKA

Egy DNS chip kísérlet folyamatábrája

5

A chipek kiértékelése, eredménye

6

Funkcionális genomika fehérje szinten

PROTEOMIKA

Proteomika

EgyTipikus protokol

Minta elő

Izoelektromos fókuszálás

SDS PAGE

Láthatóvá tétel

Kép analízis Protein pötty

kivágás tömegspektrometria

Protein azonosítás

8

9

Proteomika: az elválasztástól az azonosításig

Oligonukleotid szintézis

Mintegy 50 éves múlt

5 különböző kémia: foszfáttriészter, fosztittriészter, foszfátdiészter Foszforamidit, H-foszfonát

Szilárd fázisú szintézis:

hordozó: controlled pore glass (CPG), vagy polisztirol Mind DNS mind RNS szintetizálható

mind a két módszerrel

Oligonukleotid szintézis: monomerek

2% DCA/DCM

di-MeO Tr

I2 / H2O

N

tetrazol

< 1 % Ac2O

> 99 % újabb ciklus

hordozó

di-MeO Tr O

O O O

B2

O O

O P O

O O

hordozó B1

NC

di-MeO Tr O

O O O

B2

O O

O P O

O

B1

NC

O O

O AcO

hordozó B1

di-MeO Tr O

O O O

hordozó B1

O O

O O

H

hordozó

B1

di-MeO Tr O

O O O

NC P

O N

B2

Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer

O O

O O

H

hordozó B1

Néhány automata szintetizátor

OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE I.

- Deblokkolás: védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás

- liofilezés, sómentesítés

A lúg hatására lehasad:

- védőcsoportok a bázisokról

-  -cianoetil csoport a fosztátról

- oligo a hordozóról

- méret szerinti elválasztás, PAGE, vagy HPLC (sokszor nem szükséges)

OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE II.

Ioncserés kromatográfia Hidrofób kromatográfia a DMT csoporton keresztül - kvantitálás bázis (µmol * cm/cm³)

dA 15.4

dG 11.7

dC 7.5

dT 8.8

átlagosan



OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK

- primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele

- adapterek: különböző (nem-kompatibilis)

ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika

- antiszensz oligonukleotidok, génterápia   - gén darabok

  - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.

Linkerek

rövid, önkomplemeter oligonukleotidok, amelyek saját magukhoz hibridizálva olyan tompa végű, kettősszálú DNS-t képeznek, amely tartalmazza egy

tetszőleges restrikciós endukleáz felismerő helyét:

Restrikciós hely bevitelére alkalmas

BamHI...CGGATCCG EcoRI...GGAATTCC PstI...GCTGCAGC

ADAPTEREK

szintetikus kettősszálú oligonukleotidok, amelyek végei kompatibilisek

különböző restrikciós endukleázokkal végzett emésztések során képződő végekkel.

Esetenként valamilyen restrikciós endonukleáz felismerőhelyét tartalmazhatja.

EcoRI – SmaI...5'AATTCCCGGG 3‘

3’GGGCCC 5’

EcoRI

SmaI

Rövid adapterek:

egyik vég ragadós, a másik tompa.

Hosszú adapterek:

két ragadós vég között egy

harmadik restrikiós endonukleáz felismerõhelye

5' GATCCGGGCCCTGTTAGAGCT 3' 3' GCCCGGGACAATC 5'

pl. BamHI (ApaI) SacI

Primerek

szintetikus oligodeoxinukleotidok, amelyek iniciációs pontjaiként szolgálnak a templát függő DNS polimerázok számára.

Univerzális primerek: a gyakorlatban elterjedt vektorok klónozó helyének környékére tervezett primerek.

Specifikus primerek: az adott feladatnak megfelelően szintetizált speciális szekvenciájú oligonukleotidok.

Polimeráz láncreakció I.

Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb.

Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló

Polimeráz láncreakció II.

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ MÓDOZATAI

- belső PCR, specificitás növelése belső primerek használatával egy elsődleges PCR terméken

  - egy specifikus primert használó PCR + primer adapter limitált információ esetén

- LM PCR, ligálás közvetített PCR,

kromoszóma metiláltsági térképezésére - inverz PCR, szegélyező szekvenciák izolálására   - “farkazott PCR” ld. cDNS izolálás

  - RT PCR, reverz transzkripció kapcsolt PCR, ld. cDNS

  - kvantitatív PCR, mRNS mennyiségének becslésére

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI

 klónozás, megfelelő DNS szakaszok kinyerése, esetenként degenerált primerekkel

 DNS szekvenálás, pl. ThermoSequenase

 mutagenezis

 szálspecifikus próbák előállítása

 diagnosztika

 fertőzések kimutatására

 mutáns allélek kimutása

BELSŐ (NESTED) PCR

1. PCR

2. PCR

2 primer párt használunk

 nagyobb specificitás, a nemspecifikus termékek eltűnése

 költségesebb

INVERZ PCR

A géneket környező régiók kiamplifikálkására

Általában a gén szekvenciája részben vagy teljesen ismert  primer pár tervezhető

A A

hasítás 'A' restrikciós enzimmel

A A

önligálás

A

PCR

'A'

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT PCR (RT-PCR)

mRNS

antiszensz primer

reverz transzkripció reverz transzkriptázzal AMV: avian mieloblastosis virus RT

MMLV: Moloney murine leukémia vírus RT Tth: Thermus thermophilus, Mn²⁺ jelenlétében cDNS

szensz primer

PCR

250 500 1000750

RT+ RT- gK

bp

Gének szerveződésének

vizsgálatára

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT KVANTITATÍV PCR

Az RNS preparátumnak DNS mentesnek kell lennie

exponenciális rész lineráris szakasz

plató

ciklus szám termék

Hagyományos PCR-rel igen nehéz a termék mennyiségének a meghatározása

T

50°C 95°C

72°C

Denaturálás Hibiridizáció DNA szintézis

Real-time PCR

Denaturálás

: SYBRGreenI : fluorescens SYBRGreenI

Real-time PCR reakció analízise

280ng 28ng 2.8ng 0.28ng 0.028ng gDNA:

Kalibráció ismert mennyiségű genomiális DNS-sel

reprodukálhatóság ismeretlen mennyiségű templát cDNA-sel.

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ

FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: klónozás

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ

FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: mutagenezis

random: a Taq polimeráz átírási hűsége rosszabb, hibák épülnek be és amplifikálódnak

1-2 hiba 1 kb hosszon

Mn

vagy nukleotid analógok (inozin) növelik a mutációs rátát in vitro evolúció

irányított:

XhoI

XhoI M_r

M_f O1

O2

O1-M_r 1^st PCR-s M_f –O2

BamHI

BamHI CO2 O1

XhoI

BamHI 2^nd PCR O1 – O2

digest with XhoI and BamHI

ligate into XhoI – BamHI digested vector

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I.

- FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA

minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav,

ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket 

speciálisan tervezett primerek segítségével PCR

a termék megjelenése fertőzésre utal

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II.

MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA

normálisA C gén

mutáns

5' 3'

A 5 C

' 3'

A

5' 3'

PCR

egészséges

nincs termék beteg

A 5 C

' 3'

5 C

' 3'

PCR

egészséges nincs termék beteg

Ligálás és a PCR kombinálása

GÉNSZINTÉZIS STRATÉGIÁK

1. Szintetikus DNS fragmentek összeállítása átfedő oligomerekből

1. fragment 2. fragment

3. fragment 1+2. fragment

1+2. fragment

1+2+3. fragment

hátrány: drága,

mind a két szálat meg kell szintetizálni

2. Fragment összeállítás primer-templát módszerrel

5’ 5’

5’

5’

3’ 3’

3’

3’

Klenow, dNTP

Több verzió is erre az enzimatikus feltöltési elvre alapszik.

2.a. Hajtű módszer

Klenow, dNTP

emésztés restrikciós endonuklázokkal

ligálás

5’ 3’

hasított vektor

polimerizáció Klenow, dNTP

ligálás

transzformálás

hibridizálás, enzimatikus feltöltés

5’ 5’

5’

3’3’ 3’

átfedő szintetikus oligonukleotidok

hasított vektor

5’

5’

3’

3’

közvetlen transzformálás

Híd ligálás

2. c. Fragment összeállítás a javító mechanizmus

(gap repair) kihasználásával

sejtmembrán

fehérjék mRNS

sejtmag

Kromoszómális DNS oligonukleotid

citolplazma

Cél molekula:

fehérje mRNS DNS

oligonukleotid

iránya a leolvasással megegyezõ v.

kettõsszálú

a leolvasással

ellentétes a leolvasással megegyezõ  

  RNS DNS

    duplex

triplex köcsönhatás fehérje-DNS RNS-DNS

hibrid/ RNáz H

Hoogsteen féle triplex Gátlás transzkripciós

szabályozás transzláció transzkripció

Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal

Triplex képződésének kölcsönhatásai

homopurin homopirimidin szekvenciáknál

Antiszensz oligonukleotidok lehetséges célszekvenciái a mRNS-en

1) exon-intron határhoz, slicing gátlás 2) Az 5’ sapka régióhoz

3) Transzlációs iniciációs régióhoz 4) Génen belüli régióhoz

Kapcsolódó oligonukleotidok

Elsődleges hatásmechanizmus:

Az endogén RNázH leemészti a DNS:RNS hibrid RNS szálát

2% DCA/DCM

di-MeO Tr

I2 / CS²

N

tetrazol

< 1 % Ac2O

> 99 % újabb ciklus

hordozó

di-MeO Tr O

O O O

B2

O O

O P O

O S

hordozó B1

NC

di-MeO Tr O

O O O

B2

O O

O P O

O

B1

NC

O O

O AcO

hordozó B1

di-MeO Tr O

O O O

hordozó B1

O O

O O

H

hordozó

B1

di-MeO Tr O

O O O

NC P

O N

B2

Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer

O O

O O

H

hordozó B1

PEPTID NUKLEINSAVAK (PNA)

Nincs cukorfoszfát gerinc, ehelyett peptid kötéssel összekapcsolt lánc van Specifikus

Stabil

PNA T10-Lys TTTTTTTTTT-Lys

PNA SV40-Lys ATTTTCTTCATTTTTTCTTC-Lys Ma már külön könyv van a PNA- alkalmazásairól

MUTAGENEZIS

- in vivo gének elrontására,vagy módosítására

Random mutagenezis

  találomra létrehozott mutációk

 mutagén anyagok:

UV, kemikáliák, radioaktív sugárzás

 PCR: a hőstabil polimerázok átírási hűsége rosszabb

 mutagén törzsek

 transzpozon mutagenezis  

Irányított mutagenezis Adott helyen

- deléciók inszerciók léterhozása - pont mutációk létrehozása

Ar1

Ar2 ori

Ar2 Ar1

Ar2

oriV

Gének irányított szétroncsolása: interpozon mutagenezis

poláris hatás

vad típus mutáns

oriT

oriT

oriV: szűk gazdaspecificitás

Ar: antibiotikum rezisztencia

ori Ar1

Ar1 oriV

vad típus mutáns poláris hatás ?

Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélül

oriV: szűk gazdaspecificitás

oriT

oriT

Ar: antibiotikum rezisztencia

QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)

FEHÉRJE TERMELTETÉS

Legyen az

prokarióta vagy eukarióta

természetes vagy szintetikus

vad típusú vagy mutáns

VAN GÉNÜNK:

FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK

PROKARIÓTÁK

E. coli  ismert,

Bármilyen fehérje, feltéve, ha - nem túl nagy

- nem túl kicsi - nem túl hidrofób

- nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális

Bacillus subtilis

 jól ismert, ha nem is annyira, mint az E. coli

van szekréciós rendszere

EUKARIÓTÁK

élesztő

 gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal,

sok ismeretanyag

viszonylag könnyű kezelhetőség

poszttranszlációs modifikációk lehetősége

emlős sejtvonalak

  minden fajta fehérje termeltethető bennük

 tranziens expressziós rendszerek viszonylag gyors, de korlátozott lehetőségek,

 stabil expressziós rendszerek

 hosszú, fáradságos optimalizálást igényel

Escherichia coli

HÁTRÁNYOK ^

 általában nem szekretál

 a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid hidak kialakulása gátolt

 az eukarióta poszttranszlációs módosítások általában nem megvalósíthatóak

 nem alakul ki a megfelelő aktiv szerkezet, rossz folding ELŐNYÖK ^

 óriási mennyiségű ismeretanyag

 könnyű kezelhetőség, gyors növekedési sebesség, viszonylag olcsó médium

 nagy mennyiségű biomassza gazdaságos előállítása

 ismert szelekciós rendszerek

 legtöbb expressziós rendszer

STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE

 a fehérje a teljes növekedési fázis alatt expresszálódik

 nagy sejttömeg elérése után a fehérje visszanyerése

 nem igazán használatos, toxicitási problémák miatt KONSTITUTÍV PROMÓTER

 a promoter represszált állapotban van a növekedés egy bizonyos fázisáig

 valamilyen indukcióval derepresszió

 további növesztés

 fehérje visszanyerése

 legáltalánosabban használt stratégia

 toxicitás sok esetben megoldható

INDUKÁLT TERMELTETÉS

PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI

TT

-35 -10

SZF

-35 -10 SD kódoló szekvencia

Pr

TSZE

TTGACAN₁₇TATAAT

5’ UAAGGAGGN_(3-11) START kodon AUG

GUG UUG

STOP kodon UAAU UGA UAG

AR ORI

GS 

Pr: promóter

TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,,

TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia,

AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo

GS: gazdasejt

FEHÉRJE RNS

transzláció transzkripció

DNS

transzkripciós

szinten poszt-transzkripciós

szinten

(mRNS degradáció, protein stabilitás, stb.)

A génexpresszió szabályozása

Különböző faktorok relatív hatása a fehérje termeltetésre E. coli -ban

 Promóter indukálhatóság kb. 1000 x

 Gazdasejt kb. 1000 x

 A mRNS 5’ struktúrája kb. 100 x

 Transzláció kb. 100 x

 növekedési sebesség kb. 50 x

(mRNS stabilitás)

TRANSZKRIPCIÓ

 Iniciáció

fehérje termeltetés során a legfontosabb

 Elongáció

mivel a gén belsejében van, nem manipulálható

 Termináció

a transzkripció befejezése,

a transzkripciós apparátus

túlterhelésének elkerülésére

A transzkripció iniciációja prokariótákban

5’

3’ 5’

3’

promóter

5’

5’

3’

3’

5’

3’

sigma faktor

RNS polimeráz

holoenzim

k₁ k_-1

k₂ k_-2

5’

3’

Ha k₁ >> k_-1, akkor a polimeráz

holoenzim nagyon erősen kötődik a promóter szekvenciához,

a polimeráz nehezen tudja

elindítani a polimerizációs reakciót.

Tehát a transzkript mennyisége csökken, habár in vitro a promóter

és a holoenzim közötti kapcsolat erős.



NTD

/`

 CTD

 CTD

RNS polimeráz alegységek RNS polimeráz alegységek: :

  , ,   `, `, ,  , ,  ,  



promoter szekvencia: -10 and -35 régiók

Bakteriális  faktorok

konszenzus szekvencia

Típus NÉV

-35 távolság -10

elsődleges  faktorok ⁷⁰, RpoD, SigA TTGACA 16 - 18 TATAAT Nem esszenciális 

faktorok ³⁸, RpoS, CTATACT

Alternatív  faktorok

Flagella  faktorok ²⁸, FliA, SigD TAAA 15 GCCGATAA

ECF  faktorok ^E, SigE GAACTT 16 - 17 TCTRA

hősokk  faktorok ³², RpoH CTTGAAA 11 - 16 CCCATNT

^B, SigB GTTTAAA 12 - 14 RGAAT

sporulációs 

faktorok ^H, SphOH AGGAWWT 12 - 14 RGAAT

^F, SpoIIAC WGCATA 14 - 15 GGNRAYAMTW

^E, SpoIIGB GKCATATT 13 - 15 CATACAMT

^G, SpoIIIG TGAATA 17 - 18 CATACTA

⁵⁴ család -24 -12

^N, RpoN, SigL TGGCAC 5 TTGCW

Különböző gének expresszióját különböző szigma faktorok befolyásolják

gén expresszió változás



Morfológiai & fiziológiás változások

 

Adaptáció / Védekezés

tápelvonás, Stressz,

Vasra éheztetés, sejtsűrűség, Felületi adházió

Transzkripciós faktorok

(Szigma)

Két  faktor felépítése

A génexpresszió tanulmányozása különböző módszerekkel különböző szinteken

fehérje érése

transzláció transzkripció

Enzim aktivitás

mérés

detektálásamRNS

Riportergén riporter fehérje

aktivitás  promóter aktivitás

Western blot fehérje detektálása

A vizsgált operon promóter

ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) I.

 más néven gél retardációs assay

 a DNS-t, amely feltételezhetően fehérjét köt, megjelöljük

 jelölés lehet végen, szálon belül, egyszálon, kétszálon, kötési kísérletben a DNS kétszálú!

 a DNS ne legyen től hosszú 20-200 bp, minél hosszabb a DNS, annál több nem specifikus reackió történik

 lehet tiszta fehérje vagy fehérje populáció DNS

jelölés

DNS kötő fehérje

összekeverés

nem kötődik kötődik

Natív poliakrilamid gél

-: fehérje nélkül, +: fehérjével összekeverve

nem kötődik - +

kötődik - +

nem specifikusan kötődik - +

- +

ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) II.

 a mobilitás eltolódás inkább a komplex méretét jellemzi, a kölcsönhatás errősségét nem

 a kölcsönhatás erősségét a nem kötöt DNS, és a kötésben levő DNS jelének intenzitása jellemzi minél kevesebb fehérje okoz erős jelet az eltolódott sávban annál erősebb a kölcsönhatás

titrálás fehérje mennyiségre

hozzáadott fehérje mennyiség nő 

SUPERSHIFT ASSAY

- ha van tippünk, hogy milyen fehérje kötődik - és van rá specifikus ellenanyagunk

nem kötődik kötődik ellenanyag is kötődik

- + ++

-: fehérje nélkül, +: csak fehérje hozzáadása, ++: fehérje és ellenanyag hozzáadása

a DNS - fehérje kölcsönhatás erősségéről ad felvilágosítást,

nem a képződött mRNS mennyiségéről

DNázI FOOT PRINT I.

DNS hossz 100 – 200 bp

DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan mind a két jelölt szállal meg kell csinálni

a kötési kísérletben a DNS kétszálú

DNázI

G A+G C+T C D

denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis

Maxam-Gilbert

létra DNázI hasítás

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

* *

* * * * * * * * * * * * * * * * * *

* *

DNázI FOOT PRINT II.

DNázI

G A+G C+T C D- D+

Maxam-Gilbert létra

DNázI hasítás -: fehérje nélkül

+: fehérje jelenlétében

hiperszenzitív hely (HSH)

HSH

* * * * * * * *

* * * * * * * *

* * * * * * * *

* * * * * * * *

UV KERESZTKÖTÉS (CROSS LINKING)

Ismeretlen DNS kötő fehérjék molekulatömegének becslésére 1. A DNS szálat szálon belül jelöljük, és Br-dUMP-t építünk be (a Br-dUMP nem zavarja a kötődést)

: Br

MS?

EMSA UV fény



kivágás, izolálás





a fehérje DNS komplex kötés kovalens lesz

jelölt fehérje

SDS-PAGE

minta marker

- Northern-blot és hibridizáció

- reverz-transzkripció kapcsolt kvantitatív PCR

- korrekt, de belső összehasonlító standardokat igényel  

A mRNS mennyiségének meghatározása

In vitro transzkripció

Regulátor G mentes kazetta régió (3-400 bp)

transzkripcionálisan aktív sejt vagy sejtmagi extraktum

+ ATP, CTP, ³²P-UTP,

a képződött radioaktív RNS analizise denaturáló PAGE-n.

csak a fenti 3-400 bp-os fragmentum fog látszani, a többi tartalmaz G-t  ezek transzkirpciója leáll

mennyiségi becslés: denzitometriásan, vagy PhosphorImager-rel

Promóter

elsősorban transz szabályozó elemek hatásának vizsgálatára alkalmas

Regulátor

régió riporter gén (pl. lacZ) Promóter

Riporter gének alkalmazása

-galaktozidáz (LacZ) SEJT

 -galaktozidáz aktivitás mérés

feltételezi, hogy nincs poszt-transzkripciós szabályozás, és az enzim specifikus aktivitása is minden mintára egyforma aktivitás mérés kiküszöbölése

GFP: Green Fluorescent Protein, gerjesztve floureszkál

a kapott aktivitást illetve szignált normálni kell a sejt vagy protein mennyiségére

Gének koordinált regulációjának két fő mechanizmusa baktériumokban

A) operon: gének egy lókuszban, közös transzkript, közös regulátor policisztronos elrendezés

B) regulon: gének szétszórva a genomban, közös regulátor operon

regulon

A TRANSZKRIPCIÓS SZABÁLYOZÁS FŐBB GLOBÁLIS STRATÉGIÁI PROKARIÓTÁKBAN

inaktív aktivátor

inaktív

aktív aktivátor indukálószer

indukálószer represszor

inaktív represszor

derepresszált

KATABOLIKUS

derepresszált

aktív represszor indukálószer

represszált

BIOSZINTETIKUS

KATABOLIKUS

BIOSZINTETIKUS

indukált aktív aktivátor

inaktív inaktív aktivátor indukálószer

RNS polimeráz RNS polimeráz

inaktív represszor

RNS polimeráz RNS polimeráz

represszált

negatív szabályozás pozitív szabályozás

indukciórepresszió

A transzkripciós faktorok és aDNS közötti specifikus kölcsönhatás

csgD: NNEIARSLFISENTVKTH LY merR: IGEVALLCDINPVTLRAWQR

Hélix-turn-hélix (HTH) Motívumok:

luxR: SWDISKILGCSERTVTFHLT

lehet a faktor N vagy C terminálisán,

a másik végen szokott lenni a ligand, kofaktor kötő régió

BAKTERIÁLIS TRANSZKRIPCIÓS FAKTOROK FŐBB CSALÁDJAI

AraC család AraC, MelR, RhaS, RhaR, SoxS

LysR család LysR, OxyR, MetR, CysB

Crp család Crp, Fnr

MerR család SoxR

Két komponensű NarL, OmpR, Arc szabályozó család

Lac represszor család LacI, GalR

MetJ család MetJ

Faktor család Tagok

Aktiváció a gén expresszióban I.

Aktiváció a gén expresszióban I.

Kölcsönhatás:

- CTD-nel (CRP)

- ⁷⁰ 4-es régiójával ( cI aktivátor) - NTD-nel (CRP)

-  alegységgel (DnaA) - ’ alegységgel

(N4 single-stranded DNA kötő fehérje) - CTD-nel és ⁷⁰ 4-es régiójával (FNR)

Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW Busby

Current Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.

Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW Busby

Current Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.

Aktiváció a gén expresszióban II.

Aktiváció a gén expresszióban II.

Promóter konformáció megváltoztatása:

- “-35” és “-10” régió azonos oldalra kerül (MerR, SoxR)

- DNS visszahajlik és az aktiváló cis szekvencia RNAP fölé kerül

- DNS konformáció változást indukál

(FIS, IHF)

DNS-hajlító fehérje (pl. IHF)

Specifius kötőhely

Távoli aktivátor helyek segítséget igényelnek

Transzkripció repressziója baktériumokban

FNR FNR

- fumarát nitrát reduktáz regulátor - citoplazmatikus szenzor-regulátor - dimer[4Fe-4S]

 DNS-t köt

- monomer[2Fe-2S]

 inaktív

- aenaerob respirációra (+) vagy (-) hatás - pO

1 mbar alatt

- TTGAT-N

-ATCAA konszenzus szekvencia - [2Fe-2S]

 [4Fe-4S]

(in vitro)

Cys, Fe, DTT, NifS

- Pseudomonas: ANR; Bacillus: FNR Rhodobacter sphaeroides: FnrL

O ₂

FNR

FNR

Komponensek

- egy szenzor kináz és egy DNS kötő regulátor - E. coli genom 2%

- kb 50 különböző 2 komponensű rendszer - 3 alcsalád: OmpR, FixJ és NtrC

Két komponensű szabályozó rendszerek

P

szenzor kináz fehérje

DNS kötő fehérje

P

Érzékelő Foszforilációs

Érzékelő Foszforilációs Érzékelő Foszforilációs

Felvevő DNS kötő

Felvevő DNS kötő

szignál

transzfoszforiláció

DNS DNS

A bakteriális kétkomponensű szabályozó rendszerek

működése elve

ArcA/B ArcA/B

- aerobic respiratory control

- ArcB (szenzor kináz): sejt redox és metabolikus helyzet (elektron transzport változást érzékel)

- ArcA(citoplazmatikus regulátor): ArcB foszforilálja  aktív - pO

1-5 mbar között

- TATTTaa konszenzus szekvencia

- Haemophilus: ArcA

- E. coli homológ gén: OmpR

O ₂

P

ArcB

ArcAP

ArcA

NarX/L és NarP/Q NarX/L és NarP/Q

- nitrát regulator

- NarX és NarQ: membrán szenzor kináz - NarL és NarP: citoplazmatikus regulátor - szignál: nitrát és nitrit

- nitrát metabolizmusra hat

- NarL és NarP különböző génekre különböző atás  a génexpresszió finom hangolása

NO ₃

NarPP NarX

NarQ

NarLP

P

Kétkomponensű rendszerek

vége

A lac operon kettős szabályozása

 laktóz (allolaktóz) indukál

 glükóz gátol, cAMP/CAP-n keresztül

 glükóz/egyéb cukor

kiiktatása tápból nem célszerű

  glükóz szabályozás

kikapcsolása

trp

AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCA tac

AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA lacUV5

CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGA lac

CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGGTGTGTGGA

“-35” “-10”

lac ^(és trp ) alapú promóterek

lacUV5  lac promóter UV

erősség

A transzkripciós faktorok sokoldalúak….

Ara C

-Ara P

represszió +Ara P

indukció

RNS polimeráz

P_BAD

AraC

AraC

P_BAD

a) hurok képződés indul

b) hurok képződés indul hibrid destabilizálódik

c) termináció

a) Rho kötődik és üldözi a polimerázt

b) hurok képződés, polimeráz megáll

c) Rho helikáz felszabadítja a transzkriptet, termináció

Transzkripció termináció baktériumokban

Rho független Rho függő

A transzkripció és a transzláció párhuzamosan

megy baktériumokban

protein antranilát szintáz indol-glicerin szintáz triptofán szintáz

A triptofán operon szerkezete

A triptofán operon szabályozása

Attenuáció-termináció – trp operon

E. coli -ban fehérje túltermeltetésre használt promóterek

mRNS degradáció baktériumokban

mRNS stabilitás

prokariótákban néhány perc, eukariótákban órás nagyságrend   előbb utóbb minden RNS lebomlik

  mRNS stabilitását meghatározó faktorok:

- belső, saját szerkezet

- a környezet hatására bekövetkezett változás a degradációs apparátusban

puf operon (a fotoszintetikus komplex komponensei)

Rhodobacter capsulatus degradációja O

hatására felgyorsul

policisztronos rendszerek esetén az alegységek arányának szabályozása

a mRNS régióinak eltérő stabilitásával

A R. capsulatus puf mRNS régióinak stabilitása

 - transzkripció gátlása (pl. rifampicin) t=0 időpontban,

majd  időközönként mintavétel és RNS analízis (Northern..) - a degradációs mechanizmusban szerepet játszó gének deléciója,

hőmérséklet érzékeny expressziós változatának kialakítása - in vitro transzkripció jelölt nukleotidokkal,

a kapott termék inkubációja a sejtextraktummal különböző ideig, majd analízis gélelektroforézissel,

kvantitálás

mRNS degradáció baktériumokban,

vizsgálati módszerek

mRNS-t stabilizáló-destabilizáló tényezők

Az 5’ végi struktúra stabilizáló hatása

 a stabillizálódás a mRNS hurok struktúrájában van

 nem csak a riboszóma véd,

 a stabilizáló effektus átvihető más génekre

mRNS-eket stabilizáló (védő) tényezők

1. 5’ végi trifoszfát 2. RNS struktúra 3. riboszóma

A degradoszóma felépítése

Az RNaseE elsődleges felépítése

Érdekes módon sok bakteriális genomban nincs meg

A degradoszóma komponensei I.

Endoribonuclease E (RNáz E)

 1061 aminosav  118 kDa fehérje, virtuálisan 180 kDa (oka prolin gazdag régió)

 felismerő hely:

(A/G)AUU(A/T)

vagy egy komplex másodlagos struktúra

 5' monofoszfátot preferál 5' trifoszfát stabilizál

N-terminális régió (50 kDa): endoribonukleáz funkció

C-terminális: a degradoszóma egyéb komponenseire megfelelő kötő domének

A degradoszóma komponensei II.

PNPase (polynucleotide phosphorylase)

 78 kDa alegységek, homotrimer

 3'  5' foszfát függő processzív exonukleáz,

 ribonukleotid difoszfátok képződnek

 poliadenilációs aktivitás

Polyphosphate Kinase (PPK)

 funkció: ATP regeneráció,

polifoszfát (inhibiálja a degradációt) eltávolítás

 ppk mínusz törzs : megnövekedett mRNS stabilitás

 80 kDa alegységek, homotetramer, sok van E. coli -ban

A degradoszóma komponensei III.

Helikáz

 ATP függő DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) helikáz

 50 kDa RhlB

 a másodlagos struktúrák kinyitása szétroncsolása

ATP hiányában a hurokstruktúra

stabil marad

Egyéb – mRNS degradációjában résztvevő – enzimek

RNáz II

 70 kDa monomer,

 a sejt 3'  5' exoribonukláz aktivitásának 90%-a

 ribonukleotid monofoszfátok képződnek

 a PNPáz-zal együttes deléciója letális !!!

PolyA polimerázok

PAPI 53 kDa

PAPII 35 kDa

poliadeniláció, 15- 50 bázis hosszú

mRNS instabilitás

A mRNS degradáció mechanizmusa

Transzláció prokariótákban

A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek

30S 30S

30S

+ mRNA PK k

k

PK

k

k

IK

IK TK

k

( 30S + IF1, IF2, IF3, fMet-tRNS

)

( preiniciációs komplex)

( iniciációs komplex)

( transzlációs komplex) K

nagy, ha az SD és a rRNS közti kölcsönhatás erős.

k

a SD és a transzlációs start kodon közti távolság,

és a régió másodlagos szerkezetének függvénye.

Shine - Dalgarno szekvencia

GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS 3'végéhez, pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz operon)

10 x növekedés a termék mennyiségében

a SD szekvencia hosszának növelése nem feltétlenül növeli a transzlációt Hasonlóan a promóterekhez, túl erős kötődés a SD szekvencia és a 16S rRNS 3’ vége között a transzlációt gátolhatja.

Transzlációs start kodon

kodon gyakoriság

AUG 91 %

GUG 8 %

UUG 1 %

Az AUG előtti szekvenciák

20x-os különbség

UAU, CUU >> UUC, UCA, AGG ("-1 triplet) G-k kerülendők

Az AUG utáni szekvenciák

30x -oskülönbségek lehetnek

AAA(Lys) > AAG(Lys) > UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)...

A természetes gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala) transzlációs szabályozás a 2. kodonnal

+10 régió AT gazdag

Távolság a start kodon és a SD között

- meglehetősen érzékeny, általban 4 - 13 bázispár megengedett.

- Génfüggő, egy gén esetén általában csak kicsit változhat.

A köztes szekvencia összetétele

“A” jó, ha van (2x-es stimulus), “C” mindegy

“U” a "-4"-es pozícióban hatékony “G” gátol (3x-os gátlás)

Upstream nemtranszlálódó szekvencia

Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása megszünteti a transzlációt (ld lac).

Minimum 10 bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötődnek hozzá.

Kodon felhasználási preferencia

Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak,

a különböző sejtféleségek különböző gyakorisággal használják az azonos aminosavakat kódoló tripleteket.

Ha a termeltetendő fehérje génjének kodon használata

nagyon eltér a gazdasejtétől, akkor meg kell szintetizáltatni a gént a gazda sejt preferenciájának megfelelően.

Alternatív megoldás: a gazdasejt kodon preferenciájának megváltoztatása,

ritka kodonokhoz tartozó tRNS gének bevitelével

[gbbct]: 50 CDS's (13879 codons)

Sphingomonas paucimobilis

AmAcid Codon Number /1000 Fraction Gly GGG 208.00 14.99 0.17

Gly GGA 70.00 5.04 0.06 Gly GGT 117.00 8.43 0.10 Gly GGC 827.00 59.59 0.68 Glu GAG 476.00 34.30 0.60 Glu GAA 318.00 22.91 0.40 Asp GAT 297.00 21.40 0.35 Asp GAC 558.00 40.20 0.65 Val GTG 386.00 2 7.81 0.43 Val GTA 40.00 2.88 0.04 Val GTT 65.00 4.68 0.07 Val GTC 412.00 29.69 0.46 Ala GCG 630.00 45.39 0.40 Ala GCA 142.00 10.23 0.09 Ala GCT 108.00 7.78 0.07

Ala GCC 687.00 49.50 0.44 Arg AGG 35.00 2.52 0.04 Arg AGA 12.00 0.86 0.01 Ser AGT 24.00 1.73 0.04 Ser AGC 232.00 16.72 0.3 Lys AAG 465.00 33.50 0.86

Lys AAA 76.00 5.48 0.14 Asn AAT 151.00 10.88 0.37 Asn AAC 252.00 18.16 0.63

Met ATG 376.00 27.09 1.00 Ile ATA 19.00 1.37 0.03 Ile ATT 117.00 8.43 0.17 Ile ATC 570.00 41.07 0.81 Thr ACG 228.00 16.43 0.33 Thr ACA 29.00 2.09 0.04 Thr ACT 41.00 2.95 0.06 Thr A CC 383.00 27.60 0.56 Trp TGG 250.00 18.01 1.00 End TGA 37.00 2.67 0.74 Cys TGT 21.00 1.51 0.11 Cys TGC 167.00 12.03 0.89 End TAG 5.00 0.10 0.36 End TAA 8.00 0.58 0.16 Tyr TAT 213.00 15.35 0.56 Tyr TAC 170.00 12.25 0.44 Leu TTG 71.00 5.12 0.06 Leu TTA 4.00 0.29 0.00 Phe TTT 8 6.00 6.20 0.14 Phe TTC 542.00 39.05 0.86 Ser TCG 204.00 14.70 0.31

Kodon felhasználási preferencia – táblázat

egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján a gén E. coli-ban,

vagy élesztőben való expresszálhatósága in silico becsülhető.

A transzláció terminációja

STOP kodon UAA UGA UAG

kötődő faktor RF1, RF2

RF1 RF2 UAA >> UGA, UAG

Az esetek 80 %-ában:

UAAU

PROTEOLÍZIS

Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási mechanizmusa

E. coli-ban

Abnormális fehérjék, sejten belüli aggregátumok

ATP függő endoproteázok polipeptidek

< 1500 Da endoproteázok

peptidek aminosavak

oldékony mono-, di- és tripeptidázok

La (Lon) a fő ATP függő proteáz

 87 kDa egységekből felépülő homotetramer,

 ATP és Mg

függő, az ATP-áz aktivitás nem a polipeptid kötés

felbontásához, hanem a degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell,

 in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez változhat, és ennél nagyobb.

 hasonló fehérjék előfordulnak magasabbrendűekben is, pl. egy máj mitondriális proteáz immunológiailag keresztreaktív

 abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl. szabályozó fehérjék bontása)

 szerin proteáz, hidrofób jellegű szekvenciáknál hasít

 alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje hozzákapcsolódása aktiválja,

 a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez kapcsolódó szabályozás alatt áll:



faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke

inaktív proteáz (4 ADP)

protein szubsztrát

4 ADP

4 ATP - Mg²⁺

alloszterikus aktiválás aktív proteáz

(4 ATP) 4 PO₄^3-

4 Mg ²⁺

A proteolitikus ciklus

Genetikai vonatkozások

léteznek inszerciós, deléciós lon mutánsok A lon

mutáció másodlagos hatásai

  Poliszaharid burok képzés (főleg alacsonyabb hőmérsékleten, mint 34

C) Megoldás:

 37

C-on növeszteni

 galE struktúrgének inaktiválása

 cps (capsule) struktúrgének inaktiválása

 rcsB, rcsA szabályozó régió mutánsok A lon mutánsok UV érzékenyek

DNS sérülés  filamentáció

Gazdag médiumon akár letális is lehet

ok: SOS indukálható sejtosztódás inhibitor SulA.

Megoldás:

- ne használjunk yeast extraktot, hanem tryptont

- sulA mutánsok

Ti (Clp) a másik ATP függő proteáz

 81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekből álló heterodimer, ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa móltömegű

 ATP és Mg

faktorok szükségesek

hidrofób részeknél hasít, de a specificitás eltér a La-tól

 az alegységek külön multimerizálódnak

 HtpR szabályozás alatt áll

Tulajdonság Ti (Clp) proteáz ClpP ClpA

aktivitás fehérje degradáció

ATP hidrolízis mellett peptidáz

ATP független ATP-áz fehérje aktivált

Kofaktor Mg²⁺ - Mg²⁺

Inhibítor MalNEt, iPr₂P-F iPr₂P-F MalNEt

Stabilizálás ATP, glicerin hőstabil ATP, glicerin

natív méret 700 kDa 260 kDa 160 kDa

alegységek 6 ClpA + 12 ClpP 21 kDa 81 kDa

Genetikai vonatkozások

 Rendelkezésre állnak clp mutánsok

 a mutáns egyedül nem, de a lon - nal együtt hatékony

Egyéb proteázok

 OmpT külső membránhoz kapcsolódó proteáz

 DegP periplazmatikus proteáz

   T4 fág fertőzés stabilizálja a fehérjéket

 pin gén terméke: La inhibitor

E. coli törzs genotípus Kiindulási törzs Megjegyzés lon mutánsok

SG1117 gal lac lon-146::Tn10 leu

sup+ rec+ HB101 Tetraciklin

rezisztens, jól transzformálható SG12041 gal, lon-510 sulA recA C600 nincs filamentáció

Rec-

lon htpR mutánsok

SG21163 lon-510 supFts htpRam165 MC4100 hőmérséklet

érzékeny

lon clp mutánsok

SG12044 gal lon-510 sulA

clpA319::kan C600 kanamycin

rezisztens

lon clp htpR mutánsok

SG21173 lon-510 supFts htpRam165 clpA319::kan lac

MC4100 kanamycin

rezisztens, hőmérséklet

érzékeny

Példák proteázaikban mutáns E. coli törzsekre

FÚZIÓS FEHÉRJÉK

A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a fúziós partnerek génjeit a megfelelő leolvasási keretben úgy klónozzuk össze,

hogy az 5’ vég felőli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne szerepeljen.

Így egy polipeptidláncot kapunk, amelyben a kiinduási fehérjék egymást követő régiókként helyezkednek el.

ELŐNYEI

1. Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus stabilitást jelenthet   2. Óriási előny a tisztítás során, affinitás oszlopok

  3. szignálpeptiddel való fúzió, szekretált fehérje (limitált)   4. Az in vitro hasítás sokszor pontosabb,

intaktabb N-terminális szekvenciát eredményez

Oldhatatlan

"iclusion bodies"

trpEII, vagy cII,

nincs proteolízis, differenciális centrifugálással az "inclusion body" könnyen tisztítható,

probléma: nem aktív fehérje pl sometostatin, inzulin A, B,

ellenanyag termelés

Oldható forma

biológiailag aktív fehérje, affinitás oszlopon való tisztítás

problémák a stabilitással, kevésbé jósolható

Fúziós fehérjék oldhatósága

Egyéb hasznosítási lehetőségek

1. a szignál peptidekkel való fúzió előnyei (ld. később)

a periplazmában, illetve az extracelluláris térben oxidatívabb környezet, diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF, IGF

A periplazmában az összfehérje 4%-a található, értelemszerűen kevesebb proteáz,könnyebb tisztítás

2. A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így a kívánt fehérje immobilizálható 3. funkcionális, struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai felhasználás

alkalmasan választott fúziós partner esetén nincs szükség hasításra.

A fúziós fehérjék tisztításának elve

I. 1. affinitás kromatográfia

II. hasítás III. 2. affinitás kromatográfia

tiszta fehérje

fúziós partner

célfehérje