Tar g e t i n g o f t h e k y n u r e n i c a c i d a c r o s s t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r b y c o r e - s h e l l n a n o p a r t i c l e s
N. Var g aa, E. C s a p óa, Z. M ajl á t hb, I. Iliszc, I.A. Kriz b aid, I.Wilh el md, L.
Kn a p pe, J. Toldie ,f, L. Véc s eib , e, I. D é k á n ya ,*
a M T A-S Z T E S u p r a m o l e c u la r a n d N a n o s t r u c t u r e d M a t e rials R e s e a r c h Gr o u p , D e p a r t m e n t o f M e d i c al C h e m i s t ry, Fac ul t y o f M e d i ci n e , U ni v e r si t y o f S z e g e d , H-6 7 2 0 Dó m t é r 8 ., S z e g e d , H u n g a r y
b D e p a r t m e n t o f N e u r olo gy, U ni v e r si t y o f S z e g e d , H-6 7 2 5 S e m m e l w e i s u . 6 , S z e g e d , H u n g a r yc D e p a r t m e n t o f I n o r g a ni c a n d A n al y ti cal C h e m i s t ry, U n i v e r si t y o f S z e g e d , H-6 7 2 0 D ó m t é r 7 , S z e g e d , H u n g a r y
d I n s ti t u t e o f Bio p h y si c s, Biolo gi c al R e s e a r c h C e n t r e o f t h e H u n g a ria n A c a d e m y o f S ci e n c e s ,
H-6 7 2 6 Te m e s v á ri k r t . 6 2 , S z e g e d , H u n g a r y
e D e p a r t m e n t o f P h y si olo gy, A n a t o m y a n d N e u r o s ci e n c e , U n i v e r si t y o f S z e g e d , H-6 7 2 6 Kö z é p fa s o r 5 2 , S z e g e d , H u n g a r y
f M T A-S Z T E N e u r o s ci e n c e R e s e a r c h Gr o u p , H-6 7 2 5 S e m m e l w ei s u . 6 , S z e g e d , H u n g a r y
* C o r r e s p o n di n g a u t h o r a t : MTA-S ZT E S u p r a m ol e c ul a r a n d N a n o s t r u c - t u r e d M a t e r i al s R e s e a r c h G r o u p , D e p a r t m e n t of M e d i c al C h e m i s t ry, F a c - u l ty of M e d i ci n e , U n iv e r si ty of S z e g e d
E-m a il a d d r e s s : i. d e k a n y @ c h e m . u-s z e g e d . h u (I. D é k á n y)
A b s t r a c t
C o r e-s h e ll n a n o p a r ti cl e s (C S N P s) w e r e d e v el o p e d t o g e t ov e r t h e r a p e u ti c a m o u n t of ky n u r e n i c a ci d (KYNA) a c r o s s t h e b l o o d-b r a i n b a r r i e r (BBB).
Bovi n e s e r u m a l b u m i n (BSA) w a s u s e d a s c o r e fo r e n c a p s u l a tio n of KYNA a n d t h e B SA/KYNA c o m p o si t e w e r e fin ally e n c a p s u l a t e d b y p oly( allyl a mi n e ) h y d r o c hl o ri d e (PAH) p oly m e r a s s h ell. I n t h e i n t e r e s t of t h e o p ti miz a tio n of t h e s y n t h e si s t h e BSA a n d KYNA i n t e r a c ti o n w a s s t u d i e d b y t w o-d i m e n si o n al s u rf a c e p l a s m o n r e s o n a n c e ( S P R) t e c h n i q u e a s w ell. T h e a v e r a g e siz e of d ~ 1 0 0 n m w a s p r o v e n b y d y n a m i c lig h t s c a t t e r i n g (DLS) a n d t r a n s m i s sio n el e c t r o n m i c r o s c o p y (TE M), w h il e t h e s t r u c t u r e of t h e c o m p o si t e s w e r e c h a r a c t e r iz e d b y flu o r e s c e n c e ( FL) a n d ci r c u l a r d i c h r oi s m (CD) s p e c t r o s c o py. T h e in vi tr o r e l e a s e p r o p e r ti e s of KYNA w e r e inv e s ti g a t e d b y a v e r ti c al diff u sio n c ell a t 2 5 . 0 ° C a n d 3 7 . 5 ° C
a n d t h e ki n e ti c of t h e r el e a s e w e r e d i s c u s s e d . T h e p e n e t r a tio n c a p a ci ty of t h e N P s in t o t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m (C N S) w a s t e s t e d b y a n in vi tr o BBB m o d el. T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e e n c a p s ul a t e d KYNA h a d si g n ific a n tly h i g h e r p e r m e a b ility c o m p a r e d t o f r e e KYNA m o l e c u l e s . I n t h e n e u r o b i olo gi c al s e r i al of in vi v o e x p e r i m e n t s t h e eff e c t s of p e r i p h e r a lly a d m i ni s t e r e d KYNA wi t h C S N P s w e r e s t u di e d i n c o m p a r i s o n wi t h u n t r e a t e d KYNA. T h e s e r e s u l t s cl e a r ly p r o v e d t h a t KYNA i n t h e C S N P s , a d m i ni s t r a t e d p e r i p h e r ally is s ui t a bl e t o c r o s s t h e BBB a n d t o in d u c e el e c t r o p h y siolo gi c al eff e c t s wi t hi n t h e C N S . As t h e n e u r o p r o t e c tiv e p r o p e r ti e s of KYNA n o w a d a y s a r e p r o v e n , t h e i m p o r t a n c e of t h e r e s u l t s is o b vio u s .
K e y w o r d s : ky n u r e n i c a ci d , c o r e-s h ell n a n o p a r ti cl e s , r el e a s e , r e l e a s e ki n e ti c, BBB m o d el
Li s t o f a b b r e v i a t i o n s
B SA, b o vi n e s e r u m a l b u m i n; BBB, b l o o d-b r ai n b a r r i e r ; CD, ci r c ul a r d i c h r oi s m ; C N S, c e n t r al n e r v o u s s y s t e m ; C S N P s , c o r e-s h ell n a n o p a r ti cl e s;
DLS, d y n a m i c li g h t s c a t t e r i n g ; F L, flu o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y; H P LC-M S, h i g h p e r f o r m a n c e liq ui d c h r o m a t o g r a p h y-m a s s s p e c t r o m e t r y; I EP, is o el e c t r i c p oi n t , KYNA, ky n u r e n i c a ci d; L-KYN, L-ky n u r e n i n e ; PAH, p oly( allyl a mi n e ) h y d r o c hl o ri d e ; P B S, p h o s p h a t e b uff e r ; RB EC s , r a t b r a i n e n d o t h eli al c ell s; S E P s , s o m a t o s e n s o r y e v o k e d r e s p o n s e s ; S P R, s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e; TE M, t r a n s m i s si o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y; T r p , t r y p t o p h a n ;
1 . I n t r o d u c t i o n
M a n y p o t e n ti al t h e r a p e u ti c a g e n t s t h a t a r e u s e d in b i olo gi c al sy s t e m s a r e li mi t e d b e c a u s e t h e y c a n’ t g e t t h r o u g h t h e BBB, t h a n k s t o t h ei r p r o p e r ti e s , fo r e x a m p l e siz e, h y d r o p h ilic c h a r a c t er, c h a r g e , e t c. T hi s b a r r i e r c a n b e ci r c u m v e n t e d b y s p e cific t r a n s p o r t e r s , c h e m i c al m o d ific a tio n s , in t e r a c ti o n s wi t h o t h e r m o l e c ul e s o r a p p lic a ti o n of c o m p o si t e s (G a b t h u l er, 2 0 1 0 ) . T h e ky n u r e n i n e p a t h w a y is t h e m a i n r o u t e of t r y p t o p h a n (T r p) m e t a b oli s m i n m a m m a li a n b r a i n , w h i c h inv olv e s s e v e r al n e u r o a c tiv e c o m p o u n d s . KYNA is a p r o d u c t of t h e T r p m e t a b oli s m , it h a s a n e u r o p r o t e c tiv e a n d n e u r oi n hi bi t o r y p r o p e r ti e s (S t o n e , 1 9 9 3 ; M a r o si e t al., 2 0 1 0 ; S a s e t a l., 2 0 0 7 ) . It e x e r t s it s eff e c t m a i nly b y a n t a g o nizi n g io n o t r o pi c g l u t a m a t e r e c e p t o r s , it s n e u r o p r o t e c tiv e c a p a ci ty c a n b e a t t r i b u t e d m a i nly t o t h e i n hi bi tio n of t h e N-m e t h yl-D-a s p a r t a t e ( N M DA) r e c e p t o r s . KYNA c a n a l s o i nfl u e n c e t h e p r e s y n a p ti c gl u t a m a t e r e l e a s e b y a n t a g o nizi n g t h e α7-n i c o ti ni c- a c t yl c h oli n e r e c e p t o r s (C a r p e n e d o e t a l., 2 0 0 1 ; Z a d o ri e t a l., 2 0 0 9 ) . KYNA m i g h t p l a y i m p o r t a n t r ol e s i n m o d u l a ti n g n e u r o t r a n s m i s si o n i n t h e C N S ( F u k u s h i m a e t a l., 2 0 0 7 ). Alt e r a ti o n s of t h e k y n u r e n i n e m e t a b olit e s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d in s e v e r al n e u r olo gi c al di s o r d e r s s u c h a s H u n t i n g t o n’ s d i s e a s e , m i g r ai n e o r s t r o k e (D a rli n g t o n e t a l., 2 0 0 7 ; Véc s ei e t al., 2 0 1 3 ). El e v a ti n g t h e l ev el of t h e n e u r o p r o t e c tiv e KYNA in t h e b r ai n h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o b e of t h e r a p e u ti c v al u e in a n i m al m o d el s of P a r ki n s o n’s d i s e a s e , H u n ti n g t o n’s d i s e a s e a n d m i g r ai n e (F ej e s e t a l., 2 0 1 1 ; Silv a-Ad ay a e t a l., 2 0 1 1 ). H o w e v er, s y s t e m i c a d m i ni s t r a tio n of KYNA is n o t r e a s o n a b l e , b e c a u s e it s p e n e t r a ti o n t h r o u g h t h e BBB is v e r y p o or. I n o u r r e c e n t s t u d i e s , w e s y n t h e s iz e d a n e w c o m p o u n d , g l u c o s a m i n e-ky n u r e n i c a ci d (KYNA-N H-GLUC), w h i c h in p e r i p h e r a l a d m i ni s t r a tio n w a s a b l e t o c r o s s t h e BBB, a n d t o in d u c e r e d u c tio n s in t h e a m p li t u d e s of t h e e v o k e d r e s p o n s e s , si mil a r t o t h o s e of KYNA a d m i ni s t r a t e d i n t r a c e r e b r o v e n t r i c ul a rly ( F ü v e si e t a l., 2 0 0 4 ). Aft e r w a r d s , o t h e r eff e c tiv e KYNA d e r iv a tiv e s w e r e s y n t h e siz e d w h i c h w e r e a b l e t o c r o s s t h e BBB a n d t o in d u c e n e u r o p r o t e c tiv e eff e c t s i n c a s e of p e r i p h e r al a d m i ni s t r a tio n t o o ( N a g y e t a l., 2 0 1 1 ; F ü l ö p e t a l., 2 0 1 2 ).
Ap plic a tio n of n o v el, n a n o t e c h n olo g y-b a s e d c a r ri e r s y s t e m s m a y p r o m o t e d r u g d e liv e r y i n t o t h e b r a i n , w h i c h m a y off e r f u t u r e t h e r a p e u ti c o p ti o n s fo r s e v e r al n e u r ol o gi c al d i s o r d e r s . Diff e r e n t n a n o c a r r i e r s y s t e m s h a v e b e e n d e v el o p e d a n d e a r ly in vi tr o a n d p r e cli nic al s t u di e s yi el d e d p r o mi si n g r e s u l t s t o a c h i ev e d r u g d e liv e r y t h r o u g h t h e BBB (Wo n g e t al., 2 0 1 2 ; L u e t a l., 2 0 1 4 ). N o w a d a y s, t h e a p p li c a tio n of C S N P s h a s b e c o m e a n a r e a of in t e n s e g r o wi n g i n t e r e s t . T h e a l b u m i n-b a s e d N P s a r e c o n si d e r e d t o b e a t t r a c tiv e o p p o r t u n i ty a s c a r ri e r s y s t e m s b e c a u s e m a n y b i n d i n g si t e s a r e r e a c h a b l e t o v a rio u s d r u g m ol e c ul e s . T h e al b u m i n s h a v e s e v e r al s p e cific a d v a n t a g e s i n n a n o-s c a l e r a n g e , s u c h a s b i o d e g r a d a b ility, b io c o m p a ti bility a n d n o n-t o xici ty ( Elzo g h b y e t a l., 2 0 1 2 ) s o t h e B SA is wi d ely u s e d fo r d r u g d eliv e ry, u si n g c a r r i e r s s u c h a s m i c r o p a r ti cl e s , n a n o s p h e r e s , N P s a n d g el s (Wa n g e t a l., 2 0 0 8 ). T h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e of t h e B SA c a n b e e x a m i n e d b y C D s p e c t r o s c o p y si n c e it h a s t w o n e g a tiv e b a n d s ( 2 0 8 n m , 2 2 2 n m ) in t h e f a r UV r e g i o n ; t h e fi r s t b a n d is c h a r a c t e r i s ti c fo r α-h elic al s t r u c t u r e of t h e p r o t ei n ( Kelly e t a l., 2 0 0 5 ) w h i c h c a n b e c al c ul a t e d f r o m t h e o b s e r v e d e lli p ti ci ty v al u e s ( M a n d a l e t al., 2 0 1 0 ). To e n c a p s u l a ti o n of d iff e r e n t m o l e c ul e s f r e q u e n tly p oly m e r s o r p oly el e c t r oly t e s , s u c h t h e p oly(l a c ti c-c o -g ly c olic a ci d (PLGA) (R af a ti e t al., 2 0 1 2 ), p oly e t h yl e n e g ly c ol (P EG) ( As hj a ri e t a l., 2 0 1 2 ) , c hi t o s a n (Bo w m a n e t a l., 2 0 0 6 ) o r t h e PAH a r e u s e d . T h e PAH is a s y n t h e ti c c a ti o nic p oly el e c t r oly t e w h i c h is w a t e r-s ol u bl e a n d bi o d e g r a d a b l e , s o it u s e d i n n a n o t e c h n ol o g y a n d n a n o m e d i c al fiel d a s w ell ( Z h o u e t a l., 2 0 0 4 ; Wy t r w a l e t a l., 2 0 1 4 ) .
I n t h i s s t u dy, B SA-b a s e d C S N P s w e r e d e v elo p e d fo r KYNA e n c a p s u l a tio n . S iz e a n d s t r u c t u r a l i nfo r m a ti o n w e r e g a i n e d b y DLS, TE M a n d CD m e t h o d s . I n vi tr o m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d t o s t u d y t h e r e l e a s e p r o p e r ti e s a n d t h e r el e a s e m e c h a n i s m of t h e KYNA. An in vi tr o BBB m o d el w a s a p p li e d t o a s s e s s t h e p e n e t r a ti o n c a p a ci ty of t h e e n c a p s u l a t e d KYNA c o m p a r e d t o f r e e KYNA. I n t h e in vi v o n e u r o p h y siolo gi c al s t u di e s , t h e e ff e c t s of i n t r a p e r i t o n e ally (i. p.) a d m i ni s t e r e d KYNA, it s p r o d r u g L -ky n u r e n i n e (L -KYN), B SA/PAH a n d B SA/KYNA/PAH w e r e s t u di e d .
2
.
M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 2 . 1 . M a t e rial sT h e B SA (f r a c tio n V), t h e KYNA, t h e PAH wi t h MW of 1 5 . 0 0 0 g m o l-1, t h e c o m p o n e n t s of t h e p h o s p h a t e b u ff e r ( PB S), t h e s o di u m p h o s p h a t e d i b a si c h e x a d e c a h y d r a t e ( N a2H P O4 × 1 6 H2O) a n d t h e s o di u m p h o s p h a t e m o n o b a si c m o n o h y d r a t e ( N a H2P O4 × H2O) w e r e p u r c h a s e d f r o m Si g m a Ald ri c h . T h e s o di u m c hl o ri d e ( N a Cl) a n d t h e s o di u m h y d r o xi d e ( N a O H ) p a s till e s w a s b o u g h t f r o m M ol a r C h e m i c al s . H i g hly p u r ifi e d w a t e r w a s o b t ai n e d b y d e i o niz a ti o n a n d filt r a ti o n wi t h a Milli p o r e p u r ific a ti o n a p p a r a t u s . All s olv e n t s a n d r e a g e n t s u s e d w e r e of a n aly tic al g r a d e a n d n o fu r t h e r p u r ific a tio n s w e r e m a d e .
2 . 2 . S y n t h e s i s o f C S N P s
All s a m p l e s w e r e p r e p a r e d in P B S b uff e r ( p H = 7 . 4 ) a t 2 5 . 0 ° C wi t h c o n s t a n t io ni c s t r e n g t h ( 0. 9 % w /v N a Cl). T h e B SA ( 6 % w /v) w a s s ti r r e d in P B S, af t e r f ully d i s s olvi n g 9 0 m g KYNA w a s a d d e d t o t h e p r o t ei n s ol u tio n (BSA : KYNA m o l a r r a ti o is 1 : 1 7 5 ). T h e B SA/KYNA c o m p o si t e d i s p e r si o n w a s s ti r r e d fo r t w o h o u r s . T h e n PAH s ol u tio n ( 0. 2 4 % w /v; PB S, p H = 7 . 4) w a s a d d e d t o t h e B SA/KYNA c o m p o si t e . T h e fi n al vol u m e w a s 3 m l. T h e p r o d u c t s w e r e s t o r e d a t -8 0 ° C b e c a u s e of t h e s t a b ility of t h e d r u g a n d t h e p r o t ei n m ol e c u l e s .
2 . 3 . M a t e rial s c h a r a c t e ri z a tio n
Fo r d e t e r m i n a ti o n of t h e c h a r g e of t h e i ni ti al m a t e r i al s (B SA, PAH) a t p H
= 7 . 4 t h e c o m p o n e n t s w e r e ti t r a t e d w i t h N a O H (cN a O H = 1 . 0 M ) u s i n g p a r ti cl e c h a r g e d e t e c t o r ( PCD-0 4 M ÜT EK). M o r e o v er, t h e B SA a n d t h e B SA/PAH c o m p o si t e w e r e ti t r a t e d wi t h KYNA t o d efi n e t h e a m o u n t of d r u g m ol e c ul e s in t h e in t e r e s t of t h e c h a r g e c o m p e n s a ti o n . T h e fl u o r e s c e n c e s p e c t r a w e r e r e c o r d e d b y a H o r i b a Jo bi n Yvo n F l u o r o m a x-4 s p e c t r ofl u o r o m e t e r ( ex cit a ti o n a t 2 8 0 n m ). T h e siz e of t h e p r e p a r e d p r o d u c t s w e r e d e t e r m i n e d b y DL S m e t h o d wi t h a H o r i b a S Z-1 0 0 a p p a r a t u s . Ci r c ul a r Dic h r oi s m (CD) s p e c t r a w e r e r e c o r d e d ( 1 9 0-2 5 0 n m ;
2 5 . 0 ° C; b a n d wi d t h : 2 n m ; s c a n n i n g s p e e d : 1 0 0 n m / m i n) u si n g a Ja s c o J- 8 1 5 C D s p e c t r o m e t e r . Du r i n g t h e s y n t h e si s fo r c o n t r olli n g t h e c o n c e n t r a ti o n of t h e KYNA s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g a UV–1 8 0 0 ( S hi m a d z u ) s p e c t r o p h o t o m e t e r ( a t 3 3 3 n m ).
T h e TE M i m a g e s w e r e r e g i s t e r e d b y u si n g a F EI Tec n ai G2 2 0 X-TWI N m i c r o s c o p e (t u n g s t e n c a t h o d e ; 2 0 0 kV). T h e S P R t e c h n i q u e a r e c a p a b l e of r e a l-ti m e m o n i t o ri n g of b i o m ol e c ul a r in t e r a c tio n s o n a g ol d s e n s o r s u rf a c e w i t h o u t t h e u s e of l a b el s ( H o m o l a e t a l. 2 0 0 8 ) . D u r i n g S P R m e a s u r e m e n t s , o n e of t h e in t e r a c t a n t s is i m m o biliz e d fr o m s ol u tio n o n t o a s oli d/li q ui d in t e rf a c e , a n d a s ol u ti o n of t h e o t h e r in t e r a c t a n t is p a s s e d ov e r t h e f u n c ti o n aliz e d g ol d s u rf a c e . D u ri n g t h i s p r o c e d u r e , t h e r e f r a c tiv e in d e x a t t h e i n t e rf a c e u n d e r g o e s c h a n g e , t hi s b ei n g d i r e c tly r e l a t e d t o t h e p l a s m o n s hif t (Δλ) a s w ell a s t h e a m o u n t of t h e b i o m ol e c ul e s ( ms/n g c m-2) a d s o r b e d o n t h e s u rf a c e of t h e bi o s e n s o r c hi p . M o r e d e t ail e d i nfo r m a tio n of S P R t e c h n i q u e ( m e a s u r i n g p r i n ci pl e s , a p p li e d e q u a ti o n s fo r c al c ul a tio n s) s e e in H o m ol a e t a l., 2 0 0 8 a n d in o u r r e c e n t p u b li c a tio n s (S e b k e t a l., 2 0 1 3 ; C s a p ó e t a l., 2 0 1 4 ; C s a p ó e t a l., 2 0 1 5 ). ő S P R m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t o n t h e t w o-c h a n n e l S P R s e n s o r p l a tf o r m d e v el o p e d a t t h e I n s ti t u t e of P h o t o ni c s a n d El e c t r o ni c s (P r a g u e ). T h e in t e r a c tio n of KYNA wi t h B SA w a s s t u di e d i n t h e c o n c e n t r a tio n r a n g e of 0 . 1 – 6 . 0 m M in P B S (flo w r a t e : 2 5 µ L m i n-1; 1 5 0 m M N a Cl, p H = 7 . 4 , 2 5 . 0
° C ). P a r a ll el m e a s u r e m e n t s h a v e b e e n p e r f o r m e d a n d t h e s t a n d a r d d e vi a tio n s of t h e s o r p tio n e x p e r i m e n t s w e r e ± 4 . 5 % . I n e a c h s t e p s 8 0 0- 8 0 0 l p r o t ei n a n d KYNA s ol u tio n s w e r e i nj e c t e d a n d t h e s o r p tio n ti m e ( ~μ 2 5 m i n ) w a s follo w e d b y r i n si n g p r o c e d u r e u si n g b u ff e r s ol u tio n . T h e s e n s o r g r a m s (Δλ v s. ti m e ) w e r e a n a lyz e d i n r e al-ti m e b y a s p e ci al s of t w a r e p a c k a g e t h a t a llo w s d e t e r m i n a ti o n of t h e r e s o n a n t w a v el e n g t h in b o t h s e n si n g c h a n n e l s.
2 . 4 . I n vi tr o d r u g r el e a s e e x p e ri m e n t s
T h e in vi tr o e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t a c c o r di n g t o t h e p r o c e d u r e d e - s c ri b e d e a r li e r (Var g a e t a l., 2 0 1 4 , 2 0 1 5 ) . B ri efly, t h e n a n o p a r ti cl e d i s p e r - si o n c o n t ai ni n g KYNA in PBS, ( p H = 7 . 4 ) w a s s e p a r a t e d b y c ell ulo s e
m e m b r a n e f r o m t h e p h y siolo gi c al s ol u tio n i n a v e r ti c al d iff u si o n c ell ( F r a n z c ell; HA N S O N CO.). T h e c ell w a s c o n n e c t e d t o a UV-1 8 0 0 s p e c - t r o p h o t o m e t e r vi a a p e r i s t al tic p u m p fo r mi n g a clo s e ci r c ul a ti n g s y s t e m . T h e s ol u tio n w a s s ti r r e d c o n ti n u o u sly wi t h a h e lic al m a g n e ti c s ti r r e r a n d t h e r e l e a s e e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t a t 2 5 . 0 ° C a n d 3 7 . 5 ° C a s w ell . S a m p l e s w e r e t a k e n e v e r y 1 0 m i n u t e s d u r i n g t h e fi r s t h o ur, a n d t h e n o nly o n c e e v e r y h o ur. M e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d in 5 0 0 m i n u t e s . T h e e x - p e r i m e n t w a s r e p e a t e d t w o ti m e s a n d t h e s t a n d a r d d e vi a ti o n of t h e e x p e r - i m e n t s w a s ± 2 . 5 % .
2 . 5 . C ell c u l t u r e a n d p e r m e a b ilit y a s s a y
P ri m a r y r a t b r ai n e n d o t h e li al c ells (RB EC s), p e r i cy t e s a n d g li al c ell s w e r e is ol a t e d a s d e s c ri b e d p r e vio u sly ( Wil h el m e t a l., 2 0 1 1 ) . T h e in vi tr o BBB m o d el w a s c o n s t r u c t e d b y pl a ti n g p e r i cy t e s o n t o t h e b a c k si d e of 1 2-w e ll T r a n s w ell filt e r s ( p o r e siz e: 0 . 4 m) a n d RB E C s o n t o t h e u p p e r si d e . Aft e rμ r e a c h i n g c o nfl u e n c e , t h e e n d o t h e li al m o n ol ay e r w a s s u p p li e d wi t h 5 5 0 n M h y d r o c o r ti s o n e , 2 5 0 M C PT-cA M P ( Si g m a-Ald ri c h ), a n d 1 7 . 5 M R O-μ μ 2 0 1 7 2 4 (Ro c h e ) a n d p l a c e d in t o t h e C ellZ s c o p e i n s t r u m e n t ( n a n oA n aly ti c s, M u e n s t er, G e r m a n y) c o n t ai ni n g g li al-c o n d i tio n e d m e d i a.
TE ER ( t r a n s e n d o t h e li al el e c t r i c al r e si s t a n c e ) w a s follo w e d u n t il r e a c h i n g p l a t e a u of 1 2 0-1 4 0 O h m × c m2. T r a n s w e ll filt e r s c o n t a i ni n g e n d o t h eli al c ell s a n d p e r i cy t e s w e r e r e m o v e d f r o m t h e C ellZ s c o p e in s t r u m e n t . Fil t e r s w e r e w a s h e d wi t h Ri n g e r-H E P E S s ol u tio n ( p H = 7 . 4 ). Tes t s u b s t a n c e s (KYNA o r B SA/KYNA/PAH) w e r e d i s s olv e d in Ri n g e r-H E P E S a n d a p p li e d in t h e u p p e r c o m p a r t m e n t i n a fin al c o n c e n t r a ti o n of 2 0 µ M KYNA. T h e lo w e r c o m p a r t m e n t w a s lo a d e d wi t h Ri n g e r-H E P E S . S a m p l e s w e r e t a k e n fr o m t h e b a s ol a t e r al si d e a f t e r 1 h . T h e c o n c e n t r a ti o n s of t h e s a m p l e s w e r e q u a n ti t a t e d wi t h a n Agile n t 1 1 0 0 H PL C-M S s y s t e m (Agil e n t Te c h n olo gi e s , S a n t a Cl a r a , CA, U SA). P e r m e a b ility of t h e t e s t s u b s t a n c e s w a s c al c ul a t e d a s d e s c r i b e d p r e vio u sly ( N a g y o s zi e t a l., 2 0 1 0 ). S t a ti s ti c al a n a ly si s w a s p e r f o r m e d u si n g S t u d e n t’ s t-t e s t .
2 . 6 . I n vi v o e x p e ri m e n t s
2 . 6 . 1 . Ani m al s, s u r g e r y a n d e l e c t r o p h y siolo gy
I n vi v o e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n a d u l t Wis t a r r a t s , w e i g hi n g 3 0 0 g ( n = 3 0 ). Fo o d a n d w a t e r w e r e a v ail a bl e a d libi t u m . All p r o c e d u r e s w e r e a p p r o v e d b y t h e Ani m al C a r e C o m mi t t e e of t h e U niv e r si ty a n d w e r e c o n d u c t e d a c c o r d i n g t o t h e r e c o m m e n d a t io n s of t h e D e cl a r a ti o n of H e l si n ki a n d Tokyo. T h e a n i m al s w e r e a n e s t h e tiz e d wi t h a n in t r a p e r i t o n e al u r e t h a n e inj e c tio n ( 1. 3 g / k g b o d y w ei g h t). Bo dy t e m p e r a t u r e w a s m a i n t ai n e d a t 3 7 ± 0 . 5 ° C t h r o u g h t h e u s e of a s elf- r e g u l a ti n g h e a t i n g p a d . T h e s o m a t o s e n s o r y e v o k e d r e s p o n s e s ( S E P s) w e r e in d u c e d b y t h e e l e c t ri c s ti m ul a ti o n of t h e w h i s k e r s wi t h b i p ol a r n e e d l e e l e c t r o d e s ( 3 - 3 . 5 V; 0 . 2 m s , 0 . 1 H z). M o r e d e t ail s of s u r g e r y a n d el e c t r o p h y siolo g y s e e in fo r m e r w o r k s (Tol di e t a l., 1 9 8 8 , 1 9 9 4 ).
2 . 6 . 2 . Ex p e r i m e n t a l g r o u p s a n d t r e a t m e n t
KYNA, L-KYN (Si g m a-Ald ri c h , S t. Lo ui s, MO, U SA ), e n c a p s u l a t e d KYNA, e m p t y BSA c o m p o si t e a n d s ali n e ( n = 5 , 5 , 6 , 9 , 5 ) w a s a d m i ni s t e r e d vi a i. p. i nj e c tio n af t e r 3 0 m i n c o n t r ol p e r i o d of t h e r e c o r d i n g s ( d o s e : 3 0 0 m g / k g ; s p e e d : 3 3 3 µ l m i n-1; p H = 7 . 4 ) wi t h t h e ai d of a m i c r oi nj e c tio n p u m p (C MA / 1 0 0 , C MA Mi c r o di aly sis AB, Kis t a , S w e d e n ).
2 . 6 . 3 . S t a ti s ti c al a n aly si s
R e p e a t e d m e a s u r e m e n t s of S E R a m p lit u d e s of t h e c o n t r ol a n d t r e a t e d g r o u p s w e r e c o m p a r e d s e p a r a t e ly wi t h t h e a i d of t h e n o n-p a r a m e t r i c R el a t e d-S a m p l e s F r i e d m a n’ s Two-Way An aly si s of Vari a n c e b y R a n k s . 3 . R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n
I n o r d e r t o d e si g n d iff e r e n t p r o t ei n-b a s e d n a n o c a r r i e r c o m p o si t e s y s t e m s c o n t ai ni n g eff e c tiv e d r u g m ol e c u l e s t h e s t u d y of t h e i n t e r a c tio n b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e d r u g a g e n t a s w ell a s t h e d e t e r m i n a ti o n of t h e b i n di n g c a p a ci ty of p r o t ei n t o w a r d s t h e d r u g m o l e c u l e a r e c r u ci al.
Acc o r d i n g ly, t w o-di m e n si o n al S P R m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t a t 2 5 . 0
°C. Fi r s tly t h e s t u di e d p r o t ei n w a s i m m o biliz e d o n t o t h e g ol d s u rf a c e f r o m
a q u e o u s s ol u ti o n (c = 0 . 0 5 m M ). T h e r e g i s t e r e d S P R s e n s o r g r a m is p r e s e n t e d in F i g . 1 ( A ) . T h e g ol d s u rf a c e w a s f u n c tio n aliz e d wi t h t h e B SA in t w o s t e p s . As t h e r e g i s t e r e d s e n s o r g r a m s h o w s 8 1 . 5 % of a d s o r b e d B SA r e m a i n s i r r e v e r si bly b o u n d a t g ol d s u r f a c e af t e r r i n si n g p r o c e d u r e . T h e bi n di n g of B SA o n g ol d s u r f a c e c a u s e d Δλ = 5 . 5 n m p l a s m o n s h if t ( s e e i n F i g . 1 ( A ) in s e t) w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e ms = 1 4 0 . 0 5 n g c m-2 a d s o r b e d a m o u n t of B SA (c o n v e r sio n p u b li s h e d in S e b kő e t a l., 2 0 1 3 , H o m ol a e t al., 2 0 0 8 , Li e d b e r g e t a l., 1 9 9 3 ).1 B a s e d o n t h e r e s u l t s of S P R t h e a d s o r b e d a m o u n t ( ms / n g c m-2), t h e a d s o r p tio n c a p a ci ty a t t h e m a xi m al c o n c e n t r a ti o n (Γm / n m ol c m-2) a n d t h e c r o s s s e c tio n al a r e a ( am / n m2) of t h e s t u d i e d p r o t ei n w e r e d e t e r m i n e d . I t w a s fo u n d t h a t t h e Γm = 0 . 0 0 2 1 2 2 n m o l c m-2 w h il e t h e c r o s s s e c tio n al a r e a of B SA is am = 7 8 . 0 n m2 o n g ol d s u r f a c e u n d e r t h e a p p li e d c o n di tio n s ( am = 0 . 1 6 6 × 1 / Γm). I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e b i n di n g c a p a ci ty of KYNA o n B SA-c ov e r e d g ol d s u rf a c e t h e s o r p tio n of KYNA o n p r o t ei n-f u n c tio n aliz e d b io s e n s o r c hi p w a s inv e s ti g a t e d a t 2 5 . 0 ° C in t h e c o n c e n t r a ti o n r a n g e of 0 . 1 – 6 . 0 m M . T h e F i g . 1 ( B ) i n di c a t e s t h a t in c r e a s e i n c o n c e n t r a ti o n of KYNA s ol u ti o n s r e s u l t s i n h i g h e r w a v el e n g t h s hif t f r o m ~ 0 . 0 3 n m t o al m o s t 0 . 6 5 n m (s e e F i g . 1 ( B ) s e c o n d a r y y-a x e s). T h e s e n s o r g r a m s a l s o c o nfi r m t h a t t h e in t e r a c ti o n b e t w e e n t h e KYNA d r u g m o l e c ul e s a n d t h i s p r o t e i n is f ully r e v e r si bl e b e c a u s e a ll t h e a d s o r b e d m a s s of KYNA r e d u c e d t o n e a r ly z e r o a f t e r r i n si n g p r o c e d u r e s . T hi s r e v e r si bl e i n t e r a c ti o n is c r u ci al in o r d e r t o d e si g n p o t e n t n a n o c a r r i e r c o m p o si t e s y s t e m fo r (c o n t r oll e d ) d r u g d e liv e ry. I n t h e in t e r e s t of t h e d e v elo p m e n t of a n eff e c tiv e d r u g d e liv e r y s y s t e m s t h e i n t e r a c ti o n b e t w e e n t h e d r u g a n d t h e c a r r i e r s h o u l d b e s t r o n g e n o u g h t o f a cilit a t e t h e t r a n s p o r t b u t al s o w e a k e n o u g h t o r el e a s e t h e d r u g t o t h e t a r g e t .
P a r ti cl e s c h a r g e d e t e c t o r w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e c h a r g e of t h e ini ti al m a t e r i al s a s a f u n c ti o n of p H . O u r r e s u l t s c o nfi r m t h a t b o t h t h e B SA a n d t h e PAH a r e n e g a tiv ely c h a r g e d a t p H = 7 . 4 . T h e is o el e c t ri c p oi n t (I E P) of B SA a n d PAH a r e 4 . 5 3 a n d 5 . 4 2 , r e s p e c tiv ely ( F i g . 2 ( A ) ).
1 ms = δλ× [ ( Sb/Lp) × ( n / c)]δ δ -1× 2 , w h e r e δλ is t h e w a v el e n g t h( pl a s m o n) s hift, Sb is t h e b ul k s e n si tivi ty,Lp is t h e S P p e n e t r a t i o n d e p t h , n/ c is t h e c o n c e n t r a ti o n d e p e n d e n c e of δ δ t h e r ef r a c t iv e i n d e x, Li e d b e r g e t a l., 1 9 9 3)
H y d r o g e n b o n d s , h y d r o p h o bi c a n d a l s o -π π in t e r a c tio n s c a n d e v el o p b e t w e e n t h e t w o m a t e r i al s a t p h y siolo gi c al p H , u n lik e el e c t r o s t a ti c in t e r a c tio n s . F u r t h e r m o r e , t h e BSA a n d t h e B SA/PAH c o m p o si t e w e r e ti t r a t e d w i t h d r u g m o l e c ul e s (F i g . 2 ( B ) ) i n o r d e r t o d efi n e t h e a m o u n t of KYNA in t h e in t e r e s t of t h e c h a r g e c o m p e n s a ti o n . B a s e d o n c al c ul a tio n s it w a s e s t a b lis h e d t h a t m = 4 1 0 a n d m = 4 2 5 m g of KYNA is n e c e s s a r y t o r e a c h t h e c h a r g e c o m p e n s a ti o n fo r 1 g of B SA a n d B SA/PAH, r e s p e c tiv ely.
D u r i n g t h e s y n t h e si s w e u s e d 1 . 2 2- a n d 1 . 1 8- fol d e x c e s s , r e s p e c tiv ely.
DL S r e s u l t s (F i g . 3 ( A ) ) cl e a r ly c o nfi r m e d t h e n a n o m e t e r siz e r a n g e of t h e p r e p a r e d p a r ti cl e s . I t w a s fo u n d t h a t t h e siz e of t h e n e g a tiv ely c h a r g e d B SA is a b o u t d = 3 . 8 ± 0 . 3 n m a t p H = 7 . 4 . T h e siz e of t h e p r o t ei n d i d n o t c h a n g e si g nific a n tly b y a d d i n g d r u g m o l e c u l e s (B SA/KYNA c o m p o si t e , d = 3 . 6 ± 0 . 1 n m ) . W h e n t h e p oly el e c t r oly t e s h a v e b o u n d t o t h e B SA in t h e a b s e n c e of KYNA, t h e siz e in c r e a s e d t o o nly d = 2 0 . 5 ± 1 . 2 n m . T h e b i n di n g of KYNA t o t h e B SA/PAH c o m p o si t e f a cilit a t e s t h e b i n d i n g of m o r e p oly el e c t r oly t e w h i c h r e s u l t s in t h e fo r m a ti o n of t h e C S N P s . T h e B SA/KYNA/PAH c o m p o si t e s h a v e a n a v e r a g e siz e of d = 1 0 3 . 4 ± 4 . 8 n m . T h e r e g i s t e r e d TE M i m a g e s h o w s t h a t t h e B SA/KYNA/PAH C S N P s h a v e s p h e ri c al s t r u c t u r e a n d t h e c al c ul a t e d a v e r a g e d i a m e t e r ( d = 1 1 0 ± 3 . 5 n m ) is in g o o d a g r e e m e n t wi t h t h e DL S e x p e r i m e n t s a s w ell (F i g . 3 ( B ) ).
T h e flu o r e s c e n c e s p e c t r a of t h e ini ti al m a t e r i al s a n d t h e c o m p o si t e s a r e s h o w n i n F i g . 4 . T h e BSA h a s i n t e n siv e e m i s si o n p e a k s a t = 3 4 8 n mλ u si n g 2 8 0 n m e x ci t a tio n . T his h i g h v al u e ( 3 4 8 n m ) in di c a t e s t h a t t h e t r y p t o p h a n r e si d u e (T r p-1 3 4 ) is in c o n t a c t wi t h b o u n d w a t e r m o l e c ul e s ( Fil e n k o e t a l., 2 0 0 1 ). As F i g . 4 ( A ) s h o w s , t h e c o n ti n u o u s a d d i tio n of KYNA t o t h e p r o t ei n c a u s e s t h e d e c r e a s e a n d al s o t h e s hif t of t h e e m i s si o n p e a k a t = 3 4 8 n m w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e c h a n g e s of t h eλ p ol a r i ty a r o u n d t h e c h r o m o p h o r e m ol e c ul e. T hi s r e d s hif t a l s o i n di c a t e s t h a t T r p m o l e c ul e s a r e m o r e e x p o s e d t o t h e s olv e n t o n a v e r a g e (Klaj n e r t e t a l., 2 0 0 3 ). By a d d i n g 1 0 m M KYNA t o t h e B SA (i n t h i s c a s e t h e B SA : KYNA m o l a r r a ti o is c a . 1 : 1 3 3 ), t h e e m i s si o n p e a k of B SA is t o t ally d i s a p p e a r e d a n d o nly t h e e m i s sio n p e a k a t 3 8 3 n m a r e o b s e r v e d w h i c h
c o r r e s p o n d s t o t h e e m i s sio n of p u r e KYNA ( F i g . 4 ( B ) ). B a s e d o n t h e fl u o r e s c e n c e r e s u l t s h i g h KYNA e x c e s s ( 1: 1 7 5 ) w a s u s e d fo r s y n t h e s e s . T h e a d d i tio n of p oly el e c t r oly t e ( w hi c h d o e s n o t t r i g g e r flu o r e s c e n c e a t t hi s e x ci t a ti o n w a v el e n g t h ) t o t h e BSA/KYNA n a n o c o m p o si t e c a u s e d t h e d e c r e a s e i n t h e in t e n si ty of t h e e m i s si o n p e a k a t 3 8 3 n m . T hi s o b s e r v a tio n p r o b a b ly c o nfi r m t h e e n c a p s u l a ti o n of B SA/KYNA p r o d u c t b y t h e PAH p oly m er. I t w a s a l s o o b s e r v e d t h a t , in t h e a b s e n c e of KYNA t h e e m i s si o n in t e n si ty of t h e B SA is si g nific a n tly i n c r e a s e d b y a d d i n g PAH t o t h e p r o t e i n (F i g . 4 ( B ) , c u r v e e ) w h i c h s u p p o r t t h e u n f ol di n g of t h e B SA c h a i n s .
CD is a v e r y s e n si tiv e m e t h o d t o m o n i t o r t h e c o nf o r m a ti o n al c h a n g e in t h e p r o t ei n’ s s e c o n d a r y s t r u c t u r e (P e n g e t al., 2 0 1 1 ). T h e s p e c t r a of t h e B SA a n d t h e C S N P s b o t h in t h e p r e s e n c e a n d in t h e a b s e n c e of t h e KYNA a r e s h o w n i n F i g . 5 . T h e s p e c t r a of t h e s a m p l e s s h o w n e g a tiv e b a n d s lo c a t e d a t a r o u n d 2 0 8 n m a n d 2 2 8 n m . Fo r p u r e B SA s ol u tio n a b a n d a t 2 2 8 n m is c h a r a c t e r i s ti c, t h e a p p e a r a n c e of t h e o t h e r b a n d a t 2 0 8 n m is n o t d o m i n a n t . T h e a d d i tio n of PAH o r KYNA t o t h e p r o t ei n r e s u l t s a n i n t e n siv e r e d u c ti o n a n d d i s a p p e a r a n c e of t h i s n e g a tiv e b a n d a t 2 2 8 n m , r e s p e c tiv ely. T h e s e r e s u l t s in di c a t e t h e bi n d i n g of KYNA o r t h e p oly el e c t r oly t e t o t h e B SA. M o s t p r o b a b ly t h e B SA u n d e r g o e s c o nf o r m a ti o n al c h a n g e ; t h e a m o u n t of α-h elic al c o n t e n t is si g nific a n tly d e c r e a s e d . B a s e d o n t h e e q u a ti o n w h i c h w a s u s e d fo r c al c ul a tio n ( M a n d a l e t al., 2 0 1 0 ) t h e BSA c o n t a i n s 5 3 . 3 % of α-h e lic al u n i t s a t p H = 7 . 4 . T his v al u e is n e a r ly t h e s a m e fo r B SA/KYNA s y s t e m ( 5 1 . 8 %), b u t t h e p oly el e c t r oly t e c a u s e s si g n ific a n t p e r t u r b a ti o n i n t h e s t r u c t u r e of B SA/KYNA c o m p o si t e; it r e d u c e s t h e a m o u n t of α-h elic al c o n t e n t t o 1 5 . 9
%. T h e PAH (in it s elf) di d n o t c a u s e si g nific a n t d e c r e a s e in t h e α-h e lic al c o n t e n t (B SA/PAH = 2 9 . 6 %).
I n vi tr o r e l e a s e m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t ov e r a p e r i o d of 5 0 0 m i n (F i g . 6 , in s e t s). T h e KYNA is u n s t a b l e in s ol u ti o n: a t 2 5 . 0 ° C (A) a n d 3 7 . 5 ° C (B) t h e “ p u r e ” KYNA d e c o m p o s e s wi t hi n 2 h o u r s w h i c h is d el ay e d b y a p p lic a ti o n of c o m p o si t e s . T h e r el e a s e r a t e is 5 5 % a f t e r 5 0 0 m i n u t e s in t h e c a s e of b o t h B SA/KYNA a n d t h e B SA/KYNA/PAH
c o m p o si t e s a t 2 5 . 0 °C. At h i g h e r t e m p e r a t u r e , t h e d e c o m p o si tio n of t h e KYNA is f a s t er, si g nific a n t d e c r e a s e w a s o b s e r v e d in t h e c o n c e n t r a ti o n of t h e KYNA af t e r 5 0 0 m i n . If w e s t u d y t h e fir s t h o u r it c a n b e s e e n t h a t t h e a m o u n t of KYNA d i s s olvi n g f r o m t h e C S N P s ( 2 3 % a t 2 5 . 0 ° C) is si g n ific a n tly lo w e r t h a n t h e a m o u n t d i s s olvi n g f r o m t h e B SA/KYNA c o m p o si t e s ( 4 0 % a t 2 5 . 0 ° C). At 3 7 . 5 ° C t h e d i s s ol u tio n is f a s t e r : fo r a p p li c a tio n of C S N P s 4 4 % of t h e KYNA is lib e r a t e d , w h il e in c a s e of B SA/KYNA c o m p o si t e t hi s v al u e is 5 3 % a f t e r 6 0 m i n . C o n t r oll e d r e l e a s e w a s a c h i ev e d b y t h e a p p lic a tio n of C S N P s, t h e di s s ol u tio n of t h e KYNA m o l e c ul e s w e r e p e r m a n e n t a n d c o n ti n u o u s .
Kin e ti c m o d el s (z e r o-o r d e r r a t e , fi r s t-o r d e r r a t e a n d H i g u c hi m o d el) w e r e a p p li e d t o d e s c r i b e t h e r e l e a s e m e c h a n i s m of t h e KYNA a t 2 5 . 0 ° C a n d 3 7 . 5 ° C (Va r g a a t e l., 2 0 1 5 , S h o ai b e t al., 2 0 1 0 ). T h e c o r r el a tio n c o effici e n t s (R2) a n d t h e r a t e c o n s t a n t (kd) v al u e s a r e s u m m a r iz e d i n Ta b l e 1 . T h e H i g u c hi m o d el, w h i c h d e s c r i b e s t h e d iff u sio n-c o n t r oll e d m e c h a n i s m , fit s b e s t fo r t h e r e l e a s e of t h e KYNA a t b o t h t e m p e r a t u r e s . T h e fir s t-o r d e r r a t e a n d t h e H i g u c h i m o d el a r e s p e cific fo r t h e B SA/KYNA s y s t e m (R2 > 0 . 9 8 ). I t m e a n s t h a t t h e d i s s ol u ti o n d e p e n d s o n b o t h t h e c o n c e n t r a ti o n (fir s t-o r d e r ) a n d t h e d iff u si o n ( Hi g u c hi). T h e z e r o-o r d e r r a t e m o d e l c h a r a c t e r iz e s t h e o n e-l ay e r e d c o m p o si t e s (R2 > 0 . 9 8 ). T hi s s u g g e s t s t h a t t h e d r u g r e l e a s e r a t e is in d e p e n d e n t f r o m t h e c o n c e n t r a t io n of t h e d i s s olv e d s u b s t a n c e . T h e r ef o r e , c o n s t a n t d r u g c o n c e n t r a ti o n c a n b e m a i n t a i n e d b y t h e a p p lic a ti o n of t h e C S N P s a t b o t h t e m p e r a t u r e s . C o m p a r e d t o t h e c e r t ai n r a t e c o n s t a n t s c al c ul a t e d fo r B SA/KYNA/PAH C S N P s a n d fo r p u r e KYNA o n e o r d e r of m a g n i t u d e d iff e r e n c e is o b s e r v e d (Ta bl e 1 ). T hi s l e a d s t o t h e c o n cl u si o n t h a t t h e a p p lic a ti o n of p oly el e c t r oly t e s h ell d el ay t h e d i s s ol u tio n of d r u g m ol e c u l e s i m pl e m e n ti n g t h e c o n t r oll e d d r u g r el e a s e p r o c e s s .
We h a v e a s s e s s e d t h e p e r m e a b ility of B SA/KYNA/PAH in c o m p a r i s o n t o KYNA u si n g a n in vi tr o BBB m o d el. KYNA o r B SA/KYNA/PAH w a s lo a d e d i n t o t h e u p p e r / blo o d c o m p a r t m e n t i n a fin al c o n c e n t r a ti o n of 2 0 µ M KYNA a n d s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m t h e lo w e r / b r a i n c o m p a r t m e n t of t h e m o d el af t e r 1 h i n c u b a ti o n . T h e p e r m e a b ility c o effici e n t of KYNA w a s
3 . 7 1 × 1 0-6 c m / s ( ± 3 . 6 4 × 1 0-7 c m / s), w h i c h w a s c o m p a r a b l e t o t h e p e r m e a b ility of s o di u m flu o r e s c ei n ( 2. 9 6 × 1 0-6 c m / s ± 8 . 7 8 × 1 0-7 c m / s , n o t s h o w n ) m e a s u r e d p a r a ll el wi t h t h e p e r m e a b ility of t h e t e s t s u b s t a n c e s . T h e p e r m e a b ility of KYNA f r o m t h e B SA/KYNA/PAH c o m p o si t e, h o w e v er, w a s si g n ific a n tly ( 1. 9 ti m e s ) h i g h e r : 6 . 9 5 × 1 0-6 c m / s ( ± 1 . 2 6 × 1 0-6 c m / s ) (F i g . 7 ). O u r r e s u l t s i n di c a t e t h a t KYNA f r o m t h e B SA/KYNA/PAH c o m p o si t e h a s a m u c h h i g h e r p e r m e a b ili ty t h r o u g h t h e BBB t h a n f r e e KYNA. I t is w ell-k n o w n t h a t t h e PAH is a p o si tiv ely c h a r g e d p oly m e r ; t h e r ef o r e , c o m p o si t e s e n c a p s u l a t e d i n PAH a r e g o o d c a n d i d a t e s fo r a d s o r p tiv e-m e d i a t e d t r a n s p o r t . T hi s p r o c e s s is t ri g g e r e d b y el e c t r o s t a ti c in t e r a c ti o n s b e t w e e n t h e p o si tiv ely c h a r g e d s u b s t a n c e a n d t h e n e g a t iv ely c h a r g e d g ly c o c alyx of BBB e n d o t h eli al c ell s (G a b a t h u l er, 2 0 1 0 ; L u, 2 0 1 2 ; Ab b o t t, 2 0 1 3 ). F u n c ti o n aliz a tio n of t h e s u r f a c e of N P s wi t h p o si tiv ely c h a r g e d b i o m ol e c ul e s h a s b e e n r e p o r t e d s e v e r al ti m e s ( M a s s e r i ni, 2 0 1 3 ).
I n t h e a n i m al e x p e r i m e n t s , i n t h e c o n t r ol g r o u p t h e a m p li t u d e s of t h e S E P s d i d n o t c h a n g e d d u r i n g t h e r e g i s t r a ti o n p e r i o d ( F i g . 8 ( A ) ). T h e in t r a p e r i t o n e al i nj e c ti o n of KYNA a n d L-KYN a l s o di d n o t c a u s e si g n ific a n t c h a n g e s i n t h e a m p li t u d e s . ( F i g . 8 ( B ) ). I n effic a cy of KYNA is u n d e r s t a n d a b l e: KYNA h a r d ly c r o s s e s t h e bl o o d-b r a i n b a r r i e r (BBB). T h e e x pl a n a tio n fo r L-KYN m i g h t b e i n t h e ti m e c o u r s e of m e t a b olis m (L-KYN KYNA) a n d / o r t h e lo w q u a n ti ty of n e w ly p r o d u c e d KYNA. Aft e r
→
a d m i ni s t r a tio n of BSA/PAH, t h e r e w a s a n i m m e d i a t ely d e c r e a s e in t h e a m p li t u d e s fo r 1 0-1 5 m i n . L a t e r o n , it t u r n e d t o sli g h t f a cilit a tio n . H o w e v er, t h e s e c h a n g e s s h o w e d n o si g nific a n t d iff e r e n c e c o m p a r e t o t h e c o n t r ol. (F i g . 8 ( C ) ). E x p e r i m e n t s in w h i c h t h e a n i m al s r e c eiv e d B SA/KYNA/PAH t r e a t m e n t , a m a r k e d a n d lo n g-l a s ti n g si g nific a n t d e c r e a s e in t h e a m p lit u d e s c o ul d b e o b s e r v e d . H a lf a n h o u r a f t e r t h e t r e a t m e n t t h e a m p li t u d e s d e c r e a s e d t o t h e 6 0 % of c o n t r ol. T hi s s u p p r e s si n g eff e c t w a s k e p t fo r 6 0 m i n a n d t h e n t h e a m p li t u d e s s t a r t e d slo wly t o in c r e a s e a n d al m o s t r e s u m e d t h e c o n t r ol l ev el ( F i g . 9 ). S o m e p a r t s of t h e n e u r o bi olo gi c al r e s u l t s a r e n o t s u r p r i si n g : si n c e a p p e a r a n c e of t h e e x c ell e n t p a p e r of F u k u i a n d h i s c o-w o r k e r s it s k n o w n t h a t KYNA c r o s s
h a r d ly t h e BBB ( F u k u i e t al., 1 9 9 1 ). T hi s m a y e x pl ai n t h a t i. p.
a d m i ni s t r a tio n of KYNA d i d n o t in d u c e a n y si g nific a n t c h a n g e s i n t h e a m p li t u d e s of s o m a t o s e n s o r y e v o k e d r e s p o n s e s . T h o u g h , L-KYN ( p r o-d r u g of KYNA) is a c tiv ely t r a n s p o r t e d a c r o s s t h e BBB b y t h e la r g e n e u t r al a m i n o a ci d c a r r i e r s ( F u k u i e t a l., 1 9 9 1 ) a n d it is e n z y m a ti c ally c o n v e r t e d t o KYNA wi t hi n t h e C N S, p r i m a r ily i n t h e a s t r o cy t e s (G uill e m i n e t a l., 2 0 0 1 ), t h e eff e c tiv e n e s s of t h i s c o n v e r s io n p r o b a b ly w a s n o t e n o u g h t o p r o d u c e a m a r k e d d e c r e a s e i n t h e a m p li t u d e s of S E P s . T h o u g h , o n e h o u r af t e r L-KYN a d m i ni s t r a ti o n a sli g h t d e c r e a s e i n t h e a m p li t u d e s s t a r t e d it p r o v e d n o t t o b e si g nific a n t . I n t e r e s ti n gly, B SA/PAH a d m i ni s t r a ti o n r e s u l t e d i n a t r a n si e n t a n d sli g h t d e c r e a s e i n t h e a m p li t u d e , w h i c h l a t e r o n t u r n e d in t o sli g h t f a cilit a ti o n . U nf o r t u n a t ely, a t t h i s m o m e n t w e d o n’ t k n o w t h e e x pl a n a ti o n of t h e s e sli g h t c h a n g e s .
H o w e v er, i n t h o s e e x p e r i m e n t s i n w h i c h KYNA wi t h C S N P s w e r e a d m i ni s t e r e d a lo n g-l a s ti n g si g n ific a n t d e c r e a s e i n t h e a m p li t u d e s of S E P s w e r e o b s e r v e d . I t s u g g e s t s t h a t KYNA wi t h C S N P s g o t t h r o u g h t h e BBB a n d w a s a b l e t o d i mi ni s h t h e e x ci t a t o r y e v e n t s i n t h e c o u r s e of g e n e r a ti o n of S E P s, wi t hi n t h e C N S .
C o n c l u s i o n
T hi s s t u d y h i g hli g h t e d t h a t a o n e-p o t s y n t h e si s t e c h n i q u e is a p p li c a bl e t o t h e d e v el o p m e n t of C S N P s fo r e n c a p s ul a ti n g KYNA. By a p p lic a tio n of c o r e-s h ell s t r u c t u r e w e w e r e a b l e t o ov e r c o m e t h e BBB. T h e r e v e r si bl e b i n d i n g of d r u g m o l e c u l e s c a u s e s a sli g h t c h a n g e i n t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e of t h e B SA w hil e a si g nific a n t p e r t u r b a ti o n w a s o b s e r v e d d u e t o t h e eff e c t of t h e p oly el e c t r oly t e s . H o w e v er, t h e s t r u c t u r e c h a n g e d : t h e c h a i n s’ of t h e p r o t ei n u n f ol d e d , t h e B SA/KYNA n a n o c o m p o si t e s w e r e e n clo s e d b y PAH w hi c h is c o nfi r m e d t h e r e s u l t s of t h e in vi tr o e x p e r i m e n t s . Acco r d i n g t o t h e z e r o-o r d e r ki n e ti c m o d e l t h e c a l c ul a t e d r a t e c o n s t a n t cl e a r ly c o nfi r m t h a t t h e d r u g r e l e a s e p r o c e s s c a n b e w ell- c o n t r oll e d u si n g C S N P s. T h e effici e n t a p p lic a tio n of C S N P s is s u p p o r t e d b y t h e n e u r o b iolo gi c al e x p e r i m e n t s a s w ell. T h e KYNA a n d it s p r o-d r u g , t h e L-KYN di d n o t in d u c e a n y c h a n g e s i n t h e a m p li t u d e s of s o m a t o s e n s o r y
e v o k e d r e s p o n s e s . I n c o n t r a s t wi t h t h i s o b s e r v a tio n , t h e e n c a p s u l a t e d KYNA s h o w e d a si g nific a n t d e c r e a s e in t h e e v o k e d si g n al s , s o t h e KYNA s u c c e s sf ully p e n e t r a t e d t h r o u g h t h e BBB b y C S N P s . Aft e r t h e KYNA g o t in t o t h e C N S it t a k e s eff e c t a n d d i mi ni s h t h e S E P s v al u e . T h e r e s u l t s of t h e in vi tr o e x p e r i m e n t s a r e in g o o d a g r e e m e n t wi t h t h e in vi v o el e c t r o p h y siolo gi c al d a t a , b o t h m e t h o d s c o nfi r m t h a t t h e N P s a r e a b l e t o p r o m o t e t h e p e n e t r a ti o n of KYNA in t o t h e b r a i n . Ex p e r i m e n t al d a t a in di c a t e t h a t KYNA m a y b e n e u r o p r o t e c tiv e a n d it m a y b e of t h e r a p e u ti c v al u e fo r s e v e r al n e u r olo gi c al d i s o r d e r s . N a n o c a r r i e r s y s t e m s a r e s u g g e s t e d t o b e p r o mi si n g m e t h o d s fo r C N S d r u g d eliv e ry, a n d p o t e n ti al c a n d i d a t e s fo r fu t u r e d r u g d e v el o p m e n t .
A c k n o w l e d g e m e n t
T hi s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y t h e E u r o p e a n U n io n a n d t h e S t a t e of H u n g a ry, c o-fin a n c e d b y t h e E u r o p e a n S o ci al F u n d i n t h e fr a m e w o r k of TÁMOP-4 . 2 . 2 .A-1 1 / 1/KO NV-2 0 1 2-0 0 4 7 , TÁMOP-4 . 2 . 6-1 5 / 1-2 0 1 5-0 0 0 2 , TÁMOP-4 . 2 . 1 . C-1 4 / 1/KO NV-2 0 1 5-0 0 1 3 , t h e H u n g a r i a n R e s e a r c h F u n d (OTKA P D-1 0 0 9 5 8 , K-1 0 0 8 0 7 , K 1 1 6 3 2 3 , 1 0 5 0 7 7 ). I.W. b y t h e Já n o s Boly ai R e s e a r c h F ello w s hi p of t h e H u n g a r i a n Ac a d e m y of S ci e n c e s (BO/ 0 0 3 2 0 / 1 2 / 8 ), t h e p r oj e c t TÁMOP-4 . 2 . 2 .A-1 1 / 1 /KO NV-2 0 1 2-0 0 5 2 b y H u n g a r i a n B r ai n R e s e a r c h P r o g r a m m ( NAP, G r a n t N o . KTIA-1 3-NAP-A- III/ 1 9 a n d KTIA-1 3-NAP-A-II/ 1 7) b y E U R O H EADPAI N ( F P 7-H e a l t h 2 0 1 3- I n n o v a tio n , G r a n t N o 6 0 2 6 3 3 ) b y t h e MTA-S ZT E N e u r o s ci e n c e R e s e a r c h G r o u p of t h e H u n g a r i a n Ac a d e m y of S ci e n c e s a n d t h e U n iv e r si ty of S z e g e d .
R e f e r e n c e s
Ab b o t t , NJ., 2 0 1 3 . Blo o d-b r a i n b a r r i e r s t r u c t u r e a n d fu n c tio n a n d t h e c h a ll e n g e s fo r C N S d r u g d eliv e ry. J I n h e r i t M e t a b Dis. 3 6 , 4 3 7-4 9 . As hj a ri, M ., Kh o e e , S., M a h d a vi a n , A.R., R a h m a t ol a h z a d e h R., 2 0 1 2 . S elf- a s s e m b l e d n a n o mi c ell e s u si n g PLGA–P EG a m p h i p h ilic b l o c k c o p oly m e r fo r in s uli n d eliv e r y: a p h y si c o c h e m i c al inv e s ti g a ti o n a n d d e t e r m i n a ti o n of C M C v al u e s . J. M a t er. S ci.: M a t er. M e d . 2 3 , 9 4 3– 9 5 3 .
Bo w m a n , K., L e o n g , K.W., 2 0 0 6 . C hi t o s a n n a n o p a r ti cl e s fo r o r al d r u g a n d g e n e D eliv e ry. I n t . J. N a n o m e d i ci n e 1 , 1 1 7– 1 2 8 .
C a r p e n e d o , R., Pi t t al u g a , A., C o zzi, A., Att u c ci, S., G alli, A., R ai t e r i, M ., M o r o ni, F., 2 0 0 1 . P r e s y n a p ti c ky n u r e n a t e-s e n si tiv e r e c e p t o r s i n hi bi t g l u t a m a t e r e l e a s e . E ur. J. N e u r o s ci., 1 3 , 2 1 4 1-2 1 4 7 .
C s a p ó , E., M ajl á t h , Z., Ju h á s z, Á., Ro ó s z, B., H e t é n yi, A., Tajti, J., Tót h , G.K., Vécs ei, L., D é k á ny, I., 2 0 1 4 . D e t e r m i n a tio n of b i n di n g c a p a b ili ty a n d a d s o r p tio n e n t h al p y b e t w e e n H u m a n Gl u t a m a t e R e c e p t o r (Gl u R 1) p e p ti d e f r a g m e n t s a n d ky n u r e n i c a ci d b y s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e e x p e r i m e n t s . C oll. S u rf. B. 1 2 3 , 9 2 4-9 2 9 .
C s a p ó , E., Bo g ár, F., Ju h á s z, Á., S e b k , D., S z olo m áj er, J., M ajl á t h , Z.,ő Tót h , G.K., Véc s ei, L., D é k á ny, I., 2 0 1 5 . D e t e r m i n a tio n of b i n di n g c a p a b ility a n d a d s o r p ti o n e n t h a l p y b e t w e e n H u m a n Gl u t a m a t e R e c e p t o r (Gl u R 1) p e p ti d e f r a g m e n t s a n d k y n u r e n i c a ci d b y s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e e x p e r i m e n t s : P a r t 2 , I n t e r a c ti o n of Gl u R 1 2 7 0-3 0 0 wi t h KYNA. C oll. S u rf. B. 1 3 3 , 6 6-7 2 .
D a rli n g t o n , L.G., M a c k ay, G. M., F o r r e s t , C. M., S t oy, N., G e o r g e C., S t o n e T.W., 2 0 0 7 . Alt e r e d ky n u r e n i n e m e t a b olis m c o r r el a t e s w i t h i nf a r c t vol - u m e in s t r o k e . E ur. J. N e u r o s ci., 2 6 , 2 2 1 1-2 2 2 1 .
Elzo g h by, A.O., S a my, W.M., El gi n dy, N.A., 2 0 1 2 . Alb u mi n-b a s e d n a n o p a r ti cl e s a s p o t e n ti al c o n t r oll e d r el e a s e d r u g d eliv e r y s y s t e m s , J.
C o n t r ol. R el e a s e 1 5 7 , 1 6 8– 1 8 2 .
F ej e s , A., P a r d u t z, A., Toldi, J., Véc s ei, L., 2 0 1 1 . Kyn u r e n i n e m e t a b oli t e s a n d m i g r ai n e: e x p e r i m e n t al s t u d i e s a n d t h e r a p e u ti c p e r s p e c tiv e s.
C u rr. N e u r o p h a r m a c ol, 9 , 3 7 6-8 7 .
Fil e n k o, A., D e m c h e n k o, M ., M u s t af a e v a , Z., O s a d a , Y., M u s t af a e v M ., 2 0 0 1 . F l u o r e s c e n c e s t u d y of C u2 +-in d u c e d in t e r a c tio n b e t w e e n a l b u mi n a n d a n i o ni c p oly el e c t r oly t e s , Bio m a c r o m ol e c ul e s 2 , 2 7 0– 2 7 7 .
F u k u i, S. , S c h w a r c z, R., R a p o p o r t , S.I., Tak a d a , Y., S m i t h , Q.R., 1 9 9 1 . Blo o d-b r a i n b a r r i e r t r a n s p o r t of k y n u r e n i n e s : i m plic a tio n s fo r b r a i n s y n t h e si s a n d m e t a b olis m . J. N e u r o c h e m . 5 6 , 2 0 0 7-2 0 1 7 .
F u k u s hi m a , T., Mi t s u h a s h i, S., To miy a, M ., Iyo, M ., H a s h i m o t o , K., Toyo ' o k a , T., 2 0 0 7 . D e t e r m i n a ti o n of ky n u r e n i c a ci d i n h u m a n s e r u m a n d it s c o r r el a ti o n wi t h t h e c o n c e n t r a ti o n of c e r t ai n a m i n o a ci d s , Cli n.
C hi m . Act a 3 7 7 , 1 7 4– 1 7 8 .
F ü l ö p , F., S z a t m á r i, I., Tol di, J., Véc s ei, L., 2 0 1 2 . M o d ific a ti o n s o n t h e c a r - b o xylic fu n c tio n of ky n u r e n i c a ci d . J N e u r al .T r a n s m . 1 1 9 , 1 0 9-1 1 4 . F ü v e si, J., S o ml ai, C., N é m e t h , H . , Var g a , H . , Kis, Z., F a r k a s , T., Ká r oly, N., D o b s z ay, M . , P e n k e , Z., P e n k e , B., Véc s ei , L., Toldi, J., 2 0 0 4 . C o m - p a r a tiv e s t u d y o n t h e eff e c t s of ky n u r e n i c a ci d a n d g l u - c o s a m i n e-ky n u r e n i c a ci d . P h a r m a c ol. Bio c h e m . B e h a v . 7 7 , 9 5- 1 0 2 .
G a b a t h u l er, R., 2 0 1 0 . Ap p r o a c h e s t o t r a n s p o r t t h e r a p e u ti c d r u g s a c r o s s t h e b l o o d– b r ai n b a r r i e r t o t r e a t b r ai n di s e a s e s . N e u r o b iol. Di s. 3 7 , 4 8– 5 7 .
G uill e mi n , G.J., Ke rr, S.J., S m y t h e , G.A., S m i t h , D.G., Ka p o or, V., Ar m a ti, P.J., C r oi t o r u , J., B r ew, BJ., 2 0 0 1 . Ky n u r e n i n e p a t h w a y m e t a b o - l i s m i n h u m a n a s t r o c y t e s : a p a r a d o x f o r n e u r o n a l p r o t e c - t i o n . J. N e u r o c h e m . 7 8 , 8 4 2-8 5 3 .
H o m o l a, J., 2 0 0 8 . S u r f a c e Pl a s m o n R e s o n a n c e S e n s o r s fo r D e t e c ti o n of C h e m i c al a n d Biolo gi c al S p e ci e s . C h e m . R ev. 1 0 8 , 4 6 2-4 9 3 .
Kelly, S. M., Je s s , T.J., P ri c e, N.C., 2 0 0 5 . H o w t o s t u d y p r o t ei n s b y ci r c ul a r d i c h r oi s m . Bio c hi m. Bio p h y s. Act a 1 7 5 1 , 1 1 9 – 1 3 9 .
Kl aj n e r t , B., S t a n i sl a w s k a , L., B r y s z e w s k a , M ., P al e c z, B., 2 0 0 3 . I n t e r a c - tio n s b e t w e e n PAMAM d e n d r i m e r s a n d b o vi n e s e r u m a l b u m i n . Bio c hi m. Bio p h y s. Act a 1 6 4 8 , 1 1 5– 1 2 6 .
Li e d b e r g , B., L u n d s t r ö m , I., S t e n b e r g , E ., 1 9 9 3 . P ri n ci pl e s of b i o s e n si n g wi t h a n e x t e n d e d c o u pli n g m a t r ix a n d s u rf a c e p l a s m o n r e s o n a n c e . S e n s o r s a n d Ac t. B. 1 1 , 6 3-7 2 .
L u, C.T., Z h a o , Y.Z., Wo n g , H .L., C ai, J., P e n g , L., Ti a n , X.Q., 2 0 1 4 . C u r r e n t a p p r o a c h e s t o e n h a n c e C N S d eliv e r y of d r u g s a c r o s s t h e b r a i n b a r r i - e r s . I n t. J. N a n o m e d i ci n e 9 , 2 2 4 1- 2 2 5 7 .
L u W., 2 0 1 2 . Ad s o r p tiv e-m e d i a t e d b r a i n d eliv e r y s y s t e m s . C u r r P h a r m Bio t e c h n ol. 1 3 , 2 3 4 0-2 3 4 8 .
M a n d a l, G., B a r d h a n , M ., G a n g u ly, T., 2 0 1 0 . I n t e r a c tio n of b o vi n e s e r u m al b u m i n a n d al b u m i n-g ol d n a n o c o nj u g a t e s wi t h L-a s p a r ti c a ci d . A s p e c t r o s c o pi c a p p r o a c h , C olloi d s S u rf., B 8 1 , 1 7 8– 1 8 4 .
M a r o si, M ., N a gy, D., F a r k a s , T., Kis, Z., R óz s a , É., R o b o t k a , H . , F ü l ö p , F., Véc s ei, L., Toldi, J., 2 0 1 0 . A n o v el k y n u r e n i c a ci d a n a l o g u e : a c o m p a r i s o n wi t h ky n u r e n i c a ci d , An i n vit r o el e c t r o p h y si olo gi c al s t u dy. J. N e u r a l.
T r a n s m . 1 1 7 , 1 8 3– 1 8 8 .
M a s s e r i ni, M ., 2 0 1 3 . N a n o p a r ti cl e s fo r b r a i n d r u g d eliv e ry. I SR N Bio c h e m . 2 3 8 4 2 8 .
N a gy, K., Pl a n g ár, I., T u k a , B., G ell é r t , L., Var g a , D., D e m e t er, I., F a r k a s , T., Kis, Z., M a r o si, M ., Z á d o ri, D., Kliv é n yi, P., F ü l ö p , F., S z a t m á r i, I., Véc s ei, L., Toldi, J., 2 0 1 1 . S y n t h e s i s a n d b i olo gic al eff e c t s of s o m e ky n u r e n i c a ci d a n a l o g s . Bio o r g . M e d . C h e m . 1 9 , 7 5 9 0-7 5 9 6 .
N a g y o s zi, P., Wilh el m, I., F a r k a s , A.E., F az a k a s , C., D u n g , N.T., H a s k ó , J., Kriz b ai, I.A., 2 0 1 0 . Ex p r e s si o n a n d r e g u l a tio n of t oll-lik e r e c e p t o r s i n c e r e b r a l e n d o t h eli al c ell s N e u r o c h e m I n t. 5 7 , 5 5 6-5 6 4 .
P e n g , X., Yao, D., P a n , Y., Yu, Q., N i, S., Bi a n , H . , H u a n g , F., Li a n g , H . , 2 0 1 1 . S t u d y o n t h e s t r u c t u r al c h a n g e s of b o vi n e s e r u m a l b u m i n wi t h eff e c t s o n p oly d a ti n b i n d i n g b y a m u l ti t e c h n i q u e a p p r o a c h , S p e c - t r o c h i m . Act a M ol. Bio m ol. S p e c t r o s . 8 1 , 2 0 9– 2 1 4 .
R af a ti, A., Bo u s s a h el, A., S h a k e s h eff, K. M., S h a r d , A.G., R o b e r t s , C.J., C h e n , X., S c u r r, D.J., Ri g b y-Si n gl e t o n , S., W hi t e si d e , P., Alex a n d er, M . R., D avi e s, M .C., 2 0 1 2 . C h e m i c al a n d s p a ti al a n a ly si s of p r o t ei n lo a d e d PLGA m i c r o s p h e r e s fo r d r u g d eliv e r y a p p li c a tio n s . J. C o n t r ol. R el e a s e 1 6 2 , 3 2 1– 3 2 9 .
S a s , K., R o b o t k a , H ., Tol di, J., Véc s ei L., 2 0 0 7 . Mi t o c h o n d r i a , m e t a b olic d i s t u r b a n c e s , oxi d a tiv e s t r e s s a n d t h e ky n u r e n i n e s y s t e m , w i t h fo c u s o n n e u r o d e g e n e r a tiv e d i s o r d e r s . J. N e u r ol. S ci. 2 5 7 , 2 2 1– 2 3 9 .
S e b k, D; C s a p ó , E ., ő P r e o a n i n , T., Bo h u s , G., Kall ay, N., D é k á ny, I., 2 0 1 3 .č Ad s o r p ti o n of I b u p r of e n a n d D o p a m i n e o n F u n c ti o n aliz e d Gol d U si n g S u rf a c e Pl a s m o n R e s o n a n c e S p e c t r o s c o p y a t S oli d-Li q ui d I n t e r f a c e . C r o a t . C h e m . Act a 8 6 , 2 8 7– 2 9 5 .
S h o ai b , M . H ., Al S a b a h Si d di qi, S., You s uf, R.I., Z a h e er, K., H a n if, M ., R e - h a n a , S., Ja b e e n , S., 2 0 1 0 . D ev elo p m e n t a n d Ev al u a tio n of H y d r o p h ilic C olloi d M a t r ix of F a m o ti di n e Ta bl e t s , AAPS P h a r m . S ci. Tec h . 2 , 7 0 8-7 1 8 .
Silv a-Ad ay a , D., P é r e z-D e L a C r u z, V., Ville d a-H e r n á n d e z, J., C a r - r illo-M o r a , P., G o n z ál e z- H e r r e r a , I.G., G a r cí a , E ., C olí n-B a r e n q u e , L., P e d r a z a-C h a v e r r í, J., S a n t a m a r í a , A., 2 0 1 1 . P r o t e c tiv e eff e c t of L- ky n u r e n i n e a n d p r o b e n e ci d o n 6-h y d r o xy d o p a m i n e- in d u c e d s t r i a t al t oxi c - ity i n r a t s: i m pli c a tio n s of m o d u l a ti n g ky n u r e n a t e a s a p r o t e c tiv e
s t r a t e gy. N e u r o t o xic ol Te r a t ol, 3 3 , 3 0 3-3 1 2 .
S t o n e , T.W., 1 9 9 3 . N e u r o p h a r m a c olo gy of q u i n oli nic a n d ky n u r e n i c a ci d s.
P h a r m a c ol. R ev. 4 5 , 3 0 9– 3 7 9
Toldi, J., Joó, F., F e h er, O., Wolff, J.R., 1 9 8 8 . M o difi e d di s t ri b u tio n p a t t e r n s of r e s p o n s e s in r a t vis u al c o r t e x in d u c e d b y m o n o c u l a r e n u cl e a tio n . N e u r o s ci e n c e . 2 4 , 5 9-6 6
Toldi, J., R ojik, I., F e h er, O., 1 9 9 4 . N e o n a t a l m o n o c ul a r e n c u l e a tio n-i n - d u c e d c r o s s-m o d al eff e c t s o b s e r v e d in t h e c o r t e x of a d u l t r a t . N e u r o - s ci e n c e , 6 2 , 1 0 5-1 1 4 .
Var g a , N., B e n k , M ., S e b k , D., D é k á ny, I., 2 0 1 4 . ő ő B SA/ p oly el e c t r oly t e c o r e-s h ell n a n o p a r ti cl e s fo r c o n t r oll e d r e l e a s e of e n c a p s u l a t e d ib u p r o - fe n . C olloi d s S u rf. B 1 2 3 , 6 1 6– 6 2 2 .
Var g a , N., B e n k , M ., S e b k , D., Bo h u s , G., Ja n ov á k , L., D é k á ny, I., 2 0 1 5 .ő ő M e s o p o r o u s silic a c o r e-s h ell c o m p o si t e fu n c tio n aliz e d wi t h p oly el e c - t r oly t e s fo r d r u g d e liv e ry, Mi c r o p or. M e s o p or. M a t . 2 1 3 , 1 3 4-1 4 1 .
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