1.4. Enzimek gátláskinetikája (14.1.).

1.4. Enzimek gátláskinetikája (14.1.).

Az egy szubsztrátos egy enzimes reakciók kinetikája

megváltozhat, ha olyan anyagot adunk a reakcióelegyhez , amely speciálisan kötôdhet az enzimmolekulához , ezáltal megváltoztatja annak eredeti mûködési módját. A kiváltott hatás lehet reverzibilis, vagy irreverzibilis gátlás (inhibició) , ill. aktiválás.

1.4.1. Irreverzibilis gátláskinetika.

Abban az esetben, ha a gátlószer irreverzibilisen kötôdik az enzim-molekulához tulajdonképpen az aktiv, mûködôképes

enzimkoncentráció csökken, ezáltal csökken a reakció sebessége is.

A gátlószer olyan vegyület lehet, amely specifikusan reagál az enzim- molekula kémiailag támadható fehérje oldalláncaival és legtöbbször

kovalens

kötés alakul ki a két partner között. A reakció lehet aktivcentrum specifikus

és lehet aspecifikus. Az elsô esetben olyan szubsztrát-analógot használunk,

amely létrehoz egy enzim-szubsztrát analóg komplexet, majd a támadócso- portja révén reagál az aktivcentrum valamelyik funkciós csoportjával. Például a toluol- o-szulfonilfluorid (fenilmetil-szulfonilfluorid, PMSF ) specifikusan létre tud hozni ESa -komplexet a kimotripszin enzimmel. A kimotripszin ugyanis normális esetben olyan peptidkötéseket tud hasitani, amelyek a hasitóhelyen

aromás oldalláncot ( fenilalanin, tirozin, hisztidin, triptofán ) tartalmaznak. Ezek az oldalláncok az enzimmolekula felületén található aktivcentrum "hidrofób zsák"-jában kötôdnek

meg(14.1.ábra:

:

CH CH

2

R 1 NH C

O

NH R 2 OH



CH CH

2

R 1 NH C

O

NH R 2

O 2

14.1. ábra. Kimotripszin peptidkötés hasitása.

A kötôdés után lejátszódik a kötéshasadás és létrejön az enzim szerin- OH csoportjával egy átmeneti acil-enzim EP-komplex.

A PMSF nagyon hasonlit pl. a fenilalanin oldallánchoz , igy ahhoz hasonlóan hidrofób komplexet képez a kimotripszinnel, majd reagál a szerin- OH csoporttal (14.2.ábra):

SO2 F OH CH3

SO2 CH3

+ HF O

14.2. ábra. Kimotripszin reakciója PMSF-fel.

A komplexképzés és az O-észterképzés sémája a következô : E OH PMSF

k

  k

  

1

1 E_^_PMSF^OH  ^k² E O SMP HF   Az aktiv enzimkoncentráció csökkenésének sebessége :

 

 d E

dt

k E PMSF K_m PMSF

2 (14.1)

Növelve a reagens koncentrációját itt is telitési görbét kapunk és meghatározható a Km és a k2 . Ez utóbbi egy másodrendû sebességi állandó. Kis reagens koncentrációnál ( [PMSF]<<K m ) a (14.1) képlet :

d E  dt

k E PMSF K_m

2 és k2= 14900 mol-1min-1

A Km szintén kimotripszinre 5,6 . 10-3 mol.

Nagy PMSF koncentrációnál :d E 

dt k E₂ ; a k2= 3,1 min-1 ( elsôrendû !).

Az aktivcentrumban található fehérje-oldalláncokon a nem specifikusan kötôdô reagensek is okozhatnak irreverzibilis gátlást.

Ezeket a reagenseket úgy választják meg , hogy azok enyhe körülmények között reagáljanak az adott oldallánccal ( ne

denaturálják az enzimmolekulát ), a reakció az adott oldalláncra lehetôleg legyen specifikus (más tipusú oldallánccal ne reagál- jon ) és mérhetô legyen a reakció lefolyása ( lehetôleg érzékeny optikai módszerekkel ).

Néhány példa ilyen tipusú reagensre :

- Aminocsoport specifikus pl. a 2,4,6- trinitro-benzol-szulfonsav (TNBS) , amely a lizin  aminocsoportjával reagál:

NO2 NO2 NO2 HO3S

E-NH2+

NO2 NO2 NO2

E- NH + H2SO3

A reakció enyhe körülmények között lejátszódik és a nitrocsoportok miatt fotometriásan jól követhetô.

- Szulfhidril-csoport specifikus pl. a p-klór-merkuri-benzoát (pCMB ) E-SH + Cl-Hg COOH E-S-Hg COOH

- Tirozin-csoport specifikus reagens pl. a tetra-nitrometán :

C(NO2)

E OH

NO2

- Egyéb csoportspecifikus reagens a hisztidinre a dietil-

pirokarbonát, triptofánra a 2-hidroxi-5-nitro-benzilbromid, argininre az 1,2-ciklohexán-dion, a karboxilcsoportokra a karbodiimides

amidképzés, stb.

Ezek a reagensek nem feltétlenül rendelkeznek azonos reaktivitással a fehérje-molekula különbözô helyein található azonos oldalláncokra vonatkozóan. Ha reagens-felesleg jelenlétében mérjük a reakció idôfüggését, akkor azonos reaktivitás esetén elsôrendû kinetikát kell kapnunk , mégis sokszor azt tapsztaljuk, hogy ábrázolva a le nem reagált csoportok logaritmusát az idô függvényében nem kapunk lineáris összefüggést (14.3.ábra):

idô 0

0.2 0.4 0.6 0.81 1.2 1.4 1.6 1.8 2

0 2 4

1.rendú érintô1 mért érintô2

14.3.ábra. Enzimfehérjék oldalláncainak módositás-kinetikája.

A 14.3. ábra alapján megállapithatjuk, hogy azonos reaktivitású oldalláncok esetén az idôgörbe lineáris, az 1.rendû reakció

egyenlete:

ln (A-x)= k*t

Két különbözô reaktivitású oldallánc esetén a mért görbe két 1.

rendû reakcióra bontható (érintô1 és érintô2) : ln (A-x) = ( k1+k2)*t

ahol A= az enzimmolekula adott oldalláncainak száma, x = a reagált oldalláncok száma.

Továbbá az is megállapitható, hogy az enzimek reagáló csoportjai általában 3 részre oszthatók:

- gyorsan reagálók ( k1 sebességi állandóval ), - lassan reagálók ( k2 sebességi állandóval ), - nem reagálók, un. rejtett csoportok.

A reaktivitás különbségek is részben sztérikus, ill. a mikrokörnyezet eltérô jellegével (hidrofil, hidrofób) magyarázhatók.

A mért görbe érintôinek ordináta-metszet arányaiból az eltérô reaktivitású csportok száma is meghatározható.

Az egyes idôminták kinetikai vizsgálatával az is eldönthetô, hogy a reagált oldallánc a szubsztrát megkötésében, vagy magában a lejátszódó katalizált kémiai reakcióban játszik-e szerepet. Pl.

szubsztrát-analógos affinitás kromatográfiával vizsgálva az egyes idômintákat és fentiekhez hasonló ábrázolást alkalmazva

(14.4.ábra):

idô 0

0.2 0.4 0.6 0.81 1.21.4 1.6 1.82

0 2 4

1.rendú érintô1 mért érintô2 nem köt

14.4. ábra. Szubsztrát-kötés kinetikája oldallánc-módositásnál.

Ha az eredeti affinitás kromatográfiás kötôdés (K) nem változik, akkor a reagált oldallánc nem szubsztrátkötô. Ha a változás (x) lineáris, akkor 1, vagy több oldallánc azonos szubsztrátkötô, ha viszont a kötôdés változása két egyenessel közelithetô, akkor eltérô szerepû szubsztrátkötô csoportról van szó.

Ugyanezzel a módszerrel vizsgálva az enzim aktivitásának változását a

módositott oldallánc katalitikus jellegére következtethetünk.

Meghatároz-hatjuk a katalitikus aktivitásban résztvevô csoportok számát is(14.2.). Jelöljük az egy enzimolekulában az adott specifikus reagens számára hozzáférhetô azonos oldalláncok számát N-nel , amelybôl x eszenciális a katalitikus aktivitáshoz. Átlagosan n számú adott csoport módositása esetén annak valószinûsége hogy egy adott csoport módosuljon n / N , hogy módosulatlan maradjon 1- (n / N). Ahhoz, hogy az enzimmolekula megtartsa teljes aktivitását az eszenciális csoportoknak módositatlanoknak kell maradniuk , ennek valószinûsége pedig

1 n N

x

 

 



Igy n csoport módositása esetén a megmaradó aktivitás részaránya:

a  

  1 n

N

x

ill. a n

x N

1

 1 (14.2)

Mivel az x értékét nem ismerjük , ezért n függvényében ábrázoljuk az a , az a aza¹², ¹³ értékeket és ahol egyenest kapunk az az x érték adja az eszenciális csoportok számát (14.5.ábra).

A fenti módszerek alkalmazhatók pl. a több aktivcentrum- alegységgel (subsite-tal) rendelkezô keményitôbontó enzimek

vizsgálatára is :

a., A keményitôbôl glükózegységeket lehasitó glükoamiláz enzim legalább 4 subsite-tal rendelkezik, azaz 4 glükózegységet képes megkötni a nem redukáló polimer láncvégén :

G O

G O

G O

G

kötéshasi- tás helye

. . .

n

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 5 10 15

x=2 x=1 x=3

a 1 x

14.5.ábra. Eszenciális csoportok számának meghatározása.

b., A keményitôbôl maltózt ( két glükózegység  1,4-es

glükozidos kötéssel) hasitó -amiláz 5 subsite- on köti meg a polimer nem redukáló végén található 5 glükózegységet :

G O

G O G G

G

O O

. . .

kötéshasitás helye

c., A random és endo-hatású  amilázok között még 9 subsite- tal rendelkezô aktivcentrumot is találtak:

GO GO

GO GO

GO GO

GO GO

G. ..

kötéshasitás helye ..

.

Ezekre az enzimekre meghatározott K m (vagy Ks ) értékek az egyes subsite-ok egyedi szubsztrát-kötésére jellemzô rész K m értékek

összességébôl tevôdnek össze. Az egyes subsite-ok K m-je az

aktivcentrumot alkotó alegységek számával azonos, ill. annál kisebb glüköz-tagszámú 14C-vel jelzett oligomerekkel határozható meg.

Például az  amiláz a redukáló végen jelzett maltotriózt két helyen hasithatja :

2 G-O-G-O-G* ^ G-O-G* + G-O-G + G* + G

Ha a termékeket elválasztjuk és meghatározzuk a

radioaktivitásukat , akkor számolhatók az egyes kötôhelyek affinitására jellemzô szabadenergia változások. A glükóz

radioaktivitása arányos a fenti ábra 5-7 subsite-jának szubsztrátkötô affinitásával, mig a maltóz radioaktivitása a 6-8 alegység

affinitásával. A két radioaktivitás aránya megegyezik a két aktivcentrum rész affinitásának arányával :

G

G2*1 =

* K5-7

K6-8 (14.3)

Mivel az egyes szabadenergia változások számolhatók az affinitásokból :

G RT* lnK_{5 7}

K e

G G G

5 7 RT

5 6 7



  



  

K e

G G G

6 8 RT

6 7 8



  



  

(14.4)

Igy RTln (G1*/ G2*) = - (^G5+ ^G6+^G7)+(^G6+^G7+^G8) =

=_G8-^G5

Tehát igy a 8. és az 5. alegység szabadenergia változásának különbségét kaphatjuk meg. Tovább folytatva nagyobb tagszámú szubsztrátokkal az egyedi szabadenergia változások is számolhatók, s elkészithetjük az egyes enzimek aktivcentrumának " energia-

térképét" , amely jellemzô az egyes subsite-ok szubsztrátkötô képességére.

A fentebb emlitett oldallánc módositások hatását vizsgálva az energia-térképre, az egyes oldalláncok elhelyezkedése is

meghatározható az aktivcentrumon belül.

1.4.2. Reverzibilis gátlás.

Ha a gátlószer disszociábilisan, reverzibilisen kötôdik az enzimmoleku-lához, akkor reverzibilis gátlásról beszélünk. A

reverzibilis gátlás esetén az alábbi általános reakcióséma irható fel:

k2

ES E + P

^k₂

E EIS EI + P

EI

Az E+S lépés Ks , az E+I lépés Ki ,az ES+I lépés ^Ki , mig az EI+S lépés^Ks disszociációs állandóval jellemzett.

Vagyis a gátlószer (inhibitor) reagálhat az enzimmel létrehozva egy EI-komplexet, amelynek disszociációs egyensúlyi állandója :

K E I

i  EI

Természetesen a szubsztrát is komplexet képez az enzimmel, a szokásos disszociációs egyensúlyi állandó :

K E S

s ES (14.5)

Azonban egyes esetekben terner komplex (EIS) is kialakulhat akkor, ha a fenti biner komplexek reagálnak egy inhibitor, vagy egy

szubsztrát molekulával, a megfelelô disszociációs egyensúlyi állandók :

K ES I

i  EIS ill. ^KS ^{EI S}_EIS (14.6) Az ^ szorzó azt jelenti, hogy az inhibitor megváltoztathatja a szubsztrát kötôdését, affinitását. A gátlószer egyes esetekben megváltoztathatja a termékképzés sebességét is , ezt vesszük figyelembe a ^ szorzóval.

Rapid equilibriumot feltételezve mind a négy komplex esetében a gátolt enzimes reakció sebessége :

    ^{ }   ^{ }

v V

k ES k E

ES EIS E

i

m ₂ T   T

2  147

( . ) A teljes (totál) enzimkoncentráció :

[ET]=[E]+[ES]+[EI]+[EIS].

Behelyettesitve és minden enzimformát - a fenti disszociációs egyenletek felhasználásával- [E] , vagy [ES] alakra hozva :

v V

i m

 ES EIS

E ES EI EIS



  

 (14.8)

Az [ES] variáció : EIS I

K ES

i

 ; ^{E  K}_S^{s ES}; ^{EI E I}_{K K S}^{K I ES}

i

s i

  (14.9)

Behelyettesitve : v

V

ES I K ES K

S ES ES K I

K S ES I K ES

i m

i

s s

i i





  







(14.10) [ES]-sel egyszerûsiteni, ^{K S}i közös nevezôre hozni és egyszerûsiteni :

 



 



   

 

^{  }

v_i  

  

V S K I

K K K S K I S I

m i

s i i s

 

 (14.11)

Ebbôl az általános sebességi egyenletbôl vezethetjük le az alábbi reverzibilis gátlástipusokat.

1.4.2.1. Tisztán kompetitiv gátlás.

A szubsztrát és az inhibitor ebben az esetben verseng az enzimmolekulával való komplex-képzésben, de ha már a biner

komplex létrejött , akkor már a kapcsolódott molekula (szubsztrát , vagy inhibitor) megakadályozza a másik vegyület kötôdését , vagyis EIS terner-komplex nem jön létre , igy abból termék sem képzôdhet.

A reakcióséma ebben az esetben : k2

ES  E+P

E

EI

Az általános sebességi egyenlet számlálóját és nevezôjét osszuk el ^Ki-vel:

   

      

v

V S I

K S K

K I K S I K

i

m i

S

i S

i



 

 



  

1 



 _(14.12)

Mivel az általános séma szerinti ^k₂ =0 , igy ^{ 0} , az [EIS]=0 , tehát ^K_i ^{ } , vagyis ^{  } .

Vagyis:



 I

K_i 0 és ^{S I} K_i

 0 ; igy

 

   

v V S

S K 1 I K

i

m

s i



  

 

 (14.13)

egyszerû egyenletet kapjuk a tisztán kompetitiv gátlásra . Hasonló egyenletet kapunk steady state esetben is :

 

d ES

dt = k1[E][S]- ( k-1+k2)[ES]=0 (14.14) [ET]=[E]+[ES]+[EI]=[E]+[ES]+ ^{E I}_K

i

(14.15)

    ^{ }

E E ES

 

I K

T

i



 

 



1 (14.16 Igy :

    ^{ }

      ^{ }

d ES

dt k E ES I K

S k k ES

T

i



 

 



 _  

1 1 2

1

0 (14.17)

[ES] kifejezve :

  ^{     }  

k E S ES I

K k k k

T i

1  1 1 2 1 148

 

 _   ( . )

    ^{ }  ^{ }  ^{ }

v V

k ES k E

k S I

K k k k S

i

m T

i

 

 

 

 _  

2 2

1

1 2 1

1 (14.19)

k1-gyel osztva :

 

   

v V S

S K I

K

i m

m i



  

 



1 (14.20)

Tehát ugyanazt az egyenletet kapjuk , csak Ks helyett Km szerepel (k2 nem hanyagolható el ) .

A konstansok meghatározására a szokásos grafikus módszerek használhatók , de ezekkel nem tudunk külömbséget tenni a K s és Km között ( erre a korábban tárgyalt módszerek alkalmasak ) . Ezért a következôkben a Ks jelölést alkalmazzuk :

a., Lineweaver-Burk , vagy dupla reciprok módszer : Képezzük a vi sebességi egyenlet reciprokát :

 

1  

v K

V 1 I K

1 S

1

i V

s

m i m

  

 

  (14.21)

Ábrázoljuk az 1/vi értékeket az 1/ [S] függvényében (14.6.ábra):

1/[S]

0 1 2 3 4 5 6 7

-2 0 2

1 vi

[I]=0 [I]=1 [I]=2

14.6.ábra.Tisztán kompetitiv gátlás Lineweaver-Burk ábrázolásban

Ordináta metszet : 1/Vm Iránytangens : K  

V 1 I K

s

m i

 

 



Másodlagosan ábrázoljuk a kapott iránytangenseket az [I]

függvényében :

tg K

K V I K V

s i m

s m

   (14.22)

A kapott egyenes ordináta-metszete Ks/Vm , amelybôl Ks számolható , iránytangensébôl viszont a Ki nyerhetô

b., Hanes féle ábrázolás :

A tisztán kompetitiv gátlás sebességi egyenletének átrendezése :

   S  

v S V

K

V 1 I

i m K

s

m i

   

 

 (14.23)

Ábrázolva az [S]/vi az [S] függvényében (14.7.ábra):

[S]

0 1 2 3 4 5 6 7 8

-5 0 5

[S]

vi [I]=0

[I]=1

14.7.ábra. Tisztán kompetitiv gátlás Hanes ábrázolásban.

Az iránytangens : 1/ Vm .

Az ordináta-metszet : K  

V 1 I K

s

m i

 

 

 , amely az [I] lineáris függvénye igy másodlagos ábrázolással a Ks és Ki is számolható.

c., Eadie-Hofstee ábrázolás :

Rendezzük át a tisztán kompetitiv gátlás sebességi egyenletét :

   

 

v S v K 1 I

K V S

i i s

i m

  

 

  ; osszunk [S]-val :

 

v V K 1 I  

K v

i m s S

i

    i

 

 (14.24)

Ábrázoljuk a vi értékeket a vi / [S] függvényében (14.8.ábra):

0 1 2 3 4 5 6

0 2 4 6

[I]=0 [I]=1 [I]=2

vi [S]

vi

14.8.ábra. Tisztán kompetitiv gátlás Eadie-Hofstee ábrázolásban A közös ordináta-metszet : Vm

Az iránytangens :  

  

 

 K 1 I

s K

i

, amely [I] lineáris függvénye igy másodlagos ábrázolással Ks és Ki is

megkapható .

d., Dixon módszer(14.3) :

A tisztán kompetitiv gátlás sebességi egyenletét közös nevezôre hozva és reciprokot képezve :

 

   

v V S

S K 1 I K

i

m

s i



  

 

 

 

V S K K S K K K I

m i

i s i s

1 1

v V

K V S

K V K S I

i m

S m

S m i

  

     

  





 1

V 1 K S

K V K S I

m

s s

m i

(14.25)

Több konstans [S] koncentrációnál mérve a gátlás sebességét, az inhibitor koncentráció függvényében elvégezhetjük az ábrázolást (14.9.ábra):

[I]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

-2 0 2

1 vi

[S]=3 [S]=2 [S]=1

14.9.ábra. Tisztán kompetitiv gátlás Dixon ábrázolásban.

A Dixon módszer elônyei : a közös metszéspont abszcissza értéke közvetlenül a -Ki értékét adja. Ugyanis két egyenes

metszéspontjának abszcissza-értéke :

x O O

tg tg

 

2 1

1 2

  , ugyanez a 2.térnegyedben : ^{ x} _tg^O1_^O_tg²

1 2

 

Tisztán kompetitiv gátlásnál :

     

   

 

 

 

   

 



 I

1

V 1 K S

1

V 1 K S K

V K S

K V K S

m

s

1 m

s 2 s

m i 1

s

m i 2

=

   

   

K V

1 S

1 S K

V 1 K

1 S

1 S

s

m 1 2

s

m i 1 2

 











 

 



= K (14.26)

A módszer másik elônye , hogy csak tiszta gátlásoknál

szolgáltat egyeneseket, részleges gátlásoknál hiperbolikus az ábra.

e., Idôgörbe módszer :

A szubsztrátfogyás sebessége tisztán kompetitiv gátlásnál :

d S  dt

 

   

V S S K 1 I

K

m

s i

  

 

 ; integrálva 0 és t , ill. [So] és [St]

között :

     

V dt d S K 1 I

 

K

d S

m s S

i S S

S S

o t

o t

o t

    

 









^(14.27)

   

 

^{ }

^{ } _{ }

V S S K 1 I

K ln S

m o t s S

i o t

    

 

 ; átrendezve : (14.28)

   

 

 

S S

 

t V K 1 I

K 1

tln S S

o t

m s

i

o t

    

 

 (14.29)

Ábrázolva (14.10.ábra):

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2

1

t ln S0 St [ ] [ ] [So]-[St]

t

[I]=2 [I]=1 [I]=0

14.10.ábra. Tisztán kompetitiv gátlás idôfüggése.

Közös ordináta-metszet : Vm Iránytangens :  

  

 



K I

s K

i

1 ; amely [I] lineáris függvénye , s igy másodlagos ábrázolással Ks és Ki megkapható .

A másodlagos ábrázolások lineáris jellege miatt a tiszta,vagy teljes gátlásokat lineáris gátlásoknak is szokták nevezni az [I]-tól való lineáris függés miatt.

1.4.2.2. Részlegesen kompetitiv gátlás.

Ha az enzim , a szubsztrát és az inhibitor között létrejöhet terner EIS-komplex , de ez a termékképzôdést nem befolyásolja , akkor a reakcióséma :

k2

ES E + P k2

E EIS EI+ P

EI

Az inhibitor ( vagy a szubsztrát ) tehát csak az EIS-komplex létrejöttét gátolja , a gátlás mértékét egy ^ szorzóval vesszük figyelembe :

K ES I 

EIS EIS ES I

i K

i

   és ^Ks ^{EI S}_EIS (14.30)

Az inhibitor a termékképzést viszont nem befolyásolja, tehát ^{ 1}. Ezt behelyettesitve az elôzôkben közölt általános sebességi

egyenletbe , vagy a szokásos módon levezetve természetesen ugyanazt az eredményt kapjuk :

   

 

v

 

V

k ES EIS k E

i

m T

 

2 

2

= _{E  ES}^ES_^_EI^EIS_{ EIS} (14.31) De ismert,hogy :

K E S

ES E K ES

S és K E I

EI EI E I K

K ES I K S

s s

i i

s i

  

   

(14.32)

Behelyettesitve : v

V

ES ES I K K ES

S ES K ES I K S

ES I K

i m

i

s s

i i





  





(14.33) [ES]-val egyszerûsitve és ^{K S}i közös nevezôre hozva :

 



 



   

 

  

v_i  

  

V S K I

K K K I K S S I

m i

s i s i



 (14.34)

Ez az összefüggés azonos az általános egyenletbôl levezetettel.

Ismertebb formává alakitva osszuk el a számlálót és a nevezôt is



^Ki  ^I



-val :

 

   

 



 

 

^{ }





 



v V S

i

m

i i

i

 

  

 S I K

I K

K I K

I K

i

 S



 



=

 

   

 

V S_m S K I Ki

I K

S

i

 





 



 



(14.35)

A kapott egyenlet hasonlit a tisztán kompetitiv esethez , csak itt más a Ks szorzója.

Az egyes komplexek állandósult állapotát feltételezve is

megkapható a részlegesen kompetitiv gátlás sebességi egyenlete, de az egyedi sebességi állandók nem vonhatók össze a szokásos Km formába , igy ennek levezetésétôl eltekintünk.

A konstansok grafikus meghatározása : a., Lineweaver-Burk módszer :

A gátolt sebességi egyenlet konstans [I] koncentrációknál :

1 1 1

v V K V

I K

I K S

i m

s m

i i

  



 

 (14.36) Ábrázolva (14.11.ábra):

^1/[S]

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

-4 -2 0 2 4

[I]=0,a=1 [I]=1,a=2 [I]=2,a=2 a=végtelen

1 vi

14.11. ábra. Részlegesen kompetitiv gátlás L-B ábrázolásban.

A 30. ábrán a=  , amelyrôl közvetlenül csak a Vm határozható meg . De az inhibitor nélküli kisérletbôl a Ks meghatározható ( az

abszcissza-metszet reciproka pozitiv elôjellel ). Két [I]-nál kapott iránytangens :

tg K V

s m

₁ 

   

 

 I K

I K

1 i

1



 _i és

   

tg 

 



2  

 K

V

I K

I K

s m

2 i

2 i

(14.37) Két egyenlet két ismeretlennel :  és Ki számolható.

b., Hanes ábrázolás : Átrendezve az alapegyenletet :

S v

S V

K

i m V

s m

   



I K

I K

i i



 (14.38)

Ábrázolva (14.12.ábra):

[S]

0 1 2 3 4 5 6

-2 0 2

[S]

vi

[I]=0 [I]=1 [I]=2

14.12.ábra. Részlegesen kompetitiv gátlás Hanes ábrázolásban Az iránytangens : 1/ Vm

Az ordináta-metszetekbôl a fentiekhez hasonlóan számolható K s , Ki és ^ .

c., Eadie-Hofstee módszer :

A gátlás egyenlete a nevezôvel átszorozva és [S]-val osztva :

vi[S] + viKs^_I^I _^_K^Ki

i



 =Vm[S] (14.39)

vi=Vm- ^v_S^{i Ks}_I^I _^_K^Ki

i



 (14.40)

Ábrázolva (14.13.ábra):

0 1 2 3 4 5 6

0 2 4 6

[I]=0, a=1 [I]=1.

a=2 [I]=2, a=2

vi

vi [S]

14.13.ábra. Részlegesen kompetitiv gátlás E-H ábrázolásban.

:

A konstansok az elôzô pont szerint meghatározhatók.

d., Dixon ábrázolás : az 1/vi - 1/ [S] képletbôl látható, hogy az 1/vi - [I] ábrázolás csak ^ =1 értéknél ad egyenest (nem gátolt eset), amely párhuzamos az abszcisszával. Minden más ^-nál

hiperbolikus az összefüggés.

A szemléltetô diagram (14.14.ábra) :

[I]

0 0.5 1 1.5 2 2.5

-2 0 2

1 vi

[S]=1 [S]=2

a=1

14.14.ábra. Részlegesen kompetitiv gátlás Dixon ábrázolásban.

e., Idôgörbe módszer :

A részlegesen kompetitiv gátlás egyenletének átrendezése és integrálása :

 

V_m dt d S K

S S

s o

t

o t

 







^_{ }^{ }_I^I _^_K^Ki

i





 

 

d S

S S

S

o



t ^(14.41)

S S

t V K

o t

m s

    



I K

I K

i i





1 t

S S

o t

ln (14.42)

Ábrázolva (14.15.ábra) :

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 2 4 6

[I]=0 [I]=1 [I]=2

1

t ln [S0 ] [St]

] [So]-[St]

t

14.15.ábra. Részlegesen kompetitiv gátlás idôfüggése.

Az ordináta-metszet : Vm

Az iránytangensekbôl a fentiek szerint számolható a Ks , a Ki és az

 értéke .

Az iránytangensek másodlagos ábrázolása az [I] függvényében minden esetben derékszögû hiperbolát adnak,ezért a

részleges,vagy nem teljes gátlásokat hiperbolikus inhibiciónak is szokták nevezni.

1.4.2.3. Tisztán nem kompetitiv gátlás.

Az inhibitor ás a szubsztrát nem befolyásolják az

enzimmolekulához történô kapcsolódásukat , mindkettô ugyanúgy létrehozhatja az EIS terner komplexet , de termék a terner

komplexbôl nem képzôdik :

k2

ES E + P

E EIS EI

A megfelelô disszociációs állandók : K E I

EI

ES I

EIS EIS ES I

i K

i

    (14.43)

K E S

ES K EI S

EIS EI K EIS S

K I K S ES

s s s s

i

      (14.44)

Ebbôl következik, hogy ^{ 1} és mivel az EIS komplexbôl nem képzôdik termék , ezért ^=0 .

A gátolt reakció sebességi egyenlete rapid equilibrium esetén :

v V

ES E

ES K ES

S ES K ES I K I

ES I Ki

i

m T s s

i

 

   ; [ES]-val egyszerûsitve:

v V S K

K K K S K I S I

i m i

s i i s

    (14.45)

A nevezô felbontható két összeg szorzatára :

 



 

 

^{ }



^{    }

v V S K

I K S K V K

K I * S S K

i

m i

i s

m i

i s

   

  (14.46)

Steady state kinetika bonyolultabb összefüggést eredményez.

Konstansok grafikus meghatározása:

a., Lineweaver-Burk módszer : a sebességi egyenlet reciproka :

1 v

K K K S K I S I V S K

i

s i i s

m i

     

   

 

 

   

 

 K

V

K I V K

1 S

1

V 1 I K

s m

s

m i m i

(14.47) Ábrázolva (14.16.ábra):

1/[S]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-1 0 1 2

1 vi

[I]=0 [I]=1

[I]=2

14.16.ábra. Tisztán nem kompetitiv gátlás L-B ábrázolása.

Az abszcissza-metszet : -1/ Ks Az ordináta-metszet : 1  

V 1 I

m Ki

 

 

 , amely ábrázolva [I] függvényében megadja a Ki értékét.

b., Hanes ábrázolás :

Átrendezve a sebességi egyenletet : S

v

K K K I K S S I

i V K

s i s i

m i

     

   

  

 

 K I

V K S K V

K I V K

i m i

s m

s

m i

(14.48) Ábrázolva (14.17.ábra):

[S]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-1 0 1 2

[S]

vi

[I]=0 [I]=1 [I]=2

14.17.ábra. Tisztán nem kompetitiv gátlás Hanes ábrázolása.

Az abszcissza-metszet ([S]/vi=0): [S]=-Ks Iránytangens : tg^ = ¹

V

I

m V Km i , amely [I] lineáris függvénye és másodlagos ábrázolással Ki nyerhetô.

c., Eadie-Hofstee ábrázolás :

Átszorozva : ^{v K K}_{i s i}v K S v K I_{i i}  _{i s} v S I_i V K S_{m i}

 



 

 

^{ }



^{ }

v S K_{i i} I v K K_{i s i} K I_s V K S_{m i}

 

 



 



v V S K S K I

i

m i

i

   v

S

K K K I K I

i s i s i



   

K v  S

V K K I

s i m i

i (14.49) Ábrázolva (14.18.ábra):

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

0 1 2 3

[I]=0 [I]=1

vi [S]

vi

14.18.ábra. Tisztán nem kompetitiv gátlás E-H ábrázolása.

Iránytangens : -Ks

Ordináta-metszet : _K^{V K}_i^{m i}_{ I} ; ennek reciproka : _V¹ _{V K}^I

m m i , amely másodlagos ábrázolással Ki és Vm értékét szolgáltatja.

d., Dixon módszer :

A sebességi egyenletbôl [I] lineáris egyenletet fejezzünk ki : 1

v

K K K S K I S I V K S

i

s i i s

m i

   

 

 

K S

V K S I K S V S

s m i

s

m (14.50)

Ábrázolva (14.19.ábra):

[I]

0 1 2 3 4 5 6

-1 0 1 2

1 vi

[S]=1

[S]=2

14.19. ábra. Tisztán nem kompetitiv gátlás Dixon ábrázolása.

Abszcissza-metszet :^K_{V S}^{s S} _{V K S}^{K S I K}

m

s

m i i

   

  

e., Idôgörbe módszer : A v d S

i   dt egyenlet átrendezve és integrálva:

V_m dt

o t



 ^_^{Ks  K I}_K^s

^{ }

^_^



^{d S}

_{ } ^{ }

_S

i S

S

o

t ^{ }

   

 





1 I

K d S

i S S

o t

(14.51)

 

 

V t K K I

 

K ln S

m s S

s i

o t

 

 

 ^_^1 _K^{I }_^

    

^{S  S}



i

o t (14.52)

Átrendezve és t-vel osztva :

S S

t K

t S

S

V K K I

o t

s o

t

m i i

   



1ln (14.53)

Ábrázolva (14.20. ábra):

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

0 1 2 3

1t ln [S0]

[St]

[S0]-[St]

t

14.20.ábra. Tisztán nem kompetitiv gátlás idôfüggô ábrázolása.

Az ordináta-metszet reciproka : ¹ V

I

m V Km i

 , amely [I] függvényében Ki értékét adja. Ez a tipúsú gátlás is lineáris.

1.4.2.4. Részlegesen nem kompetitiv gátlás.

Az inhibitort tartalmazó komplexek további komplexképzésre képesek, a biner EI-komplex terner komplexet képez a

szubsztráttal , ill. az ES-komplex is képez terner komplexet az inhibitorral mindkét esetben változatlan egyensúlyi állandóval.

Ugyanakkor ezekbôl az EIS terner komplexekbôl kisebb sebességgel (k2) képzôdik a termék , vagyis ^=1 és 0<<1. A reakcióséma:

k2

ES E + P ^k2

E EIS EI + P

EI

A gátolt sebességi egyenlet : v

V

ES EIS E

ES EIS E ES EI EIS

i

m T

 

 

  

 

(14.54) De rapid equilibrium esetén : ^{E  K ESs}_S ;

EI E I K

K ES I

i K S

s i

  ; ^{EIS ES I}_K

i

 (14.55)

Igy : _V^v

ES I K ES K

S ES ES K I

K ES I K ES

i m

i

s s

i i





  



(14.56) [ES]-val egyszerûsitve és Ki[S] közös nevezôre hozva :

 



 



      

v V

S K I

K K K S K I S I

i m

i

s i i s

 

  

 (14.57)

A nevezô két tag szorzata, igy : ^vi ^Vm _I^I _K^Ki _{S K}^S

i s

 

 

 * (14.58)

A konstansok grafikus meghatározása:

a. Lineweaver-Burk módszer : Reciprokot képezve :

1 1 1

v K V

I K

I K S V

I K I K

i s m

i

i m

i i

 

  



  (14.59)

és ábrázolva (14.21.ábra):

1/[S]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-1 0 1 2

[I]=0,b=1 [I]=1,b=1 b=0

1 vi

14.21.ábra. Részlegesen nem kompetitiv gátlás L-B ábrázolása.

Az abszcissza-metszet : - 1/ Ks . Egyéb konstans nem határozható meg.De az eddig tárgyalt egyéb módszerek sem alkalmasak erre , csak az un. Webb módszer.

b., Webb módszer :

Fejezzük ki az alábbi sebesség-arányokat : v

v v

V S

K S

V S

K S V I K

I K

S

K S

o o i

m s m

s m i

i s

  

  

 

 *

(14.60) Vm [S] -val egyszerûsitve és közös nevezôre hozva :

 

 

 

v v v

K I

o o i 

 



i

1

1 1

 1  (14.61)

Ábrázolva (14.22.ábra):

1/[I]

0 1 2 3 4 5 6 7

-1 0 1 2

v0- viv0

b=0,9

b=0 b=0,5

14.22.ábra. Részlegesen nem kompetitiv gátlás Webb ábrázolása.

Az ordináta-metszetbôl a , a meredekségbôl a Ki , mig a Lineweaver-Burk módszerrel a Ks határozható meg.

1.4.2.5. Kevert tipusú gátlás.

A kevert, vagy vegyes tipusú gátlás egy kompetitiv és egy nem kompetitiv gátlás együttesen, vagyis eltérô disszociációs állandóval létrejön az EIS terner komplex, de az nem szolgáltat terméket :

k2

ES E + P E EIS

EI

Rapid equilibrium esetén : ^{E K ESs}_S ; ^{EI E I}_K ^K_{K S}^{I ES}

i

s i

  ;

EIS I K ES

i

 (14.62)

v V

ES E

ES

E ES EI EIS

i

m T

 

   

ES K

S ES ES K K

I

S ES I K ES

s s

i i

  

 (14.63)

[ES]-val egyszerûsitve és Ki[S] közös nevezôre hozva :

     

    

v V K S

K K K S K I S I

i

m i

s i i s

   



 (14.64)

Steady state esetben is gyors egyensúly-beállást mutat az EIS terner komplex , ennek következtében hasonló összefüggést kapunk.

A konstansok grafikus meghatározása : a., Lineweaver-Burk ábrázolás:

Reciprokot képezve :

 

   

1 v

K V

K I V K

1 S

1 V

I

i V

s m

s

m i m

 

 

  

 



mKi (14.65)

Ábrázolva (14.23.ábra):

1/[S]

0 2 4 6 8 10

-2 0 2

1 vi

[I]=0 [I]=1 [I]=2

14.23.ábra. Kevert tipusú gátlás L-B ábrázolása.

A közös metszéspont abszcissza-vetülete :

  

 

1 _{2 1} 1

1 2

S

b b

a a K_s (14.66)

Vm és Ks gátlás nélküli meghatározásával ^ számolható , Ki pedig az ordináta-metszetbôl, vagy az iránytangensbôl megkapható.

b., Hanes ábrázolás : Átrendezve :

S

v_i  ¹    

V

I K S

m

1



 

 

 _i

 

1

V K K I

m s K

s i

 

 

 (14.67) Ábrázolva (14.24.ábra):

A közös metszéspont abszcissza vetülete : - Ks , a nem gátolt reakció abszcissza-metszete - Ks , igy ^ és Ki számolható.

c., Eadie-Hofstee ábrázolás :

Átrendezve : ^vi



^



^{K Ks i K Si} ^{K Is} 



^  ^{S I}



^{V K Sm i  (14.68)}

[S]-val osztva és ismét átrendezve :

[S]

-1 0 1 2 3 4 5 6 7

-2 0 2

[S]

vi

[I]=0 [I]=1

14.24.ábra. Kevert tipusú gátlás Hanes ábrázolása.

 

   

v K I K

K v

i S

i

    i





 



 ^s I  ⁱ 

 V K

I K

m i

i



 (14.69)

Ábrázolva (14.25.ábra):

0 1 2 3 4 5 6

-2 0 2

[I]=0 [I]=1

vi

vi [S]

14.25.ábra. Kevert tipusú gátlás E-H ábrázolása.

A 2.negyedben kapott közös metszéspont ordináta vetülete : v a b a b

a a V

i   m

 

2 1 1 2 

2 1 1



 , amelybôl ^ számolható.

d., Dixon ábrázolás : A dupla reciprok képletbôl :

   

1 1 1

v V K

K S I

i m i

   s





  ^{ } ^ 





1 1 V

K

m S

s (14.70)

Ábrázolva (14.26.ábra):

1/[S]

0 2 4 6 8 10

-2 0 2

1 vi

[S]=1

[S]=3 [S]=2

14.26.ábra. Kevert tipusú gátlás Dixon ábrázolása.

A közös metszéspont abszcissza vetülete : - Ki , ordináta vetülete :_V^{1 1 1}

m

 

 

, amelybôl ^ számolható.

e., Idôgörbe módszer :

A kevert tipusú gátlás sebességi egyenletét integrálva :

S S

t

o  t

  

V I K

m

i

1



 







 

 

K I

K I K

s

i

i

1 1

 

 



 

 



 *¹

t S S

o t

ln (14.71)

Ábrázolva (14.27.ábra):

0 1 2 3 4 5 6 7

0 1 2 3 4

1 t ln

[S0]

[St]

[So]-[St]

t

14.27.ábra. Kevert tipusú gátlás idôfüggô ábrázolása.

Az ordináta metszet az [I] függvénye , igy másodlagos ábrázolásban :

az ordináta metszete : 1/ Vm . abszcissza metszete : - 1/ Ki . ir'nytangens : 1/ Vm ^Ki .

A kevert gátlás lineáris inhibiciónak is nevezhetô.

1.4.2.6. Tisztán katalitikus gátlás kinetikája.

A katalitikus (vagy unkompetitiv , antikompetitiv , kapcsolódó ) gátlások közös jellemzôje, hogy az inhibitor nem tud a szabad

enzimhez kapcsolódni, hanem csak az ES-komplexhez . Igy a tisztán katalitikus gátlás sémája :

k2

ES E + P

E EIS A sebességi egyenlet :

v V

ES E

ES E ES EIS

i

m T 

  (14.72)

Ismert , hogy ^{E  K ESs}_S és ^{EIS I ES} K_i

 Igy a gátlás sebességi egyenlete :

v V K S

K K K S S I

i m i

s i i

   (14.73)

Néhány jellegzetes ábrázolás : a., Lineweaver-Burk : A sebességi egyenlet reciproka :

1 1 v

K V S

i s m

  1  

V 1

I

m Ki

 

 

 (14.74)

Ábrázolva (14.28.ábra):

1/[S]

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

-2 0 2

1

vi [I]=0

[I]=1

14.28.ábra. Tisztán katalititikus gátlás L-B ábrája.

A gátlás nélkül megkapható a Ks és Vm , az ordináta-metszetbôl pedig a Ki .

b., Eadie-Hofstee ábrázolás:

Átrendezve a sebességi egyenlet :

v K K

K I v

S V K

K I

i s i

i

i m i

i

   

 (14.75)

Ábrázolva (14.29.ábra):

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3 4

[I]=0 [I]=1

vi

vi [S]

14.29.ábra. Tisztán katalititikus gátlás E-H ábrája.

1.4.2.7. Részlegesen katalitikus gátlás.

Itt is csak a szubsztrát megkötése után tud kapcsolódni az

inhibitor , de a terner komplex itt nem inaktiv, hanem csökkent sebességgel ugyan , de képez terméket.

A reakcióséma tehát:

k2

ES E + P ^k2