1. A resveratrol gátolja az LPS-indukálta, bifázisos TRAF6 gén- és fehérjeexpressziót, illetve a TRAF6 ubikvitinációját
A kapott eredmények alapján a rezveratrol a 10 perces LPS-kezelést követő, jelentős átmeneti emelkedést mutató TRAF6 mRNS szintet szignifikánsan csökkentette, a 30 perces LPS-kezelést követő, erősen visszaeső mRNS szintet nem befolyásolta, míg az 1 óra után újra megemelkedett TRAF6 mRNS szintet szintén szignifikánsan csökkentette. Ezt a, korábban már bizonyított [1], bifázisos expressziós mintázatot és gátlását szemlélteti az 1A ábra.
Az LPS-kezelést követő TRAF6 fehérjemennyiség a mRNS időbeli bifázisos mintázatát követte, vagyis két csúcs volt megfigyelhető 10, illetve 60 percnél, melyek rezveratrol előkezelés mellett szintén szignifikánsan alacsonyabbnak mutatkoztak (1B ábra).
A gén- és fehérjeexpressziónál fellépő bifázisos mintázat a TRAF6 fehérje aktivációját jelentő Lys-63-kapcsolt poliubikvitinációnál nem volt megfigyelhető, viszont 10 és 30 perces kezelést követően az LPS-indukálta aktiváció/ubikvitináció erősen emelkedett, amit resveratrol hozzáadása szignifikánsan gátolt (1C ábra).
A TRAF6 funkcionális gátlása rezveratrollal a TLR4 – NF-kB útvonalon
Kálmán N., Antus Cs., Pribér J., Radnai B., Jakus P.B., Tucsek Zs., Fónai F., Sümegi B., Veres B.*
„Septic Shock Team”
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet; H-7624 Pécs, Szigeti út 12.
*levelező szerző: balazs.veres@aok.pte.hu
Az LPS által indukált, TLR4 által közvetített MyD88-független NF-κB aktiválás jelátvitelében már ismert a rezveratrol gátló funkciója a TRAM–TRIF–
TBK1 komplexben [1], míg egy másik, TLR4 receptorról induló jel, a TIRAP–
MyD88–IRAK1,4–TRAF6 útvonalban szerepe még nem tisztázott. A két útvonal közötti interakció az irodalomban már leírt TLR4–TRIF–RIP1–TRAF6 jelátvitel [1].
Ennek ismeretében egér RAW 264.7 makrofágokon végzett kísérleteinkben megvizsgáltuk a rezveratrol hatását (50 M) az LPS (1g/ml) által stimulált TRAF6 génexpresszióra, fehérje kifejeződésre és ubikvitinációra, illetve a MAP-kinázok és az Akt aktivációjára több időpontban (10, 30, 60, 120 perc).
Az LPS indukálta TRAF6 mRNS és fehérje expresszió, és utóbbi ubikvitinációja, mely szükséges a TAK1 által befolyásolt p38 és JNK MAP-kináz útvonalak aktiválásához, csökkenthető volt rezveratrol hozzáadásával, ellenben az ERK1/2 MAP-kináz ágra nem volt befolyása. Ismert, hogy az Akt közvetlen célpontja a TRAF6-nak [2], és megvizsgálva az Akt foszforilációs mintázatát, hasonló eredményt kaptunk, mint a MAP-kinázok esetében, vagyis a rezveratrol gátolta mind a szerinen, mind a treoninon történő Akt foszforilációt.
Munkánkban bizonyítottuk, hogy a rezveratrol gátolja az LPS indukált TRAF6 kifejeződését és ubikvitinációját, szignifikánsan csillapítva ezzel a TLR4–TRAF6–
MAP-kináz és Akt útvonalakat, így járulva hozzá a már korábban is feltételezett gyulladásgátló hatáshoz.
2. A resveratrol gátolja az LPS-szignálra bekövetkező p38, JNK és Akt aktivációt
Eredményeink szerint a rezveratrol csökkenti a TRAF6 aktivációra bekövetkező MAP kináz útvonalak aktivációját, vagyis a p38 foszforilációt (2A ábra), és a JNK fehérjék foszforilációját is, kivéve 30 percnél, ahol a legerősebb foszforilációt érte el (2B ábra). Érdekesség, hogy az időben csökkenő ERK aktivációra a rezveratrolnak nincs hatása (2C ábra). Meghatároztuk az Akt aktivációt is, mely direkt targetje TRAF6-nak [2], és azt találtuk, hogy foszforilációs mintázata követi a TRAF6 aktivációt, ami rezveratrollal szintén gátolható (2D ábra).
1. ábra
2. ábra
Referenciák
1. Young HS, Lee JY, Fitzgerald KA, Young HA, Akira S, Hwang DH: Specific inhibition of MyD88-independent signaling pathways of TLR3 and TLR4 by resveratrol: molecular
targets are TBK1 and RIP1 in TRIF complex. Journal of Immunology, 2005. (175) 3339- 3346.
2. Yang WL, Wang J, Chan CH, Lee SW, Campos AD, Lamothe B et al.: The E3 ligase TRAF6 regulates Akt ubiquitination and activation. Science, 2009. (325) 1134-1138.
Akt: Protein kinase B; ERK1/2: extracellular signal-regulated kinase; GAPDH:
glycerinaldehide-3-phosphate dehydrogenase; IRAK: Interleukin 1 receptor- associated kinase; JNK: c-Jun N-terminal kinase; LPS: Lipopolysaccharide endotoxin; MAP-kináz: Mitogen activated protein kinase; MyD88: myeloid differentiation factor 88; NF-kB: Nuclear factor-kB; RIP1: Receptor interacting protein 1; TAK1: TGF-b activated kinase ; TBK1: TANK-binding kinase 1;
TIRAP: TIR-domain-containing adaptor protein; TLR4: Toll-like receptor 4;
TRAF6: TNF receptor–associated factor 6; TRIF: Toll-interleukin 1 receptor (TIR)-domain-containing adapter-inducing interferon-β; TRAM: TRIF-related adaptor molecule.
TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0029
Tudományos képzés műhelyeinek támogatása a Pécsi Tudományegyetemen
