Biopolierek elválasztása

(1)

1

Biopolierek elválasztása

LC módszerek

• -RPLC

• -IELC

• -SEC

• -HILIC

(2)

2

• RPLC alapjai a biopolimerek elválasztásában

(3)

3

30 nm 1-2 nm

Szabad diffúzió a pórusban a stagnáló folyadékban

Kulcsszavak

• Bio töltetek:

• D_d≥20nm

• Silica B

• RP 18 utószilanizált,

• Nagy borítottság

(4)

4

• Morfológia:

• -teljesen porózus

• -héjszerű

• -monolit

• -nem porózus

• Teljesen porózus:

• -szilikagél, szervetlen polimer, Silica B

• -szerves szilikagél monomer+szervetlen monomer

• Alapvető:pH tűrés

(5)

5

(6)

6

M M p

p D

u C d

u D d B

A

H 

 







2

(7)

7

Aeris héjszerű töltet, makromolekulák elválasztására használt töltet

(8)

8

Kis molekula tömegű anyagok elválasztására használt töltet

(9)

9

• Alapvető:

• A fehérjék elválasztásához mindig grádienselúciót kell alkalmazni!

Lehetséges grádiensprofilok

(10)

10

• Kérdés:

• 1. Milyen legyen a grádiensprofil?

• 2. Milyen legyen a grádiensidő?

Lineáris grádienselúció(LSS) modellezése izokratikus elválasztással

(11)

11

(12)

12

• Ide a törvényszerűségek beírása egyetem

(13)

13

(14)

14

Representative chromatograms of Interferon related proteins.

Conditions: mobile phase A: 0.1% TFA in water, mobile phase B: 0.1% TFA in ACN, gradient profile: 35 to 60% B in 5 min (then 2 min reequilibrating ), flow rate: 0.3 mL/min, T = 60 ◦C, injected volume = 5 µL (full loop), λ = 210 nm.

Column: Aeris WP C18, 150 x 2.1 mm, 3.6 µm. Peaks: 1: oxidized-1, 2: oxidized-2, 3: related impurity-1, 4: native interferon, 5: related impurity-2, 6: reduced form-1, 7: reduced form-2

(15)

15

(16)

16

(17)

17

(18)

18

(19)

19

(20)

20

(21)

21

(22)

22

SEC, HPLC, UHPLC

(23)

23

(24)

24

(25)

25

Megjelenés alatt: Kromatográfus

• Korszerű méretkizárásos kromatográfia: fehérje aggregátumok elválasztása

•

• Fekete Szabolcs¹, Fekete Jenő², Guillarme Davy¹

•

• ¹Genfi Egyetem, Gyógyszerészeti Tudományok Tanszék, 1211 Genève, Boulevard d’Yvoy 20.

• ²BME Szervetlen es Analitikai Kémiai Tanszék, 1111 Budapest, Szent Gellért tér 4.

(26)

26

Ioncserés kromatográfia

Erős anioncserélő gyanta (állófázis) szerkezete

-O H e lle n ion

N

ion cse ré lő csop ort gya n ta

fá zis va gy a la p fá zis

+

(27)

27

amino csoport gyanta

fázis vagy

CH3

N + H⁺ H

proton

amino csoport protonált formája H⁺ CH3

N H

A gyenge anioncserélő kapacitásának függése a mozgófázis pH értékétől

I o n c s e r é l ő

k a p a c i t á s N C H3

H H +

p H p Kb

I .

I I . N

C H3

H N

C H3

N C H3

H

H H +

I I I . m e q / g

(28)

28

A szilikagél kémiai módosításával készített kationcserélő

Si O

Si OH

OH Cl Si

CH₃

CH3

szilikagél szilárd része

reaktív szilán

cc. H₂SO₄

Si O

OH Si CH₃

CH₃ +

Si O

OH Si CH₃

CH3

SO₃^-H⁺ reaktív szilanol

csoportok

Gyenge kationcserélő állófázis szerkezete

COOH pKa

COO^- H⁺

gyanta fázis

vagy alapfázis kationcserélő csoport

+

(29)

29

COO^- Ioncserélő

kapacitás

pH pKa

I.

II.

III.

meq/g

COOH

COO^- COOH

(30)

30

(31)

31

(32)

32

(33)

33

(34)

34