SZŰRŐELEMEK A BIOTECHNOLÓGIÁBAN

(1)

TIHANYI NIKOLETT, RANDEK JUDIT

SZŰRŐELEMEK A

BIOTECHNOLÓGIÁBAN

(2)

Szűrés jellemzői

• A szűrés nyomáskülönbség (mint hajtóerő)

hatására végbemenő szétválasztó művelet,mely során szilárd halmazállapotú anyagot folyékony vagy légnemű közegtől szétválasztunk

• Nyomáskülönbség előidézhető:

• Gravitációs úton

• Szivattyúval

• Vákuumszivattyúval

• Két alaptípus:

• Felületi szűrés

• Mélységi szűrés

(3)

Szűrés jellemzői

• Felületi szűrés: a teljes felületen tartják vissza azokat a részecskéket, amelyek mérete nagyobb a szűrő

pórusméreténél

Ehhez tartozik az abszolút szűrés fogalma: visszatartást csak a membrán pórusainak átmérője határozza meg.

• Mélységi szűrés: a részecske visszatartása a felületen és a szűrő teljes vastagságában történik

•Valószínűségi szűrés elv alapján történik mivel mindig van egy adott valószínűsége annak, hogy egy részecske átjut a szűrőrétegen. Ezért a gyártó a mélységi szűrőt névleges pórusmérettel jellemzi.

(4)

A szűrés jellemzői

• Statikus (dead end) szűrés

• Szűrendő anyag a membrán felületére merőlegesen érkezik.

Nagyobb méretű molekulák visszamaradnak(koncentráció polarizációs réteg).Ez is szűrőréteget képez

• Keresztáramú (cross flow) szűrés

• A fluidum a membrán felületével párhuzamos irányból érkezik, hajtóerő hatására a permeálódó komponensek merőlegesen haladnak át (nincs lerakódás teljesítmény nő)

(5)

Szűrés jellemzése

• A szűrők hatékonyságát jellemezhetjük a százalékos visszatartással:

• β-hányados: befolyó anyag konc./ elfolyó anyag konc. (adott részecskeméretre)

• Titer csökkenés (T_r): β-hányados adott mikróbára nézve

• Szűrő anyaga lehet:

• Polipropilén

• Pammut

• Üvegszál

• Cellulóz

• Nylon

• Poliamid

• Teflon stb.

(6)

Szűrők felhasználása és követelményei

• Felhasználás

• Fermentorok, bioreaktoroknál felhasznált anyagok sterilezése

• Elfolyó anyagok tisztítása

• Sejt/sejtörmelék eltávolítása

• Termékek tisztítása

• Levegő/gáz szűrése stb.

• Követelmények:

• A felhasznált szűrőelem az adott üzemi körülményeknek feleljen meg (nyomás, hőmérséklet, áramlási seb. )

• A szűrendő anyaggal legyen kompatibilis

• Megfelelő eltávolítási hatásfok

• Alaki és mechanikai feltételek

• Fix pórus méret

• Nagy terhelés esetén se legyen szerkezetváltozás v sérülés

(7)

Polipropilén mélységi szűrőbetétek

• Felhasználás:

• Előszűröként szérumok, vakcinák, diagnosztikai reagenseknél stb.

• Fermentációnál az oldószerekre, habzásgátlókra

• Downstream folyamatoknál sejt és sejttörmelék elválasztásra stb.

• Tulajdonságai:

• Nem foszló, folytonos PP szálakból áll (gyanta mentes)

• Pozitív töltésű típusú szűrők oldatokban képesek az abszolút

pórusméretnél kisebb részecskéket is megkötni az elektrosztatikus kölcsönhatás által( pl.baktréiumokat, endotoxinokat)

• Két részből áll: belső résznél a pórusátmérő állandó (megfelelő visszatartás biztosítása )

• Külső résznél szálak átmérője kifelé nő, ahogy a pórusátmérő is,a hézagtréfogat állandó

(8)

Polipropilén redőzött szűrőszövetek

• Felhasználás: előszűrő (víz, szérum,pufferek,oldatok stb.)

• Tulajdonságai:

• Folytonos nem szőtt PP szálakból

• Állandó pórusméret

• Kialakítása: a vékony PP szövetet egy henger alakú tokba

hajtogatják bele, amit egy belső PP szilárdító mag és egy külső védőkosár fog közre

• Működési határ:

• 550 kPa nyomáskülönbségig max. 50 °C

• 410 kPa nyomáskülönbségig max 80 °C

(9)

Gyantamentes redőzött cellulóz szűrők

• Felhasználás: előszűrőként (üzemi-és mosó vízhez, RO membránhoz, ioncserélt vízhez stb.)

• Tulajdonságai.

• Felépítés: tiszta redőzött cellulóz szálakból nagy felületű hengerbe hajtogatva

• Működési határ:

• 550 kPa nyomáskülönbségig max. 50 °C

• 410 kPa nyomáskülönbségig max 80 °C

(10)

Gyantával kötött hajtogatott üvegszálas szűrők

• Felhasználás:

membránokhoz előszűrőként, steril levegő, ozmózis berendezések védelme

•

Tulajdonságai:

• az üvegszál természetes pozitív töltésének köszönhetően, a

negatív töltésű részecskék, baktériumok, endotoxinok és kolloid anyagok leválasztása kimagasló.

• a pozitív töltésnek egy további előnye, hogy nemcsak a

deformálódó, hanem a nem deformálódó részecskéket is képes leválasztani, valamint nagy mennyiségű szennyeződést képes felvenni

• A fenol gyanta és üvegszál kombináció előnyei:aszimmetrikus pórus szerkezet, rendkívül hatékony részecske visszatartás, a legszélesebb körű vegyi ellenállás, hosszú élettartam

• Autoklávozhatók

(11)

Porózus rozsdamentes acél szűrők

• Felhasználás: gőzsterilezés, oldószerek, víz stb. tisztítása

• Tulajdonságai:

• Felépítés: pórozus szerkezetű ( szinterelt fémrészecskék)

• Szennyeződés visszatartóhatása jelentős

• Nagy hőmérséklettűrés (max 200)

• Korrozióálló, kíváló kémiai kompatibilitás, legtöbb oldószerhez használható, jó szűrésikapacitás viszkózus anyagok esetén is

• Gázoknál tisztításánál 0,4- 11μm pórusméret jellemző

• Kémiailag/mechanikailag jól tisztítható (újrafelhasználható)

(12)

Membánszűrők

•

Felhasználás:

Levegő/gáz szűrése Oldatok sterilezése

Biológiai anyagok tisztítása

•

Tulajdonságai.

• Többféle polimerből készülhet: műanyag (poliamid, poliészter stb.)

,cellulóz-származék (cellulóz-nirát v. acetát stb.,) ,teflon-származék (PTFE) stb.

• Szerkezet: a membrán egy PP és PÉ réteg között van

• Előnyei: kémiailag egységes anyagokból készülnek, konstans pórusméret, szerves oldószerekkel, savval, lúggal szemben ellenállóak, szűrési

veszteség kicsi, oldott anyag nem adszorbeál, konstans pórusméret

• Hátrányai: Túlnyomás v vákuum kell, sérülékenyek, változhat a pórusméret

• Egyrétegű (előszűrő) v. kétrétegű ( steril szűrő)

(13)

Hidrofil membrán szűrők

• Felhasználás : Előszűrőként vagy sterilszűrőként a diagnosztikai reagensekhez ,szerves oldószerekhez, pufferekhez, szérumokhoz stb.

• Tulajdonságai:

• Anyaga lehet: tiszta nylon, módostított polimerek (poliamid, poliszulfon)

• Nedvesítőszerrel, felületaktívanyaggal vagy vmilyen bevonattal vannak ellátva, ezek leoldódhatnak a

membránról, rontva a szűrő és a termék minőségét

(14)

Hidrofób membrán szűrők

• Felhasználás : Fermentorok és bioreaktorok be-és kimenő gáz sterilezéséhez, agresszív oldószerrekhez, aszeptikus csomagolásnál nitrogén és levegő sterilezéséhez

• Tulajdonságai:

• Kétrétegű hidrofób polivinilidén-flourid v teflon membrán két PP támasztóréteg között

• 100%-os baktérium és baktériofág visszatartási

hatékonyság száraz és nedves körülmények között is

• Folyadékban az abszolút szűrőképesség 0,2 μm , levegő v.

gázban 0,01 μm

• Többszöri in situ gőzsterilezést és autoklávozást jól bírja

(165 h, 142 °C)

(15)

Kis fehérjekötő kapacitású membrán szűrők

• Felhasználás:

• Híg fehérje oldatokhoz ( kevesebb mint 1 mg/ml) (szérummentes táptalaj, fehérje alapú terápiás és diagnosztikai reagensekhez, rekombináns feh. stb.)

• Cél a min. fehérjeveszteség

• Tulajdonságai:

• Hidrofil típusú

• Anyaga: hidroxilezett poliamid, PVDF, poliszulfon és egyéb polimerek

• Kötőképessége: cm

²

-ként kevesebb mint 5 μg feh-jét köt

meg

(16)

szűrőházak

• A biotech.-ban a szűrőházak anyaga rozsdamentes acél v.

szénacél

• Követelmények:

• Megfelelő méret és kialakítás ( nyomáskülönbségek , hőmérs. és áramlási feltételeknek megfeleljen)

• Alkalmas legyen in situ gőzsterilezésre és a fluidomokkal való érintkezésre

• Belső felületek átlagos felületi érdessége 0,51-0,64 μm között legyen, amit elektropolírozással oldanak meg

• Korroziórezisztens felület (elektropolírozással)

• Könnyen tisztítható elemekből álljon

• Kondenzelvezetés biztosítása

(17)

Fermentációs levegő előszűrése

• Kompresszorok segítségével nagy nyomású levegő áramlás biztosítható

• Két féle kompresszor:

• Olajkenéses: a levegő előszűrése fontos az olajcseppek eltávolítása miatt

• Alkalmasak a gyantával kötött üvegszálas szűrők, amelyek a pozitív töltésük miatt akár 99,9 %-os hatékonysággal távolítják el a 0,01-0,5 μm –nél nagyobb víz-és olajcseppeket

(koaleszcens szűrők)

(18)

Fermentációs levegő előszűrése

• Olajmentes kompresszor: szennyeződések és vízcseppek eltávolítása

• Alkalmas szűrőtípusok: cellulóz , PP vagy

üvegszálas szűrők

(19)

levegő steril szűrése

• A levegőben lévő baktériumok és bakteriofágok, vírusok befertőzhetik a fermentlevet, ill. terméket

• Alkalmas szűrő típus a hidrofób membránok (víztaszító)

• 100%-os eltávolítási hatékonyság nedves vagy száraz körülmények között is

• Folyadékokra 0,2 μm abszolút szűrőképesség,

levegőre 0,01μm

(20)

Elmenő levegő/gáz szűrése

• Cél: bioreaktorokból kikerülő oragnizmusok megakadályozása. Ezek aeroszol cseppek

formájában távozhatnak a levegőárammal. Az aeroszolok mérete 1-5 μm , így a ciklonok nem tudják eltávolítani

• Ajánlott szűrő típus PP mélységi szűrő

előszűrőnek (1,2 μm), ami eltávolítja az aeroszol részecskéket, a sejteket tartalmazó

folyadélcseppeket és a kihabzást is megakadályozza

• Sterilszűrőként hidrofób membránszűrő (0,2 μm)

(21)

Folyékony alapanyagok szűrése

• A fermentációhoz felhasznált anyagokat ( víz, pufferek, tápanyagok, növekedési faktorok, habzásgátló) és a kész termékeket szűréssel

sterilizálni kell (a hőérzékeny anyagok minősége ne romoljon)

• Alkalmazott szűrőtípusok:

• Előszűrő: PP mélységi szűrő

• Sterilszűrő: hidrofil membránszűrő

(22)

Mycoplasma és vírus eltávolítása a tápoldatból

• Szérumok és egyéb biológiai anyagok

(növekedési faktorok stb.) tartalmazhatnak

mycoplasmát és vírust, amivel befertőzhetik a sejteket

• Mycoplasma szűrése: hidrofil membrán szűrővel (0,1 μm)

• Plazmában és szérumban lévő vírusok

eltávolítása szintén hidrofil membrán szűrővel

( 0,04 μm)

(23)

A fermentációs iparban használt

szűrőtípusok

(24)

SZŰRŐELEMEK A DOWNSTREAM MŰVELETEKBEN

• Downstream műveletek:

A fermentorból kapott anyagból nagy tisztaságú, szennyezőktől (endotoxin, baktériumok, részeckék és egyéb biológiailag aktív anyagok) mentes biológiailag aktív termék előállítása

• Műveletek:

• Sejt (főtömeg, maradék) és sejttörmelék eltávolítása

• Folyadék szűrése és tisztítása

• Termék tisztítása, koncentrálása, és sterilizálása

membránszűréssel

(25)

ELSŐDLEGES (FŐTÖMEG) SEJT ÉS SEJTTÖRMELÉK ELTÁVOLÍTÁS

• Fermentlé nagy szárazanyag tartalma és viszkozitása:

• Problémák a kivitelezhetőséggel, hatékonysággal és a gazdaságossággal

• Inkább centrifugálás, keresztáramú mikroszűrés (CFF)

• Szűrőelemek is alkalmazhatóak:

• nagy kapacitású mélységi előszűrők (gyors eltömődés megelőzésére)

• Előnyök:

• Egyszerű és gyors használat

• Alacsony beruházási költség

• Könnyebb, gyorsabb tisztítás és sterilezés

• Minimális folyadék- és termékveszteség

(26)

ELSŐDLEGES (FŐTÖMEG) SEJT ÉS SEJTTÖRMELÉK ELTÁVOLÍTÁS

• Az iparban kombinálják a centrifugálással

eltávolítják a szilárd anyag nagy részét, majd egy szűrőelem (1-2 µm alatt)

• Leggyakrabban pozitív töltéssel vagy töltéssel nem rendelkező polipropilén mélységi szűrőket alkalmaznak

• Emlős sejtek: 1-5 µm

• Baktériumok: 0,3-1 µm

• Nagy sejttörmelék koncentrációnál:

• nagy felületű gyantával impregnált

üvegszálas/polipropilén redőzött szűrők: 0,7-2,5 µm

(27)

MÁSODLAGOS (MARADÉK) SEJT ÉS SEJTTÖRMELÉK ELTÁVOLÍTÁS

• Hozzájárul a nagyobb tisztasághoz, a szűrt folyadék sterilizálásához (immobilizált illetve

mikrokarrier hordozó felületén növő sejteknél is)

• Koncentrációtól függően:

• Polipropilén mélységi szűrő (0,5 µm)

• Gyantával impregnált üvegszálas szűrő (1 µm)

• Hidrofil membránszűrő (0,45 vagy 0,2 µm) → sterilre ill.

tükrösre szűrés

(28)

VÍRUSSZENNYEZÉS

LEHETŐSÉGÉNEK CSÖKKENTÉSE

• Szennyezés: sejtkultúrából, szérumból vagy biológiai adalékanyagból

• Eltávolításuk:

• Az ultraszűrés sokszor nem alkalmazható, mert a fehérjéket is visszatarthatja

• Hidrofil membránszűrőkkel (0,04 µm) rögtön a kezdeti tisztítás után

• Magas fehérjekoncentrációjú fermentlé csökkenti a membránon történő adszorpció miatt bekövetkező veszteséget

• Kisebb aktivitás vesztés, mint a hőinaktiválásnál

• Gyors és egyszerű

28

(29)

KONCENTRÁLÓ ÉS TISZTÍTÓ RENDSZEREK VÉDELME

• Abszolút szűrők alkalmazásának előnyei:

•

Védik a rendszert a korai eltömődéstől és a befertőződéstől

•

Megnövelik a működési időt és lecsökkentik a takarítás és a cserélés gyakoriságának szükségességét

•

Alacsony beruházási költség, gazdasági hatékonysága könnyen bizonyítható

• Előszűrőként (polipropilén mélységi és porózus rozsdamentes acél szűrők) csökkentik a drága membránszűrők, ultraszűrők és kromatográfiás oszlopok terhelését

• Oldószerek, pufferek és más folyadékok sterilre szűrésével megvédik az aszeptikus környezetet

29

(30)

A TERMÉK VÉGSŐ TISZTÍTÁSA ÉS STERILRE SZŰRÉS

• A termék tovább szennyeződhet a tisztítási lépések után (gyűjtőtartályok)

• Tisztaság és sterilitás megőrzése érdekében szükséges még egy utolsó tisztítás a termék végső csomagolása, tárolása előtt

• Alacsony fehérjekötő képességű hidrofil membránszűrőkkel (0,2 µm):

• Tápközeg maradványainak eltávolítására, végső szűrésre és sterilre szűrésre

30

(31)

SZŰRŐELEMEK A KISZOLGÁLÓ RENDSZEREKBEN

• Víz:

• Injekció minőségű vízhez (WFI), készülékek mosásához (CIP:

cleaning-in-place), terméket tároló tartályok mosásához (WFI/DI), tisztított vízhez (PW)

• PP mélységi szűrő, hidrofil/hidrofób membránszűrők

• Vegyszerek és oldatok:

• Kristályosításhoz és tisztításhoz (aceton, alkoholok)

• Polipropilén mélységi és redőzött szűrő

• Levegő, nitrogén, egyéb gázok:

• Tartályok levegőztetéséhez, túlnyomás/vákuum biztosításához

• Keretes szűrő (redőzött polipropilén), hidrofób membrán

• Gőz:

• Tiszta gőzhöz (SIP: sterilization-in-place)

• Porózus rozsdamentes acél szűrő (1,2 µm)

31

(32)

(33)

SZŰRŐK GŐZSTERILEZÉSE

• In situ gőzsterilezés:

• Gőz: száraz, telített, szennyeződésmentes → rozsdamentes acél előszűrő

• Legalább 121 °C (100 kPa), 30 perc

• Elhelyezés: gőzkondenzátum el tudjon csorogni (szűrőházba ne), rövid steril csőhossz

• Minden csap és szelep kicsit nyitva (in situ) → zárni

• Gőz lezárása után inert nyomás a szűrőelemre (ellenirányú nyomás TILOS → integritás vesztés)

• Autoklávban sterilezés:

• Nem kondenzálható gázok eltávolítása

• Szűrőház teteje (a betéttel) és alja külön

• Kimeneti csonkoknál megelőzni a gőz bejutását

• Szűrőintegritás ellenőrzése sterilizálás után

(34)

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK

1. Bakteriális „challenge” teszt

• Szűrőelemek tényleges baktériumszűrő hatékonyságának vizsgálata (destruktív teszt)

• Pl.: 0,2 µm-es szűrő tesztelése ismert méretű sejteket tartalmazó Pseudomonas diminuta baktérium szuszpenzióval (min. 10

⁷

db sejt/cm

²

szűrőfelület)

• Tönkreteszi a szűrőt,

ezért termelési körülmények között NEM alkalmazható

• Korreláltatható nem destruktív tesztekkel (átáramoltatásos, nyomástartási és

buborékpont)

34

(35)

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK

2. Átáramoltatásos (Forward Flow) teszt

• Nedvesített szűrő és konstans levegőnyomás alkalmazása mellett mérjük a nedvesített membránon keresztül diffundált levegőáramot (ha adott max. érték alatt, akkor elfogadható)

• Downstream:

• Adott bemenő nyomás állandó értéken tartásához szükséges bemenő gázáram mérése

• Szűrő sterilizálása előtt/ steril szűrés után (áramlásmérő downstream oldalon)

• Upstream:

• Adott nyomás mellett az elmenő oldalon átdiffundált gáz mennyiségének mérése

• Sterilizálás előtt és után is

35

(36)

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK

3. Nyomástartási (Pressure Hold) teszt

• Az upstream átáramoltasásos teszt egyik módosított változata

• Nedvesített szűrő és szelepekkel lezárt szűrőház

• Gáznyomás csökkenésének mérése adott idő alatt, állandó szűrőelem- és gázhőmérséklet mellett

• Alkalmazható

• Sterilezés után

• Szűrés előtt/után

36

(37)

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK

4. Buborékpont (Bubble Point) teszt

• Vizuális teszt

• Nedvesített szűrő

• Levegő átnyomása a szűrőn növekvő nyomással, miközben az elmenő oldali buborékolást vizsgáljuk

• Buborékolás:

 Diffúziós levegőátvitelkor: lassú, szemmel követhető

 Buborékpont után: folyamatos

37

(38)

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK

5. Vízelárasztási (Water Intrusion) teszt

• Nedvesített szűrő

• Hidrofil membránnál alkohol oldattal, de ez termelési körülmények közt nem mindig alkalmazható