Az MS NEM kvantitatív módszer

(1)



FEHÉRJEAZONOSÍTÁS

Redukálás + alkilálás Enzimes emésztés

MS



AZONOSÍTOTT FEHÉRJE

FEHÉRJE LISTA ...…

...

PEPTID LISTA ...

...

MS / MS

I

m/z T

m/z I

fragmentáció

(2)

Kvantitatív tömegspektrometria

(3)

A kvalitatív analízis nem elegendő

 Előbb-utóbb feltámad az igény relatív mennyiségi meghatározásokra: azaz

különböző minták összehasonlítására – pl.

biomarker-keresés – diagnosztikára, prognosztikára stb.

 Abszolút mennyiségi meghatározás is kellhet

(4)

Az MS NEM kvantitatív módszer

* a különböző molekulák nem egyformán detektálhatók

pl. különböző peptidek relatív intenzitása nem tükrözi relatív mennyiségüket

* nem minden komponenst detektálunk az elegyekből

(5)

700 1200 1700 2200 m/z 0

2000 4000 6000 a.i.

700 1200 1700 2200 m/z

0 10000 20000

a.i.

/O=/2002/02majus/ge020516_6/1SRef/pdata/1 Administrator Thu Apr 7 14:15:06 2005

triptikus elegy CHCA-ban

Ugyanaz a triptikus elegy DHB-ben Csak egy példa

(6)

Observations

 Not the same proteins or at least not the same peptides were IDd when

complex mixtures were analyzed on the QSTAR as well as on the LTQ

 The QSTAR seemed to favor short peptides while much longer sequences were IDd on the LTQ

Kitérő a detektálás „teljességéről”

(7)

One more observation

 When the same peptide was IDd the

QSTAR usually picked the higher charge state

(8)

QSTAR/LTQ comparison

same sample, same day, same gradient

relatively high level, complex sample

gi|12517248 enolase [Escherichia coli O157:H7], MW ~ 46 kDa

Start - End Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Sequence

11 - 16 366.72 731.42 731.38 0.04 0 EIIDSR (Ions score 31)

17 - 46 952.62 2854.85 2855.35 -0.50 0 GNPTVEAEVHLEGGFVGMAAAPSGASTGSR (Ions score 98) 47 - 52 365.73 729.44 729.40 0.04 0 EALELR (Ions score 48)

67 - 82 746.79 1491.57 1491.88 -0.31 0 AVAAVNGPIAQALIGK(Ions score 112)**

86 - 92 373.70 745.39 745.36 0.03 0 DQAGIDK (Ions score 24) 93 - 103 624.69 1247.37 1247.61 -0.24 0 IMIDLDGTENK (Ions score 81) 106 - 120 730.27 1458.53 1458.82 -0.29 0 FGANAILAVSLANAK (Ions score 101) 185 - 195 419.53 1255.57 1254.62 0.95 0 MGSEVFHHLAK (Ions score 29)

201 - 231 996.92 2987.73 2988.45 -0.72 0 GMNTAVGDEGGYAPNLGSNAEALAVIAEAVK (Ions score 105) 232 - 239 404.73 807.44 807.41 0.03 0 AAGYELGK (Ions score 53)

258 - 266 475.65 949.28 949.49 -0.20 0 YVLAGEGNK (Ions score 42) 312 - 325 781.78 1561.54 1561.84 -0.29 0 IQLVGDDLFVTNTK (Ions score 89) 334 - 342 464.81 927.61 927.58 0.04 0 GIANSILIK (Ions score 41)

343 - 357 803.31 1604.60 1604.88 -0.28 0 FNQIGSLTETLAAIK (Ions score 85) 361 - 371 595.19 1188.37 1188.59 -0.22 0 DAGYTAVISHR (Ions score 83)^

372 - 393 1059.39 2116.77 2117.05 -0.28 0 SGETEDATIADLAVGTAAGQIK (Ions score 106) 406 - 411 403.75 805.48 805.44 0.03 0 YNQLIR (Ions score 35)

412 - 419 444.76 887.50 887.46 0.04 0 IEEALGEK (Ions score 37)

QSTAR only

LTQ only

(9)

QSTAR vs LTQ, Marla's

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention time [min]

IDd peptide MW

LTQ data QSTAR data

(10)

QSTAR vs LTQ, Marla's

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

0 5 10 15 20 25 30 35 40

retention time [min]

precursor ion (m/z)

LTQ data QSTAR data

(11)

QSTAR vs LTQ unique and overlapping IDs 6 protein mixture

41

92

85

QSTAR only

LTQ only

Average MH⁺ = 894.2 Da

Average MH⁺ = 1273.7

(12)

Unsupervised hierarchical clustering of N-linked

glycopeptides distinguishes

treated cancer-bearing mice (C1, C2, and C3) from untreated normal mice (N1a, N1b, and N2). … each row represents a peptide and each column represents a different serum sample. Red indicates a peptide with higher than average abundance in a specific sample, green indicates a peptide with lower than average

abundance in a specific sample, black indicates no changes in abundance, and gray indicates the data in a

specific sample is missing.

The sample from N1 was analyzed by LC-MS twice (N1a and N1b)

Zhang et al., MCP 4, 144.

Data acquired on QTOF 14/36 (~40%!!!) különbség a detektált m/z-ben

(13)

Hogy lehet ezt legyőzni?

csak nagyon hasonló peptidek relatív intenzitását vethetjük össze!

1) Jelöljünk két sejt-populációt hasonlóan, de megkülönböztethetően!

2) Keverjük össze az összes fehérjét!

3) A keveréket emésszük, analizáljuk!

És így kvantizhatunk!

* dinamikus detektálási tartomány?

* telítjük-e a detektort?

(14)

Hogy lehet ezt legyőzni?

 with great difficulties...

 gondos tervezéssel/kivitelezéssel levonhatunk mennyiségi

következtetéseket DERIVATIZÁLÁS

NÉLKÜL, KOMPLEX RENDSZEREKRŐL is

 Csak sokat kell bizonygatni

(15)

Cell/tissue imaging by MALDI

 R. Caprioli

 híres-hírhedt SELDI

 C. Jimenez

Mennyire működik jobban definiált, de komplex rendszerekben?

(16)

állandó mennyiségű emésztmény, plusz növekvő mennyiségű standard Fet-Rpeptid aCN [R/Fet]

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0 100 200 300 400 500 600

n [fmol]

Irel[R]/Irel[Fet]

1046.6/1072.6 1046.6/1155.6 1046.6/1252.6 1046.6/1274.6 1046.6/1385.5 1046.6/1474.8 1046.6/1513.6 1046.6/2008.9 1046.6/2030.9

Szájli Emília, SzBK

(17)

Hogy szól az LC-MS?

Waters „Protein expression system” – kvali és kvanti analízis derivatizálás nélkül

 2x3 precíz LC-MS kísérlet, CID válogatás nélkül

 2 ppm-en belüli pontosság MS és MS-MS is

 komplex szoftver

 jól definiált (értsd egyszerűbb) rendszerekre

 És nyilván itt sem látunk mindent

(18)

Hogyan jelölhetünk?

 ICAT – Cys-oldalláncának alkilezése, könnyű (H₈) és nehéz (D₈) alkil-csoporttal

→ amiben nincs Cys, az kiesik

→ a deuterált vegyület retenciós ideje kicsit hosszabb

azonosítás: MS-MS alapon

kvanti: relatív intenzitásokból ingadozás: van az 30% is!

(19)

Még ICAT

 A dúsításra használt biotin-farok sok komplikációt okoz

a) A biotin-streptavidin túlságosan szeretik egymást

b) Intenzív ionok a jelölésből, gyérebb fragmentáció az egészből < 50 % siker

 Van hasítható verzió is: így szabadulunk meg a biotintól

(20)

Hogyan jelölhetünk?

 SILAC (stable isotope labeling) C¹³, N¹⁵, O¹⁸

tápanyaggal visszük be – jelölt aminosav

→ Olyat kell választani, ami nem alakulhat át más aminosavvá, illetve nem szintetizálódik a sejtben

Tripszines emésztéshez Arg a menő!

a keveréket frakcionáljuk, emésztjük, analizáljuk azonosítás MS-MS alapon

kvanti a relatív intenzitásból

(21)

Két élesztő preparátum

összehasonlítása.

13C₆Arg volt az egyik tenyészet tápoldatában.

C. Guerrero et al.

MCP 5: 366-378 (2006)

(22)

SILAC kommentár

• Nyilván leginkább csak sejtkultúrában működik

Akkor viszont a legjobb megoldás, bár...

Néha a jelölt aminosav nem tökéletes (nem teljesen izotóp-jelölt)

A „turn-over” fehérjénként változik

• Hallottam már SILAC-jelölt csirkéről!

R.J. Beynon, Liverpool

(23)

Hogyan jelölhetünk?

 tripszines emésztés H₂O¹⁸-ban

Két oxigén lép be, minden peptid jelölődik Rengeteg információ

Még a szekvenálás is könnyebb, a C- terminális ionok csúsznak

DE beszárítás a normál emésztés után, hosszú enzimes inkubáció...

→ veszteségek, nem specifikus hasítások

(24)

O¹⁸-jelölt peptid MALDI-CID spektruma, csak egy O¹⁸ épült be

TOF-TOF hiE CID

(25)

N-terminális jelölés

 Formaldehid @pH 5-6, majd NaBH₃CN

 Me₂N-

 D₂-formaldehid a párja

 4 Da tömegkülönbség

J.L. Hsu et al. (2003) Anal. Chem. 75, 6843.

(26)

Az összes Lys is jelölődik, ebben a peptidben speciel 4 van

(27)

MS/MS nélkül nem triviális, mik a párok

(28)

BEMAD

 -elimináció, amit Michael-addíció követ – mondjuk normál és deuterált DTT

 Célzottan Ser/Thr poszt-transzlációs

módosítások helyzet-meghatározására és relatív kvantitatív mérésére

 Működik az általános protein populációra is – alkyl-Cys is elveszíti az oldalláncát

 Minél több derivatizálási lépés, annál több lehetőseg mellékreakciókra

(29)

Hogyan jelölhetünk?

 iTRAQ ™ (Applied Biosystems) Nagyon ravasz jelölés!

 amino-csoportra (N-terminus, Lys)

 4 (8)-féle stabil izotópos szerkezet, azonos additív tömeggel, de különböző fragmensekkel (m/z 114, 115, 116, 117) azonosítás és kvanti az MS-MS adatokból!

Ross et al., (2004) MCP 3, 1154.

(30)

(31)

(32)

(33)

Mass spectrometry based protein quantification methods

Tissue/

Cells Protein

Peptides MS Analysis

SILAC cICAT iTRAQ Internal

Standards O¹⁶/O¹⁸

(34)

Vigyázat, minden relatív

 Ha abszolút mennyiségekkel szeretnénk számolni, az is megoldható

 Belső standardnek proteotipikus peptidet válasszunk

 Lehet a peptid eleve izotóppal jelölt Gygi’s AQUA (Methods. 2005 Mar;35(3):265-73.)

 Vagy…

(35)

iTRAQ is használható abszolút mérésre

(36)

Mire jó ez az egész?

PÉLDÁUL:

 összehasonlítani a fehérje-szinteket a) különbözően kezelt sejtvonalakban

b) különböző szervekben, sejt-típusokban c) különböző páciensekben

(37)

Mire jó ez az egész?

PÉLDÁUL

 összevetni a fehérje-mennyiség és poszt-transzlációs módosítások

szintjének változását

 Vajon egy stimulus hatására több fehérje termelődik-e, vagy csak a foszforiláció szintje ugrik meg

(38)

Mire jó ez az egész?

PÉLDÁUL

 tanulmányozni fehérje-komplexek

összetételének mennyiségi és minőségi változását

(39)

Mire jó ez az egész?

PÉLDÁUL:

 TAP-TAG pucolás, IP – mert kölcsönható fehérjéket keresünk – ragad oda

mindenféle

 A wild-type sejteket megjelöljük, így kiszűrhetjük a potyautasokat

Tackett et al, J. Prot. Res. (2005) 4, 1752.

(40)

(41)

Alternatíva

 2D-gélek

 Simán és differenciál jelöléssel is (DIGE)

Annak is megvannak a korlátai

Nagy előnyük, hogy láthatóvá tehető

(Western) hány különböző formában van a fehérjénk jelen

(42)

“

Chemical Approaches for Functionally Probing the Proteome” Greenbaum et al., Mol. Cell. Proteomics, 2002; 1: 60 - 68.

Structures of the fluorescent ABPs DCG-04, Yellow-DCG-04, Red-DCG-04, Green-DCG-04, and Blue-DCG-04.

Egy speciális eset

(43)

Affinity labeling of papain family proteases using fluorescent ABPs.

(44)

Localization of protease activity in situ.

(45)

Példák „globális” proteomikai kísérletekre

 Retrográd fehérje-transzport sérült idegsejtekben

 Nagy volumenű foszforilációs analízis

(46)

Projekt: ideg-regeneráció vizsgálata

Modell: kontroll és sérült idegsejtek retrográd transzportjának 2D összehasonlítása

(Lymnaea stagnalis)

Egy példa „globális” proteomikai kísérletre

(47)

(48)

Tömegspektrometriás analízis

Gélben emésztés tripszinnel

1. Információ-függő LC-MS/MS analízis

LC: C-18 PepMap oszlop (75 m*150 mm), ~350 nl/min

5-50% B 30’ alatt (A: 0.1% hangyasav/víz B: 0.1% hangyasav/ACN) MS: QSTAR Pulsar w microionspray source

1s survey/ 5s CID scan, töltésfüggő ütközési energia

2. de novo szekvenálás 3. Homológia keresés

MS-Pattern (www.prospector.ucsf.edu)

MS-Blast (dove.embl-heidelberg.de/Blast2/msblast.html)

(49)

EMBOSS_001 1 MLKGQTRQDIHEDDNSGRKSTISTRAFVFTRSDPLIKARSGSLYSSRSSM 50 .|.:...:..||:|.|..||||.|||.| .::|.|..:.:|..

EMBOSS_001 1 MTSKISTTYEEEGRQSKIQPRAFVITRSGP--SSKSSSFSARQSYA 44

EMBOSS_001 51 NTRSSISPGVMQQLSSSGITDFRGNREKEKREMQNLNERLASYIEKVHFL 100 ::|.||:|||.|||||||||||||.|||||||||||||||||||||||||

EMBOSS_001 45 SSRQSITPGVYQQLSSSGITDFRGTREKEKREMQNLNERLASYIEKVHFL 94

EMBOSS_001 101 DAQCKKLEAENEALRNRKMEDLQPIRDAYENELAQARKVIDELSSSKGVA 150 |||.||||||||||||||.|.||||||||||||||||||||||||:|||:

EMBOSS_001 95 DAQVKKLEAENEALRNRKSESLQPIRDAYENELAQARKVIDELSSTKGVS 144

EMBOSS_001 151 EAKLVGLQDEISQLRDLIATYENQAKDYRKKIDSLGNQIGEYEGELHTLR 200 |||:.||||||:.||:||.|||||:|||||||:|||||||||||||||||

EMBOSS_001 145 EAKVAGLQDEIASLRELIVTYENQSKDYRKKIESLGNQIGEYEGELHTLR 194

EMBOSS_001 201 LRVGSLEDENAKLRELLDKIQEQNRSLRSDLDQETSAHIEAECLAQTKAE 250 :|.|||||||||:||||||||||||.||:|||.||:|||||:||||||.|

EMBOSS_001 195 IRCGSLEDENAKVRELLDKIQEQNRRLRADLDTETAAHIEADCLAQTKTE 244

EMBOSS_001 251 EAAFYKDLYEQIELMKPEPITIKGMDTADYWNSQMKKCLREINAAYDEKI 300 ||.|||||.:|:||:|||||.|||||.|::|.|::.||:|||.:||||||

EMBOSS_001 245 EAEFYKDLLDQLELLKPEPIQIKGMDYAEFWKSELSKCVREIQSAYDEKI 294

EMBOSS_001 301 DLIQQDCEAKFQAQVSSLRAGNVKDNLQLTNAQEEVKKLRAQLSDKNSAY 350 |:||||.|||:.||::|||:|||||.:||.:.||||||||.|..:||:.|

EMBOSS_001 295 DMIQQDTEAKYSAQLNSLRSGNVKDGMQLQHVQEEVKKLRTQAGEKNAMY 344

EMBOSS_001 351 AELATRIATLQAERDELARQVSDMERELESERLKYHTDITSLETELQAVM 400 ||||.:.|:||||||.:.||.|::|||||..|:||:.||..|..||.||:

EMBOSS_001 345 AELAAKFASLQAERDSIGRQCSELERELEELRIKYNQDIGDLSNELSAVL 394

EMBOSS_001 401 EQLQVLMDAKLSMELEIACYKKLLEGEESRVGLRSLVEQAIGTQSKGAAS 450 .|||:|.|||::||||||||:|||||||||||||||||||||.|.:|.||

EMBOSS_001 395 AQLQILTDAKITMELEIACYRKLLEGEESRVGLRSLVEQAIGVQGRGTAS 444

EMBOSS_001 451 LSDAIQQSKSTGSLTVQRSSKGALGFASIDHSGGNVVIENTTSGARAKNQ 500 |.|.||||.|:||:|:||||||.:.|.|:|.||.|:||||||||||||.|

EMBOSS_001 445 LKDTIQQSTSSGSMTIQRSSKGPIAFNSVDQSGSNIVIENTTSGARAKTQ 494

EMBOSS_001 501 SLKGWKLVKNSNGRNTVEVNLKDFDLGAGRSYTLWAKGAKDRASADNEQV 550 ||:||::.|...||....:.|||:::...||:|||||||||:|||||:

EMBOSS_001 495 SLRGWRIDKTVAGRVAASIQLKDYEIPPNTKYTIWAKGAKDRATADNEQI 544

EMBOSS_001 551 ADNFSFGVGTCVWKLLDEAGNEKATLNAKFSG 582 ||.||.|||:|.|.::||||||||||.|||||

EMBOSS_001 545 ADIFSLGVGSCTWTIVDEAGNEKATLIAKFSG 576

Miért kell de novo szekvenálás?

Intermediate filament protein A

(Aplysia californica) (Helix aspersa)

# Length: 582

# Identity: 408/582 (70.1%)

# Similarity: 480/582 (82.5%)

# Gaps: 6/582 ( 1.0%)

# Score: 2094.5

Triptikus peptidek szempontjából 12% átfedés

(50)

1 MTSKISTTYE EEGRQSKIQP RAFVITRSGP SSKSSSFSAR QSYASSRQSI TPGVYQQLSS SGITDFRGTR EKEKREMQNL 81 NERLASYIEK VHFLDAQVKK LEAENEALRN RKSESLQPIR DAYENELAQA RKVIDELSST KGVSEAKVAG LQDEIASLRE 161 LIVTYENQSK DYRKKIESLG NQIGEYEGEL HTLRIRCGSL EDENAKVREL LDKIQEQNRR LRADLDTETA AHIEADCLAQ 241 TKTEEAEFYK DLLDQLELLK PEPIQIKGMD YAEFWKSELS KCVREIQSAY DEKIDMIQQD TEAKYSAQLN SLRSGNVKDG 321 MQLQHVQEEV KKLRTQAGEK NAMYAELAAK FASLQAERDS IGRQCSELER ELEELRIKYN QDIGDLSNEL SAVLAQLQIL 401 TDAKITMELE IACYRKLLEG EESRVGLRSL VEQAIGVQGR GTASLKDTIQ QSTSSGSMTI QRSSKGPIAF NSVDQSGSNI 481 VIENTTSGAR AKTQSLRGWR IDKTVAGRVA ASIQLKDYEI PPNTKYTIWA KGAKDRATAD NEQIADIFSL GVGSCTWTIV 561 DEAGNEKATL IAKFSG

9.7 + 22.2 % = 31.9%

Mascot: "de novo“ + homológia

KLEAENEALR [100-110] VQEQNRR [214-220]

LLEGEESR [417-424] ELEEQR [371-376]

LASYIEK [84-90] EMQNLNER [76-83]

LRADLDTETAAHIEADCLAQTK [221-242] KLLEGEESR [416-424]

LASYIEKVHFLDAQVK [84-99] VGSLEDENAK [197-206]

KVIDELASSK [132-141]

VIDELASSK [133-141]

YASQLNQLR [305-313]

VHFLDAQVK [91-99]

NAAYAELATR [341-350]*

Intermediate filament protein TLVEQAIGTQSK [429-440]*

#124233 (Helix aspersa) LAGLQDEIGSLR [148-159]

#102672 (Aplisia californica) GM(O)DYADFWK [268-276]

---QLSSSGITDFK [48-67]

ELIVTYE---K [160-170]

---DELAR [357-369]*

(51)

Tanulságok

134/172 gélpöttyből összesen 43 különböző fehérjét találtunk

Azonosítottunk poszt-transzlációs módosításokat is (N-terminális acetiláció, glikoziláció, szulfatálás)

Gélkép alapján a várttól eltérő tömegű fehérjék proteolízis

keresztkötés / ubiquitinálódás?

Pellet 2 (ultrafuga) – down-reguláció – membránhatárolt vezikulák retrográd transzportja gátolt

Két legprominensebb fehérje – intermediate filament protein és aktin triviális? – citoszkeleton sérülés eredménye

NEM – egyéb abundáns citoszkeletális fehérjék

(neurofilament, spectrin) mennyisége nem változott funkcióval bír?

(52)

(53)

Comprehensive Identification of

Phosphorylation Sites in Postsynaptic Density

Preparations

J.C. Trinidad , C.G. Specht, A. Thalhammer, R. Schoepfer, A.L. Burlingame

Mol. Cell. Prot. 2006, 5: 914-922

(54)

Némi bevezetés a

foszforilációról

(55)

One of the most important regulatory events:

turns proteins on and off

induces or prevents other post translational modifications in the same protein

signaling pathways : phosphorylation cascades

Biological significance

(56)

Difficulties

a) Dynamic process : kinase vs. phosphatase – both must be blocked during isolation b) Phosphorylation often @ low level (<5%)

c) Lower ionization efficiency – signal of phosphopeptides suppressed

Enrichment is a must at protein level at peptide level

(57)

Enrichment methods

 Ion exchange on SCX

 IMAC : Fe(3+), Ga(3+)…

 binding at low pH

 TiO₂, ZrO₂

 Immunoprecipitation (only for pTyr)

(58)

Foszfopeptidekkel „spékelt”

emésztési elegy - MALDI-TOF MS

1200 1700 2200 m/z

5000 10000 15000 20000 25000

a.i.

/O=/bruker/2006/06november/ke061110_02/2SRef/pdata/1 Administrator Tue Nov 14 15:20:35 2006

P

PP P

(59)

TiO

₂

– dúsítás után

1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 m/z

10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000

a.i.

/O=/bruker/2006/06november/ke061109_01/2SRef/pdata/1 Administrator Tue Nov 14 15:23:32 2006

P P P

P P

P

(60)

A projektről

• In the mammalian central nervous system, the structure known as the postsynaptic density (PSD) is a dense complex of proteins whose function is to detect and respond to

neurotransmitter released from presynaptic axon terminals. Regulation of protein

phosphorylation in this molecular machinery is critical to the activity of its components,

which include neurotransmitter receptors,

kinases/phosphatases, scaffolding molecules, and proteins regulating cytoskeletal

structure.

(61)

Trinidad, J. C. (2006) Mol. Cell. Proteomics 5: 914-922

Quality control of the purified PSD samples by Western blotting

Olyan fehérjék jelenlétét

teszteljük,

amiről tudjuk, hogy a komplex része, illetve szennyező lehet

(62)

Schematic representation of the experimental workflow

Meghatározható megbízhatóan milyen fehérjék vannak jelen

(63)

Identification of protein components of purified PSD samples

Miért is jó a kation-csere a

„negatív”

foszfopeptidekre?

(64)

Hány fehérje is van a komplexben?

• Interpretation of the spectra using Mascot resulted in 17,391 positive

peptide identifications of which 9,236 were to non-redundant peptide

sequences.

• 1,264

proteins were identified in the

PSD preparation with a median sequence

coverage of 17%

(65)

Mit tudtunk meg a foszforilációról?

• The 998 phosphopeptides reported here were limited to those identified with a Mascot expectation value less than 0.05 when searched against the restricted

PSD fraction protein dataset.

(66)

A, the relative distribution of phosphoserines (pS), phosphothreonines (pT), and phosphotyrosines (pY)

(67)

Ez volt az első lépés

• Belőttük a módszert

• Kaptunk egy kvalitatív képet

• Most jön a kvantitatív része:

agy-régiók összehasonlítása

(68)

J. Trinidad UCSF

(69)

Singly phosphorylated, iTRAQ-labeled phosphopeptide from CaMK II alpha

(70)

CaMK II protein expression,

both replicates

1011 proteins were identified and quantified in both analyses.

(71)

Mit lehet ezzel kezdeni?

• Fehérjék relatív mennyiségi meghatározása a különböző agy-régiókban

• Foszforiláció relatív mennyiségi

meghatározása a különböző agy-régiókban

• Össze lehet hasonlítani a fehérje-szint változásokat a poszt-transzlációs

szintváltozással – hogy is zajlik a reguláció

(72)

Mit lehet ezzel kezdeni?

Hierarchical Clustering of Protein Expression Reveals

Coregulated Clusters

(73)

És a jövő?

• Az itt tanultakat különböző betegség- modelleken lehet hasznosítani

Epilepsziára? Depresszióra? Pánik-

betegségre? Stb.

(74)

Minta kérdések

• Mitől függ, mennyire jó egy adatbázis?

• Mi az oka, hogy nincs tökéletesen

működő adatbázis-lekereső szoftver?

• Miért van szükség proteomikára?

• Miért kell „jelölni” kvantitatív proteomikában?

• Miért előnyös egy olyan jelölés, ami

minden peptidet módosít? És valóban

módosít-e minden peptidet?

(75)

Hasznos web-oldalak

ProteinProspector – http://prospector.ucsf.edu MS-BLAST - http://dove.embl-

heidelberg.de/Blast2/msblast.html

BLAST - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

European Bioinformatics Institute - http://www.ebi.ac.uk/

Szekvencia-összehasonlítás –

http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html

MS kezdőknek - „What is mass spectrometry” - www.asms.org