Tömegspektrometriai mérések alapjai és alkalmazásuk

(1)

Tömegspektrometriai mérések alapjai és alkalmazásuk

TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0012 projekt

Kóti János

Szerkezetkutatási osztály Richter Gedeon Nyrt.

2013. Május 7. Szeged

Richter

Budapest

Szerkezetkutatási osztály laboratóriumai

„Nagym szerek tárháza” NMR: 400MHz

NMR: 500MHz NMR: 600MHz

(2)

NMR: 800MHz FT-IR

Direkt EI-MS, EI-HRMS GC-EI-HRMS

Direkt / HPLC-API-MS

Thermo Accela HPLC-LTQ-FT- ICR-Ultra hibrid tömegspektrométer

LTQ-XL

ICR cella ECD+IRMPD

1. MS

2. MS

MS

ⁿ

CID fragmentáció

Pontos tömegmérés

+ fragmentáció

HPLC-API-MS n _-HRMS

(3)

Minta = Feladat

Ismert összetétel Ismeretlen komponens a mintában vagy ismertlen „termék”

Rutin elemzés= HPLC/GC v.

HPLC/GC-kisfelbontású MS

•Min ségellen rzés

•Gyártásközi analitika

•Végtermék min sítés

•Tisztításellen rzés

•stb…

Szerkezetmeghatározás NMR + IR+ nagyfelbontású MS

Szerves tömegspektrometria alkalmazása

Kiss Attila: „BIO” Tömegspektrometria

http://szerves.science.unideb.hu/ms-bio_vegso.pdf

Dr. Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai IX. fej.

Edison House kft. 2006

Dinya Zoltán: Szerves tömegspektrometria, Debreceni Egyetem Kossuth kiadó 2001

Pécsi Egyetem munkatársai: M szeres analitika gyakorlat IX. fej http://tamop412a.ttk.pte.hu/files/kemia7/www/book.html

Elérhet3 irodalmak teljesség nélkül

google.hu

Tömegspektrometria

Sikeres analitikai eszköz:

Kis anyagmennyiséget igényel (mikro-femto gramm) Kiváló érzékenység

Könnyen kapcsolható elválasztástechnikai eszközökkel (GC, HPLC, CE, ICP)

Molekulatömeg, és fragmentáció révén szerkezeti információt szolgáltat

Lényege: gázfázisú ionok fajlagos tömegük (molekulatömeg m/ töltés z) szerinti elválasztása

Hátránya: destruktív technika, azaz a minta nem nyerhet vissza mint pl NMR esetén

Gázfázisú ionok Tömegspektrometria

IONIZÁCIÓ

IONIZÁCIÓ IONFORRÁS

SZÁMÍTÓGÉP

ELVÁLASZTÁS ANALIZÁTOR

JELFELDOGOZÁS DETEKTOR

Vákuum rendszer Tömegspektrométer elvi felépítése

Minta bevitel

IONFORRÁSOK:

Gázfázisú ionok létrehozása

* valamilyen energia közlés révén

* és ezek eljuttatása az analizátorba

Fontos, hogy a minta kompones(ek)

hogyan reagálnak az energia közlésre

(4)

Cél: molekulatömeg és szerkezeti információ kinyerése Figyelembe kell venni az anyag „energetikai természetét”

-Termikus stabilitás -Illékonyság -H re érzékeny -Ionizálhatóság

-Elviseli-e a közölt energiát

Ezért különböz ionforrásokat kellet létrehozni EI, ESI, leggyakoribb

APCI, MALDI, gyakori

APPI, CI, FIB, kevésbé használt

Hard illetve soft ionizációs technikák

http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/lib/lctalk/47/47intro.html

EI: elektron ionizáció vagy elektron ütközéses ionizáció

http://tamop412a.ttk.pte.hu/files/kemia7/www/ch09s02.html

70 eV

http://www.lamondlab.com/MSResource/LCMS/MassSpectrometry/electrosprayIonisation.php

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/apci-ionisation.html APCI: Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció

Analizátorok teljesítmény jellemzői

Tömegtartomány 10-50 t l—1000-2000 általában TOF elvileg igen nagy akár 100 000 feletti is

Pásztázási sebesség: mili sec– néhány sec Felbontó képesség: egysényit l– nagyfelbontásig R~20000

de lehet akár FVHM~1 000 000 (ICR esetén) Érzékenység 10 ^-9 t l-akár 10 ^-15 g-ig

Analizátorok típusai:

- Kett s fókuszálású szektor - Ioncsapda - Kvadrupol

- TOF

- ICR

- Orbitrap

(5)

Functional Description Manual MAT95XP Revision B; 2/03; 5_3-5_4; 15_2

Kett s fókuszálású szektor analizátor

http://departments.agri.huji.ac.il/zabam/Polaris-Q.html

Ioncsapda analizátor

Kvadrupol analizátor

http://www.shimadzu.com/an/lcms/support/intro/lib/lctalk/61/copy_of_61intro.html

Repülési id analizátor

ESI-kvadrupol-TOF

Waters Q-Tof Premier

http://penyfan.ugent.be/labo/joelv/Qtof.html

ICR cella (Penning csapda)

Detektor elektród

Tüköráram

Frekvencia spektrum FT

_Intenzitás

MS spektrum

ICR analizátor

http://www.rigaslabs.gr/rigaslabs/products/show.html?pid=15

Orbitrap analizátor

(6)

Direkt méréstechnikák

nanoESI FIB

EI GC-MS

LC-MS

A tömegspektrometria gyógyszeripari alkalmazásának új lehet ségei metabolitok és mikroszennyez k szerkezetvizsgálatában;

Háda Viktor, Kóti János

MBKE Gyógyszerbiokémiai Szakosztály tudományos ülése; 2007. május 21. – május 23., Balatonöszöd

Tömegspektrum „keletkezése”

Elektron ionizáció

szektor készülék

példáján keresztül

(7)

(8)

Tömegspektrum „feldolgozása”

Alapfogalmak

Total Ion Chromatogram

Tömegspektrum

Y: relativ intenzitás (%)

X: id (perc)

X: faljagos tömeg m/z Y: relativ intenzitás (%)

Átlagolt tömegspektrum

(9)

Minta f komponensének átlagolt spektruma

Fragmens ionok Molekula ion

Bázis ion Molekulaion:

EI-ben gyök és ion egyszerre

.

Molekulaion:

.

De miért van 4 vonal mikor egy vegyület?????

Molekulaion:

.

Izotóp eloszlás !

Kis kitér …

„Elektrospray” ionizáció ESI tömegspektrum

[ ]

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

983.18405

860.41167 1146.88056

764.92195

1376.05500

688.53031 269.06250

1021.47703

1852.96175 1582.47993 1191.55618

1427.22098

445.12049 629.66721 1263.52767

ESI spektrum

Melyik a molekulaion???

(10)

6750 6800 6850 6900 6950 7000 7050 7100 m/z

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

6872.23

6913.25

7000.15 6888.22

6744.17

6872.05

6801.20 6922.23 6986.23

6785.21 7041.17

7081.19

6727.21 7098.12

57 dez-Ala-dez-Gly

71 dez-Ala

[M+H] ⁺ -ra dekonvolvált tömegspektrum

TIC, relatív intenzitás,

fajlagos tömeg, tömegspektrum, molekulatömeg, molekulaion,

bázis ion, fragmens ion

Alapfogalmak:

Tömegspektrum „feldolgozása”

Spektrumfejtéshez szükséges fogalmak,

ökölszabályok

Valaki: „A tömegspektrometria empírikus tudomány”

,

Szerkezeti izoméria Spektrum jellege

Tf 220 C

ku45374_p-2621_xp10437#12-19RT:1.45-2.35AV:8NL:1.59E7 T:+ c EI Full ms [19.50-650.50]

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

211

256

213 238

195 237

165 209

161 207

152 181

77 91103105115 151153 178183 214225 239 257

166 196 240

28 394351556576788995 107119128131145 176177 191 226 254 274

2729 62 69 82 198 227 253 258265 282290295

C ₁₆ H ₁₆ O ₃

M=256

ku49933_v-il-283ny_xp12881#37-47RT:4.20-5.36AV:11NL:6.13E7 T:+ c EI Full ms [19.50-450.50]

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

256

91

55

202

92 257

65 29 165

39 227

28

203 201

4153 6368 77 8995 104 117 130137 173 187 226 258

32 43 215 229

M=256

C ₁₅ H ₁₆ O ₂ N ₂

Szerkezeti izoméria

Spektrum jellege

ku50971_pe-1640_xp13298#20-28RT:2.23-3.16AV:9NL:6.82E7 T:+ c EI Full ms [19.50-450.50]

50 100 150 200 250 300 350 400 450

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

109

256

257 110

83

119 147

28 51 6577 92

M=256

C ₁₅ H ₁₃ ON ₂ F

Szerkezeti izoméria

Spektrum jellege

(11)

Szerkezeti izoméria Spektrum jellege Izotópeloszlás

ku48307_mat-153_xp12041#1-5RT:0.02-0.53AV:5NL:5.63E6 T:+ c EI Full ms [19.50-600.50]

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

64

256

128 160

192

32 96 258

66

130 162 194

28 98 224 260

76

3444 68 132 164 196 226 262

M=256

O Cl

NCO

N O N H

O

Cl N Ph

82 1. 2. 3. N N(CH ₃ ) ₂

O 82

M = 189

M = 338

M = 189

M = 338 Nitrogén szabály

1094#124-144RT:14.83-17.23AV:21NL:1.20E7 T:+ c EI Full ms [ 19.50-500.50]

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

127.0

280.0

282.0

153.0

129.0

155.0 125.0

63.1 90.092.0 284.0

39.0 62.1 75.076.3 99.0111.0

38.0 45.5 113.0 130.0140.0 156.0167.0185.0198.0 219.0 237.0244.0 262.0279.0 285.0294.0

x8

M ^+• = 280

153 127

O N H N

H

Cl 127 Cl

153 H

Paritás

„Klór” Izotópeloszlás

CH 3

O N O

121 -O 107 -NO

M=137 Nitrocsoport átrendez dés

65 -C ₂ H ₂

39 -C ₂ H ₂

91 -NO ₂

CH 3

O N O

107 M=137 Fragmentációs utak

77, 79 -HCOH -CO 51

-C ₂ H ₂

O H

K ₂ CO ₃

Cl O

Cl Br

146 146

M = 163 M = 253

146 146

M = 163 M = 253

(12)

E:\1270 05/13/2004 03:19:47 PM 48/MT/1 1270#21-37RT:2.81-4.92AV:17NL:8.21E5

T:+ c EI Full ms [ 19.50-700.50]

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

163

91 135

253

55

93 218

121

255 134 162

137 164

29 118 133 299

77 106 146

273839414351566566747880 9495 107 122132 148161 165176 190210217219224 252 256257 281 295 300

M ₂ ^+• = 297 M ₁ ^+• = 253

Izotópeloszlás

O

R OOH O

NH ₂

S 90 O

NH ₂ S

O O 90

M = 166 M = 198

E:\1415 06/28/2004 02:40:28 PM BI-1703

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

196

122

150 180

166 138 95

78 197

4445 6369 111 198

2830 39 5052626470 798493 105110 121123137 149151 168 181

27 212

M ^+• = 196

180 150

166 S

O

NO ₂

90 M = 196

COOH H ₂ N N H NH ₂

S

+ 1. cc. H 2 SO 4

2. NaOH

N N S NH ₂

N N N H SH vagy

95 95 95

M = 140

M = 195 M = 195

95 95 95

M = 140

M = 195 M = 195

Szerkezeti izoméria

N N S NH ₂

N N N H

SH

95 vagy 95

122 139 122 122

H H

95 95

A B

E:\1116 04/02/2004 10:46:24 AM ZSO-3960

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

m/z 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

RelativeAbundance

195

74

122 139

95 121 196 75

153

60 69 76 94 107109 136 197

28314447505763 8193 96 119 123 140142 154 167176185194 198205 219223 233239249 259

M ^+• = 195

122 139

N N

S N H ₂

1 3 9

95

153

(13)

Tandem tömegspektrometria ms/ms

Functional Description Manual MAT95XP Revision B; 2/03; 5_3-5_4; 15_2

Kett s fókuszálású szektor analizátor

Forróné Kiss Adrienn: Szakmai gyakorlat Konzulensek: dr. Béni Zoltán, Kóti János

Richter Szerkezetkutatási osztály 2006 július 10 - 14.

Feladat: Szteroidok szerkezetvizsgálata

sz-1870 #26-49 RT: 3,02-5,77 AV: 24 NL: 7,07E6 T: + c EI Full ms [ 19,50-500,50]

50 100 150 200 250

m/z 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

RelativeAbundance

218

272 190 161

91 122

79 93 106 219

67 147 162 273

41 108

55 133 174 215 257

28 53 230 239

274 258

2

-ketandrén EI spektruma

CH ₃ O

CH ₃ H H H

M ^+• = 272

sz1870eidau #1-10 RT: 0,03-1,76 AV: 10 SM: 3B NL: 2,83E6 T: + p EI Full ms2 272,25@4644,00 [ 49,50-284,24]

50 100 150 200 250

m/z 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

RelativeAbundance

272

257

230

218 215 254

176 214 244

213 239

162 108 110 144 148 177 202 258

95 283

90 70 65

x200

2

ketandrén m/z = 272 EI leányion spektrum

sz1870eidau#13-24 RT: 2,99-6,04 AV: 12 SM: 3B NL: 3,11E6 T: + p EI Full ms2 218,24@4639,00 [ 49,50-227,95]

60 80 100 120 140 160 180 200 220

m/z 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

RelativeAbundance

218

190

200 203 122

174 189

123 147 149 160 176 215

97 110 121 227

96 124

81 61 78

58 x200

2

ketandrén m/z = 218 EI leányion spektrum

(14)

sz1870eidau #25-33 RT: 8,81-11,28 AV: 8 SM: 3B NL: 1,06E7 T: + p EI Full ms2 190,28@4644,00 [ 49,50-198,81]

60 80 100 120 140 160 180

m/z 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

RelativeAbundance

190

161 162 175

134 147 185

108 120 149 197

94 97 81 91 58 61 75

x20

2

ketandrén m/z = 190 EI leányion spektrum

CH₃O

CH₃

m/z = 272

O

CH₃

m/z = 257 .

CH₃

m/z = 254 CH₃

m/z = 230 CH₃O

C H₃

m/z = 218 - CH3

- H2O

-COCH2 -C4H6

O

C H₃

.

m/z = 203 - CH3

C H₃

m/z = 200 - H2O

C H₃

m/z = 190 - CO

C H3

m/z = 174 - COCH2

C H₃

m/z = 122 C O H3 -

C H₃

m/z = 161. -CH2CH3

2ketandrén fragmentációja

Tömegspektrometriai mérések alapjai és alkalmazásuk

Tömegspektrometriai mérések alapjai és alkalmazásuk

TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0012 projekt

Kóti János

Szerkezetkutatási osztály Richter Gedeon Nyrt.

2013. Május 7. Szeged

Richter

Budapest

Budapest

Szerkezetkutatási osztály laboratóriumai

„Nagym szerek tárháza” NMR: 400MHz

NMR: 500MHz NMR: 600MHz

NMR: 800MHz FT-IR

Direkt EI-MS, EI-HRMS GC-EI-HRMS

Direkt / HPLC-API-MS

Thermo Accela HPLC-LTQ-FT- ICR-Ultra hibrid tömegspektrométer

LTQ-XL

ICR cella ECD+IRMPD

1. MS

2. MS

MS

CID fragmentáció

Pontos tömegmérés

+ fragmentáció

HPLC-API-MS n -HRMS

Minta = Feladat

Ismert összetétel Ismeretlen komponens a mintában vagy ismertlen „termék”

Rutin elemzés= HPLC/GC v.

HPLC/GC-kisfelbontású MS

•Min ségellen rzés

•Gyártásközi analitika

•Végtermék min sítés

•Tisztításellen rzés

•stb…

Szerkezetmeghatározás NMR + IR+ nagyfelbontású MS

Szerves tömegspektrometria alkalmazása

Kiss Attila: „BIO” Tömegspektrometria

http://szerves.science.unideb.hu/ms-bio_vegso.pdf

Dr. Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai IX. fej.

Edison House kft. 2006

Dinya Zoltán: Szerves tömegspektrometria, Debreceni Egyetem Kossuth kiadó 2001

Pécsi Egyetem munkatársai: M szeres analitika gyakorlat IX. fej http://tamop412a.ttk.pte.hu/files/kemia7/www/book.html

Elérhet3 irodalmak teljesség nélkül

google.hu

Tömegspektrometria

Sikeres analitikai eszköz:

Kis anyagmennyiséget igényel (mikro-femto gramm) Kiváló érzékenység

Könnyen kapcsolható elválasztástechnikai eszközökkel (GC, HPLC, CE, ICP)

Molekulatömeg, és fragmentáció révén szerkezeti információt szolgáltat

Lényege: gázfázisú ionok fajlagos tömegük (molekulatömeg m/ töltés z) szerinti elválasztása

Hátránya: destruktív technika, azaz a minta nem nyerhet vissza mint pl NMR esetén

Gázfázisú ionok Tömegspektrometria

IONIZÁCIÓ

IONIZÁCIÓ IONFORRÁS

SZÁMÍTÓGÉP

ELVÁLASZTÁS ANALIZÁTOR

JELFELDOGOZÁS DETEKTOR

Vákuum rendszer Tömegspektrométer elvi felépítése

Minta bevitel

IONFORRÁSOK:

Gázfázisú ionok létrehozása

* valamilyen energia közlés révén

* és ezek eljuttatása az analizátorba

Fontos, hogy a minta kompones(ek)

hogyan reagálnak az energia közlésre

Cél: molekulatömeg és szerkezeti információ kinyerése Figyelembe kell venni az anyag „energetikai természetét”

-Termikus stabilitás -Illékonyság -H re érzékeny -Ionizálhatóság

-Elviseli-e a közölt energiát

Ezért különböz ionforrásokat kellet létrehozni EI, ESI, leggyakoribb

APCI, MALDI, gyakori

APPI, CI, FIB, kevésbé használt

Hard illetve soft ionizációs technikák

http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/lib/lctalk/47/47intro.html

EI: elektron ionizáció vagy elektron ütközéses ionizáció

http://tamop412a.ttk.pte.hu/files/kemia7/www/ch09s02.html

70 eV

http://www.lamondlab.com/MSResource/LCMS/MassSpectrometry/electrosprayIonisation.php

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/apci-ionisation.html APCI: Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció

Analizátorok teljesítmény jellemzői

Tömegtartomány 10-50 t l—1000-2000 általában TOF elvileg igen nagy akár 100 000 feletti is

HPLC-API-MS n _-HRMS

de lehet akár FVHM~1 000 000 (ICR esetén) Érzékenység 10 ^-9 t l-akár 10 ^-15 g-ig