-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums FT-IR Spektroskopische Untersuchungen an der Ca

Volltext

(1)

an der Ca

2+

-ATPase

des Sarkoplasmatischen Retikulums

Dissertation

zur Erlangung des Grades des

Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät Chemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Carola Ulbrich

(2)

Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund und dem Laboratoire de Biophysique Moleculaire et Cellulaire, Centre d’ Études Nucléaires, Grenoble, Frankreich durchgeführt.

Tag der mündlichen Prüfung: 20.6.2000

Prüfungsvorsitzender: Prof. Dr. Christof Wöll 1.Gutachter: Prof. Dr. Klaus Gerwert

(3)

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INHALTSVERZEICHNIS:

1 ZUSAMMENFASSUNG 1

2 EINLEITUNG 2

2.1 Die Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums 2

2.1.1 Die Ca2+-ATPase 2

2.1.2 Reaktionszyklus und Reaktionsmechanismus 3

2.1.3 Struktur der Ca2+-ATPase 4

2.1.4 Die hochaffine Kationen-Bindungsstelle 6

2.1.5 Magnesiumbindung 8

2.1.6 Umkehrung des Reaktionszyklusses - Phosphorylierung durch Phosphat

und Magnesium 10 2.1.7 Thapsigargin 11 2.2 Caged Verbindungen 11 2.2.1 Caged Phosphat 12 2.2.2 DM-Nitrophen 13 2.3 Infrarotspektroskopie 15 2.3.1 Das Michelson-Interferometer 16 2.3.2 FT-IR Differenzspektroskopie mit der Rapid Scan Technik 18

2.4 Fluoreszenzspektroskopie 21

2.4.1 Theorie 21

2.4.2 Fluoreszenzmessungen an der Ca2+-ATPase 22

2.5 Zielsetzung 23

3 EXPERIMENTELLER TEIL 24

3.1 Materialien und Chemikalien 24

3.1.1 Chemikalien 24

3.1.2 Enzyme 25

3.1.3 Spezielle Materialien 26

3.1.4 Geräte 26

3.2 Chemische Synthesen 28

(8)

3.2.2 Synthese von Caged Phosphat [18O]4P 32

3.2.3 HPLC-Analyse von Caged Phosphat 33 3.2.4 Nachweis von anorganischem Phosphat 33

3.3 Präparation des Sarkoplasmatischen Retikulums 34

3.3.1 Präparation der Vesikel 34

3.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 35 3.3.3 Bestimmung der spezifischen Proteinaktivität 35

3.4 Fluoreszenzmessungen an der Ca2+-ATPase 36

3.4.1 Fluoreszenzmessung zur Bestimmung des Calciumgehalts der

Präparationsmethode 36 3.4.2 Intrinsische Proteinfluoreszenzmessungen 38

3.5 FT-IR Spektroskopie 39

3.5.1 Messanordnung 39

3.5.2 Messparameter 40

3.5.3 Präparation des Proteins für die FT-IR Messungen 42 3.5.4 Präparation der FT-IR Proben 43 3.5.5 Zusammensetzung der FT-IR Proben 44

3.6 Datenauswertung und Datenbearbeitung 47

3.6.1 Berechnung der Differenzspektren aus den Interferogrammen 47 3.6.2 Berechnung der Differenzspektren mit interner Referenz 47 3.6.3 Berechnung der Proteinspektren 48

3.6.4 Kinetische Auswertung 49

4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 50

4.1 FT-IR spektroskopische Untersuchungen an DM-Nitrophen 50

4.1.1 Photolyse 50

4.1.2 Postphotolytische Reaktionen von DM-Nitrophen 53

4.2 FT-IR spektroskopische Untersuchungen der hochaffinen

Kationen-Bindungsstelle der Ca2+-ATPase 56

4.2.1 Modellspektren: EDTA in H2O und D2O 56

4.2.2 Calciumbindung an die Ca2+-ATPase in H

2O und in D2O 59

4.2.3 Strontiumbindung an die Ca2+-ATPase in H2O und D2O 63

(9)

4.3 Magnesiumbindung an die Ca2+-ATPase 75

4.3.1 FT-IR Spektroskopische Untersuchung der Magnesiumbindung 75 4.3.2 Diskussion der Magnesiumbindung 78

4.4 FT-IR spektroskopische Untersuchungen an Caged Phosphat 81

4.4.1 Photolyse 81

4.4.2 Zuordnung durch Isotopenmarkierung 82

4.4.3 Einfluss von Magnesium 86

4.4.4 Photolysespektren mit DTT 87 4.4.5 Diskussion zur Bandenzuordnung der Photolysebanden 88

4.5 Phosphorylierung der Ca2+-ATPase mit Phosphat und Magnesium 91

4.5.1 Random Mechanismus der Phosphorylierung mit Phosphat und

Magnesium 91

4.5.2 FT-IR Untersuchungen der Phosphorylierung über den Random

Mechanismus 94

4.5.3 Phosphorylierung durch Magnesiumfreisetzung aus

DM-Nitrophen-Magnesium 94 4.5.4 Phosphorylierung durch Freisetzung von Phosphat aus Caged Phosphat 96

4.5.5 Diskussion der Phosphorylierung 106

(10)

1 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden Teilschritte im Reaktionszyklus der Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums mit Hilfe der FT-IR Differenzspektroskopie zeitaufgelöst untersucht. Die Ca2+-ATPase transportiert Calciumionen nach der Muskelkontraktion unter ATP-Verbrauch zurück in das Sarkoplasmatische Retikulum und führt somit zur Relaxation des Muskels. Sie dient als Modell für die kationentransportierenden P-Typ ATPasen, die einen ähnlichen Reaktionszyklus mit einem intermediär gebildeten kovalenten Aspartylphosphat und zwei Hauptkonformationen aufweisen.

Drei Intermediate des Reaktionszyklusses der Ca2+-ATPase konnten FT-IR spektroskopisch charakterisiert werden:

1. Die Strontiumbindung an die Ca2+-ATPase wurde zeitgelöst bei – 8 °C in H2O und D2O

untersucht und zeigte im Vergleich zur Calciumbindung Bandenverschiebungen von Carboxyl- und Carbonylgruppen, die zur Koordination der Kationen in der hochaffinen Kationen-Bindungsstelle beitragen. Der bei der Calcium- und Strontiumbindung an die Ca2+-ATPase auftretende kinetische Isotopeneffekt von 10 in D2O im Vergleich zu H2O

lässt auf am geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Bindung an die hochaffine Kationen-Bindungsstelle beteiligte Deprotonierungen von Glutamin- oder Asparaginsäuren schließen. Ein Enzym-Komplex mit einem gebundenen Strontium konnte aufgrund der negativen Kooperativität der Ca2+-ATPase für Strontium angereichert werden.

2. Die Bindung von Magnesium an die Ca2+-ATPase in der E1- und in der E2

-Konformation wurde bei 4 °C beobachtet. Die Veränderung von β-Faltblatt-Strukturen bei der Bildung von E2Mg konnte erstmalig gezeigt werden.

3. Die Phosphorylierung der Ca2+-ATPase durch Magnesium und Phosphat über die Umkehr der Phosphatasereaktion wurde durch Freisetzung von Phosphat bzw. Magnesium bei 4 °C zeitaufgelöst untersucht. Die Phosphatgruppe des Phosphoenzyms im aktiven Zentrum befindet sich in einer hydrophoben Umgebung und wird durch elektrostatische Wechselwirkungen stabilisiert. Erstmals wurden Veränderungen von β-Faltblatt-Strukturen bei der Bildung des kovalenten Phosphoenzyms beobachtet, aus denen eine Veränderung des kleinen cytoplasmatischen Loops bei der Phosphatasereaktion der Ca2+-ATPase abgeleitet werden konnte.

(11)

2 Einleitung

2.1 Die Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums

2.1.1 Die Ca2+-ATPase

Die Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums ist ein membranständiges Protein, das aus 994 Aminosäuren aufgebaut ist.1 Sie wurde 1961 entdeckt und kann leicht z.B. aus der Sprungmuskulatur von Kaninchen präpariert werden.2

Die Ca2+-ATPase wird als Modell der P-Typ ATPasen betrachtet, die den Transport von Kationen gegen den Gradienten unter Verbrauch von ATP katalysieren. Sie werden als P-Typ ATPasen bezeichnet, weil bei ihrem Transportzyklus intermediär ein Aspartylphosphat gebildet wird. Unter anderem gehören zu dieser Familie die Ca2+-ATPasen des Sarko- und des Endoplasmatischen Retikulums (die sogenannten SERCA-ATPasen), die Ca2+-ATPase der Plasmamembran, die Na+,K+- und die H+,K+-ATPase. Auch der Transport von Schwermetallionen (z.B. Cd2+ und Cu2+) wird von den ATPasen des P-Typs katalysiert.3 Die Funktion der Ca2+-ATPase besteht im Transport von Calciumionen nach einer Muskelanspannung zurück in die Sarkoplasmatischen Retikuli, um so über die sinkende Calciumkonzentration die Relaxation des Muskels herbeizuführen.

(12)

2.1.2 Reaktionszyklus und Reaktionsmechanismus

Das folgende Reaktionsschema zeigt das Modell des Zyklusses der Ca2+-ATPase.4

E

1

E

1

Ca

2

E

1

[Ca]

2

~P(Mg)

E

2

Ca

2

-P(Mg)

E

2

-P(Mg)

2Cacyt MgATP ADP

H2O

Mg, Pi

2Caint

E

2

Abb. 2-1: Schema des Reaktionszyklusses nach Albert-Post

Die Bindung von zwei Calciumionen aus dem Cytoplasma der Muskelzellen erfolgt sequentiell an die hochaffine Kationen-Bindungsstelle (Kd ≈ 1 µM, pH 7), die sich im

membranständigen Teil der Ca2+-ATPase befindet. Nach der Bindung von Magnesium und ATP wird in einer Transphosphorylierungsreaktion die γ-Phosphatgruppe von ATP auf das Aspartat351 übertragen, wodurch ein energiereiches Acylphosphat entsteht. Diese Phosphorylierung führt zur Okklusion (Einschluss) der Calciumionen in der Membran. Während des folgenden Konformationswechsels von E1[Ca2]~P zu E2Ca2-P wird das

energiereiche Aspartylphosphat in ein energieärmeres, kovalent gebundenes Phosphat umgewandelt.

Die jetzt dem Lumen der SR-Vesikel zugängliche Kationen-Bindungsstelle weist eine viel geringere Affinität (1 mM, pH 7) zu Calcium auf, so dass die Calciumionen ins Lumen dissoziieren. Im letzten Schritt wird das Aspartylphosphat hydrolysiert und Phosphat und Magnesium werden freigesetzt.

Dieser Reaktionszyklus ist vollständig reversibel, d.h. nach der Bindung von Magnesium und Phosphat an das Enzym in der E2-Konformation wird ein ternärer Komplex gebildet,

(13)

Das E1-E2 Modell geht davon aus, dass die Ca2+-ATPase während des Reaktionszyklusses

zwei größere Konformationsänderungen durchläuft. Im Widerspruch dazu zeigten Untersuchungen von Jencks et al. allerdings keinen Hinweis auf die Existenz von zwei stabilen Phosphoenzymintermediaten mit gebundenem Calcium, wie E1~P[Ca2] und E2

-P(Ca2).4,6 Außerdem wird diskutiert, dass eher eine Reihe von kleineren

Konformationsänderungen während der Schritte des Reaktionszyklusses, z.B. bei Ca2+-, Mg2+- und ATP-Bindung sowie der Phosphorylierung mit Phosphat, als zwei große

Konformationsänderungen stattfinden.4,7-9

2.1.3 Struktur der Ca2+-ATPase

Die Aminosäuresequenz der Ca2+-ATPase wurde von MacLennan et al. 1985 über die

Analyse der cDNA bestimmt.1,10 Nach diesem Modell befinden sich 70 % der Masse der Ca2+-ATPase im Cytosol, 25 % in der Membran und nur 5 % des Proteins im Lumen der SR Vesikel.

Ein Modell für die Tertiärstruktur der Ca2+-ATPase, das für P-Typ ATPasen mittels Homology Modeling unter Einbeziehung der verschiedenen Forschungsergebnisse erstellt wurde, ist in Abb. 2-2 zu sehen.11 Die Struktur enthält 8-10 transmembrane Helices, zwei cytoplasmatische und mehrere kleine, lumenale Loops. Die hochaffine Kationen-Bindungsstelle ist im transmembranen Teil lokalisiert, der aus α-Helices gebildet wird.12

Der große cytoplasmatische Loop von Pro319 bis Tyr763 ist aus β-Faltblattstrukturen alternierend mit α-Helices aufgebaut.11 Aus der Analogie mit Röntgenstrukturen von

Kinasen wurden eine Nukleotidbindungsdomäne und eine Phosphorylierungsdomäne abgeleitet, in der sich das während des Reaktionszyklusses phosphorylierte Asp351 befindet.

Der kleine cytoplasmatische Loop ist aus antiparallelen β-Faltblättern aufgebaut und wird von den Aminosäuren Ala132 – Asp237 zwischen den transmembranen Helices M1 und

M2 gebildet wird.11 Seine Lage bezüglich des großen cytoplasmatischen Loops ist nicht

geklärt.

(14)

Nukleotidbindungsdomäne Phosphorylierungsdomäne Cytoplasma Lumen kleiner cytoplasmatischer Loop großer cytoplasmatischer Loop Membran Trypsin Stalk Hinge

Abb. 2-2: Modell der Ca2+-ATPase von Green et al.11

Die native Ca2+-ATPase kristallisiert zweidimensional in der E2-Form als Dimer, während

die Kristalle in Anwesenheit von Calcium als Monomere vorliegen.13

Es wurde gezeigt, dass die monomere Ca2+-ATPase den vollständigen Zyklus durchführen kann,14 ob aber Dimere der Ca2+-ATPase in den nativen Vesikeln am Reaktionszyklus beteiligt sind, wird in der Literatur kontrovers diskutiert.14-18

In einer neueren Studie wurde mit Hilfe der Kryoelektronenmikroskopie (Auflösung: 8 Å) gezeigt, dass es sich bei der Ca2+-ATPase um ein Membranprotein mit 10 transmembranen Helices handelt, bei dem eine Helix die Membran aber nicht vollständig durchspannt (Abb. 2-3).19

(15)

Abb. 2-3: Modell der Ca2+-ATPase aus Daten der Kryoelektronenmikroskopie19

2.1.4 Die hochaffine Kationen-Bindungsstelle

Zwei Calciumionen aus dem Cytoplasma binden an die hochaffine Bindungsstelle der Ca2+-ATPase. Für zwei transportierte Calciumionen findet ein Antitransport von drei Protonen statt.20 Die Calciumbindung ist kooperativ.21 Kooperativität und Affinität sind vom pH-Wert abhängig: Bei Erniedrigung des pH-Wertes von 8 auf 6, steigt die Halbsättigungskonzentration von 0,1 µM auf 10 µM und der Hillkoeffizient von 1,3 auf 2.22 Die positive Kooperativität bei pH 6 deutet darauf hin, dass die Calciumionen sequentiell binden und Protonen beide Bindungsschritte inhibieren.

(16)

Als Erklärung für dieses Verhalten wurde eine, der Calciumbindung vorgelagerte Konformationsänderung vorgeschlagen, die mit Deprotonierungen einhergeht. Dies ist im folgenden Schema von Forge et al.22,26 beschrieben (Abb. 2-4):

Bei hohem pH liegt die Ca2+-ATPase in der E1-Konformation vor, an die Calcium schnell

bindet. Bei niedrigem pH liegt das Gleichgewicht auf Seiten der E2-Konformation (E2H3),

in der Calcium mit niedrigerer Affinität an die vom Lumen aus zugängliche Kationen-Bindungsstelle binden kann. Die Umwandlung von E2 (E2H3) in die E1-Konformation ist

langsam und pH reguliert.22,25,26

E H

2 3

E H

1

E

1

E HCa

1

E Ca

1

E Ca

1 2

2 H

+

H

+

Ca

2+

Ca

2+

H

+

Ca

2+

Abb. 2-4: Schema der Calciumbindung nach Forge et al.22,26

Die Anordnung der Calciumionen in der Bindungsstelle ist umstritten. Einerseits wird die Bindungsstelle als enger Kanal vorgeschlagen, in dem die Calciumionen übereinander angeordnet sind,23,27,28 andererseits wird eine Anordnung nebeneinander diskutiert.29

Strontium, wie Calcium ein Erdalkalimetall, besitzt einen etwas größeren Ionenradius (1,21 Å) als Calcium (1,06 Å),30 bindet an die hochaffine Kationen-Bindungsstelle und wird nach Phosphorylierung der Ca2+-ATPase mit ATP okkludiert und ins Lumen transportiert.31-34

Im Gegensatz zur Calciumbindung erfolgt die Strontiumbindung aber mit niedrigerer Affinität und mit negativer Kooperativität. Das erste Strontium wird mit einer Affinität von 35 µM, das zweite mit 55 µM (pH 7, 25 °C) gebunden.35

Es existiert also ein Enzym-Strontium-Komplex, der nur ein Strontium gebunden hat. Wie von Jencks gezeigt, kann dieser Komplex weder durch ATP (wie E1Sr2), noch durch

(17)

Phosphorylierung durch ATP Phosphorylierung durch Phosphat E2 E Sr1 2 2+ E Sr1 2+ Sr2+ Sr2+

Abb. 2-5: Schema der Strontiumbindung nach Fujimori und Jencks.35

Bei der Calciumbindung kann ein entsprechender Komplex aufgrund der positiven Kooperativität im Gleichgewicht nur transient existieren.

2.1.5 Magnesiumbindung

Die Bindung von Magnesium an die Ca2+-ATPase ist komplexer. In der E1Ca2

-Konformation ist Magnesium ebenso für die Phosphorylierung durch ATP mit MgATP als Substrat essentiell,36,37 wie für die Phosphorylierung durch Phosphat in der E2H3-Form.38-40

Mit Hilfe der intrinsischen Proteinfluoreszenzänderung und in Filtrationsexperimenten mit radioaktivem Calcium8,9 wurde gezeigt, dass Magnesium die Bindung von Calcium auch bei pH 6 inhibiert,41 und dass steigende Konzentrationen von Magnesium zwischen pH 6 und 7,5 die apparente Geschwindigkeitskonstante der Calciumbindung erniedrigen.8

Eine Zusammenfassung stellt das Modell von Forge et al.22,26 dar (Abb. 2-6). Danach können je bis zu zwei Magnesiumionen an die verschiedenen Spezies (E2H3 und E1H bzw.

E1) der Ca2+-ATPase binden. Ob Magnesium an die hochaffine Kationen-Bindungsstelle

binden kann, wird in der Literatur kontrovers diskutiert.8,22,42

MgE

1

E H

2 3

E H

1

E

1

MgE H

1

MgE H

2 3

Mg E H

2 1

Mg E

2 1 Mg Mg Mg Mg Mg

(18)

Während aus Mutationsexperimenten die an der hochaffinen Calciumbindung beteiligten Aminosäuren in den transmembranen Helices M4, M5 und M6 lokalisiert werden konnten, gibt es bezüglich der Magnesium-Bindungsstelle nur wenige Hinweise.

Aus Strukturvergleichen mit anderen P-Typ ATPasen identifizierten Girardet et al.43 die Sequenz von Aminosäure 700 bis 712 der Ca2+-ATPase aus der so genannten „Hinge“ (Gelenk-)region als mögliche Magnesium-Bindungsstelle und exprimierten ein entsprechendes Polypeptid (AS 682-719), das ein divalentes Kation mit einer Affinität von 10-15 mM binden konnte.

Die Expression des großen cytoplasmatischen Loops (inkl. Hinge) zeigte ebenfalls eine Magnesiumbindungsstelle, die auf die Fluoreszenz von TNP-ATP einen starken Einfluss hat.44

Anhand von Experimenten mit der Na+, K+-ATPase wurde für die P-Typ ATPasen über die Homologie zur Struktur der kristallisierten Adenylatkinase aus Hefe (EC 3.6.1.38) zwei Stellen im großen cytoplasmatischen Loop mit Sequenzhomologien identifiziert, die möglicherweise an der Magnesiumkoordination und/oder der Nukleotidbindung beteiligt sind: DPPR (Na+,K+-ATPase: 586-590; Ca2+-ATPase: 600-604) und TGD(X)yK(R) (Na+,

(19)

2.1.6 Umkehrung des Reaktionszyklusses - Phosphorylierung durch Phosphat und Magnesium

Der Reaktionszyklus der Ca2+-ATPase ist reversibel. Aus Phosphat und ADP kann in Anwesenheit von Magnesium durch einen Calciumgradienten ATP synthetisiert werden.46 Später wurde gezeigt, dass in Abwesenheit eines Calciumgradienten9,39 die Bindung von Phosphat und Magnesium an die E2-Form der Ca2+-ATPase über einen

„Random“-Mechanismus erfolgt und zu einem ternären Komplex führt, der spontan das kovalente E2

-P bildet (s. Abb. 2-7).38,39

Eine maximale Phosphorylierung wird bei pH 6 erreicht,40 da das Gleichgewicht der beiden Konformationen bei pH 6 auf der Seite der E2-Form liegt.25 Die Anwesenheit von Calcium

im Cytosol inhibiert die Phosphorylierung mit Phosphat, da das Gleichgewicht zu E1Ca2

verschoben wird.47

E

2

E Mg

2

E P

2 i

E MgP

2 i

E -P(Mg)

2 Mg Mg Pi Pi

Abb. 2-7: Schema der Phosphorylierung der Ca2+-ATPase durch Phosphat.

(20)

2.1.7 Thapsigargin

Für die FT-IR Differenzmessungen wird der Inhibitor Thapsigargin benutzt, um die für die Bindung von Calcium an die hochaffine Kationen-Bindungsstelle der Ca2+-ATPase spezifischen Signale von unspezifischen Reaktionen zu unterscheiden.

Thapsigargin ist ein Sesquiterpenlacton, das aus der Wurzel der Thapsia garganica gewonnen wird50 und an die Stalkregion (S3, Abb. 2-2) bindet.51 Es ist ein spezifischer Inhibitor der Sarko- und Endoplasmatischen Ca2+-ATPasen (Kd ~pM),52 während die Ca2+

-ATPase der Plasmamembran und alle anderen -ATPasen nicht inhibiert werden. Bei den SERCA-ATPasen wird sowohl der Calciumtransport als auch die ATPase-Aktivität durch die Bildung eines sogenannten “Dead-End“-Komplex zwischen Thapsigargin und der E2

-Form der Ca2+-ATPase in 1:1 Stöchiometrie inhibiert.53,54

O CH3 O O O OH O CH3 OH O O O C H3 O O C H3

Abb. 2-8: Struktur von Thapsigargin

2.2 Caged Verbindungen

(21)

2.2.1 Caged Phosphat

Aus Caged Phosphat (1-(2-Nitrophenyl-)ethylphosphat) wird Phosphat mit einer Rate von 2,4 * 10-4 s-1 (16 °C, pH 7,1, I=0,2 M) freigesetzt.55 Die Photolyse und die anschließende Dunkelreaktion von Nitrophenylderivaten ist im generell akzeptierten Schema in Abb. 2-9 gezeigt.56 Das durch die Photolyse gebildete, so genannte aci-nitro-Anion (2), das sich schnell z.B. in (3) umlagern kann, führt in einer Dunkelreaktion zur Freisetzung von anorganischem Phosphat (4) und dem Nebenprodukt 2-Nitrosoacetophenon (5).

O CH3 P O O O NO2 O CH3 N+ P O O O O O O CH3 P O O O N O O CH3 N O O O P O O O

+

hν H+ -1 2 3 4 5 k

Abb. 2-9: Schema der Photolyse und der Dunkelreaktion von 1-(2-Nitrophenyl-)ethylphosphat56

(22)

N O O S [X] S H+ [X] = O N O N OH H O NH OH H+ S [X] S O N OH H+ -H2O 1 2 3 4 5 + CH2 (CHOH)2 CH2

Abb. 2-10: Reaktion von 2-Nitrosoacetophenon mit DTT nach Barth et al.58

Die Folgereaktion von 2-Nitrosoacetophenon (1) mit DTT ist in Abb. 2-10 gezeigt. Eine Thiolgruppe von DTT reagiert mit der Nitrosogruppe. Die zweite Thiolgruppe des DTT greift danach intramolekular am Schwefel an (2). Das so gebildete zyklische Intermediat (3) liegt im Gleichgewicht mit der offenen Form (4) vor. Aus der zyklischen Form wird dann in einer langsamen, säurekatalysierten Reaktion H2O eliminiert und so Methanthranil

(5) gebildet.58

2.2.2 DM-Nitrophen

(23)

Die Affinität für das zweiwertige Kation verringert sich dabei auf ~ 3 mM.59 Die Photolyse von DM-Nitrophen erfolgt mit einer Rate von 3,8 * 104 s-1 (pH 7,3, 25 °C).60,61

DM-Nitrophen kann auch Magnesium (Kd: 2,5 µM, pH 7,1, 22 °C) und andere zweiwertige

Kationen, im Gegensatz zu von EGTA abgeleiteten Caged Substanzen, komplexieren,60 und wurde bereits dazu verwendet, Exocytose,62 Muskelfasern63 und auch die Ca2+-ATPase zu untersuchen.64,65 COO -N N CH3O N O COO -CH3O CH3O CH3O NO2 NO N H2 + Ca2+ UV-Blitz Ca2+ COO -COO -COO -COO -COO -COO -308 nm

Abb. 2-11: Schematische Darstellung der Photolyse von DM-Nitrophen59

(24)

2.3 Infrarotspektroskopie

Die Infrarotspektroskopie macht sich die Anregung von Molekülschwingungen durch die Absorption von elektromagnetischer Strahlung im Bereich von 1-500 µm zunutze.

In der klassischen Näherung ist die Schwingungsfrequenz eines zweiatomigen Moleküls mit den Atommassen m1 und m2 abhängig von der reduzierten Masse µ des Systems und

der Kraftkonstanten k (Gleichung 2-1).

µ π ν k 2 1 = mit 2 1 2 1

m

m

m

m

+

=

µ

Gleichung 2-1

Die Zuordnung von Schwingungen in der IR Spektroskopie kann aus der Abhängigkeit der Frequenz von der reduzierten Masse erfolgen. Der Ersatz eines Atoms durch sein schwereres Isotop verschiebt die betroffene Schwingung zu niedrigeren Wellenzahlen. Bei lokalisierten Schwingungen ist die Berechnung der Verschiebung mit Gleichung 2-1 möglich. Für mehratomige Moleküle wie Phosphat dagegen ist die mathematische Berechnung durch Kopplungen zwischen Schwingungen erschwert.

Quantenmechanisch können die Energien der erlaubten Schwingungsniveaus für einen harmonischen Oszillator durch Gleichung 2-2 beschrieben werden.

      + = 2 1 n h E

ν

Gleichung 2-2

Die absorbierte Energie entspricht dem Abstand zwischen den Schwingungsniveaus eines Moleküls und wird häufig in Wellenzahlen (ν~, cm-1) angegeben (Gleichung 2-3).

ν

λ

ν

=

=

~

=

E

h

h

c

h

c

Gleichung 2-3

(25)

Ein N-atomiges, nicht lineares Molekül besitzt 3N-6 Schwingungsfreiheitsgrade, die sogenannten Normalschwingungen. Der Übergang von einem Schwingungszustand in den nächsthöheren durch Absorption von Infrarotstrahlung kann aber nur dann erfolgen, wenn sich das Dipolmoment des Moleküls ändert. Die Größe der Dipolmomentsänderung bestimmt den Extinktionskoeffizienten der Absorption.

Die Messung von Infrarotspektren kann mit dispersiven und Fourier Transform-Spektrometern erfolgen, wobei die FT-IR Spektrometer gegenüber dispersiven Geräten vor allem folgende Vorteile aufweisen.

Multiplexvorteil:

In dispersiven Geräten werden die Wellenlängen nacheinander gemessen, während bei FT-Spektrometern der gesamte Spektralbereich gleichzeitig detektiert wird. Dies führt zu einer deutlichen Verkürzung der für ein Spektrum nötigen Messzeit.

Jaquinotvorteil:

In Monochromatoren von dispersiven Geräten sind Spalte notwendig. Ihre Abwesenheit führt in FT-IR Spektrometern zu einem höheren Lichtdurchsatz, der ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis zur Folge hat.

Connesvorteil:

Eine höhere Wellenzahlenstabilität als bei dispersiven Geräten wird durch einen HeNe Laser erreicht, der in den FT-IR Spektrometern als interne Referenz für die Wellenzahlkalibrierung eingesetzt wird.

Die Grundlagen der FT-IR Spektroskopie sind bei Griffith und de Haseth eingehend beschrieben.66

2.3.1 Das Michelson-Interferometer

(26)

interferierenden Teilstrahlen haben einen unterschiedlich langen Weg zurückgelegt, wobei der Gangunterschied von der variablen Position des beweglichen Spiegels abhängt.

IR-Quelle fester Spiegel beweglicher Spiegel Strahlteiler Probe Detektor x

Abb. 2-12: Schematische Darstellung eines Michelson-Interferometers

Das Interferogramm beschreibt die Abhängigkeit der Intensität von der Wegdifferenz x der Teilstrahlen. Für eine monochromatische Strahlungsquelle wird das Interferogramm als eine Cosinusfunktion beschrieben, wobei I0 die Teilstrahlintensität bezeichnet (Gleichung

2-4).

[

1 cos(2 ~ )

]

)

(x I0 x

I = + πν Gleichung 2-4

Für eine nicht monochromatische Strahlungsquelle ergibt sich das Interferogramm als Integral über alle Einzelbeiträge (Gleichung 2-5).

ν ν π ν~) exp( 2 ~ ) ~ ( ~ ) ( 0

∞ − ⋅ i x d S x I Gleichung 2-5

(27)

x d x i x I S

∞ ∞ − ) ~ 2 exp( ) ( ~ ) ~ (ν πν Gleichung 2-6

Das FT-IR Spektrometer misst die Interferogramme nicht kontinuierlich, sondern an diskreten Punkten n⋅∆x mit dem maximalen Wegunterschied der Teilstrahlen N⋅∆x. Das Interferogramm besteht daher aus N diskreten Punkten mit dem Abstand ∆x. Die spektrale Auflösung ∆ν~ ist der Kehrwert des Produkts aus dem Punktabstand ∆x und der Punktanzahl N (Gleichung 2-7).

(

Nx

)

=

∆ν~ 1 Gleichung 2-7

Zur Berechnung des Spektrums aus dem Interferogramm wird dann die diskrete Fourier-Transformation (Gleichung 2-8) verwendet.

=−       ⋅ ∆ ⋅ ∆ ⋅ 1 0 2 exp ) ( ~ ) ~ ( N n N nk i x n I k S ν π Gleichung 2-8

Die Verwendung der diskreten Fourier-Transformation kann zu Artefakten im Spektrum führen. Eine genaue Beschreibung dieser Effekte ist bei Gronholz und Herres67-69 oder Griffith und de Haseth66 aufgeführt.

2.3.2 FT-IR Differenzspektroskopie mit der Rapid Scan Technik

Die Peptidbindungen und die Aminosäureseitengruppen von Proteinen sowie H2O

absorbieren stark zwischen 1800 und 1500 cm-1. Ein typisches Absolutspektrum der Ca2+ -ATPase in sarkoplasmatischen Vesikeln ist in Abb. 2-13 abgebildet.

Um aus diesen teilweise sehr breiten Banden Informationen über kleine Änderungen bei Proteinreaktionen zu erhalten, wird die Differenzspektroskopie angewendet. Dabei werden vor und während der zu beobachtenden Reaktion Spektren aufgenommen und aus ihnen Differenzen gebildet. Das Protein wird dazu in einer dünnen Schicht zwischen zwei CaF2

(28)

1800 1650 1500 ∆A 1740 1654 1550 1517 Lipide Amid I Amid II Amid II Tyrosine

Abb. 2-13: Ein typisches Absolutspektrum der Ca2+-ATPase in H2O.

In den Differenzspektren treten dann nur solche Banden auf, die sich während der entsprechenden Reaktion verändert haben. Solche, die zu neu entstehenden Gruppen gehören, erscheinen im Spektrum als positive Banden, diejenigen, die von verschwindenden Gruppen verursacht werden, sind als negative Banden zu beobachten. Im Vergleich zu der Gesamtabsorption der Proteinbanden ist die zu beobachtende Änderung aufgrund der Proteinreaktion sehr klein (1%).

(29)

12 ms Referenz S1 S2 S3 S4 S5 S6 IR Take DATA Reaktions-verlauf Take DATA Interferogramm dt 0 Zeit

Abb. 2-14: Schematischer Verlauf einer Rapid-Scan-Messung.

Die Rapid Scan Technik beruht auf der schnellen Aufnahme von vollständigen Interferogrammen hintereinander. Der bewegliche Spiegel des Interferometers wird dabei mit hoher Geschwindigkeit bewegt. Vor dem Reaktionsstart werden Spektren als Referenz aufgenommen. Danach wird die Reaktion und die Spektrenaufnahme initiiert. Der Verlauf einer solchen Messung ist schematisch in Abb. 2-14 dargestellt.

(30)

Fester Spiegel

Globar

Probe

MCT-Detektor

PC

OS 2

Excimer

Laser

Scanner-Controller

SUN/PC

Netzwerk

∆∆∆∆x

Trigger

Interferometer

Strahl

teiler

Beweglicher Spiegel

Abb. 2-15: Messaufbau für die FT-IR Differenzspektroskopie mit Caged Substanzen.

2.4 Fluoreszenzspektroskopie

2.4.1 Theorie

(31)

Die Abgabe von Energie in Form von Licht durch einen vertikalen Übergang vom niedrigsten Schwingungsniveau des angeregten Zustands in verschiedene Schwingungsniveaus des elektronischen Grundzustandes wird als Fluoreszenz bezeichnet.

2.4.2 Fluoreszenzmessungen an der Ca2+-ATPase

Tryptophane sind intrinsische Fluorophore in Proteinen. Von dreizehn Tryptophanen in der Sequenz der Ca2+-ATPase, die diese Fluoreszenz verursachen könnten, liegen nach Strukturvorhersagen zwölf in hydrophoben Bereichen in der Nähe der transmembranen Helices.1,10

Die intrinsische Fluoreszenz der Ca2+-ATPase erhöht sich durch die Bindung von Calcium

um 3-4%. Ihre Calciumabhängigkeit und die schnelle Kinetik dieser Fluoreszenzerhöhung entspricht der Enzymaktivität.8,70,71 Die Fluoreszenzerhöhung geht mit einer geringen Blauverschiebung des Emissionsspektrums einher, die als erhöhte Abschirmung der Mikroumgebung eines oder mehrerer Tryptophane durch die Bindung von Calcium bzw. die einhergehende Konformationsänderung interpretiert wird.

Die Bindung von Magnesium in Abwesenheit von ATP induziert eine Blauverschiebung im Emissionsspektrum ohne Intensitätserhöhung.8

(32)

2.5 Zielsetzung

Die FT-IR Differenzspektroskopie ist eine Methode, mit der die Reaktionen von Enzymen auf molekularer Ebene zeitaufgelöst untersucht werden können.64,72,73

Die Reaktionen der Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums sind mit Konformationsänderungen verknüpft, deren Natur bisher nicht geklärt ist.

Aufbauend auf die Arbeit von Dr. A. Troullier,64 in der die Bindung von Calcium an die Ca2+-ATPase in H2O mit FT-IR Differenzspektroskopie zeitaufgelöst untersucht wurde,

sollten die dort beobachteten Banden durch die Bindung von Calcium in D2O genauer

zugeordnet werden.

Die Bindung von Strontium an die Ca2+-ATPase in H2O und D2O sollte im Vergleich zu

Calcium spezifische Verschiebungen von Banden solcher Aminosäuren zeigen, die an der hochaffinen Kationenbindung beteiligt sind.

Die negative Kooperativität der Strontiumbindung sollte des weiteren genutzt werden, um einen Zustand der Ca2+-ATPase anzureichern, an den nur ein Strontium gebunden ist. Die Bindung von Magnesium an die Ca2+-ATPase sollte unter den Bedingungen der Phosphorylierung mit Phosphat untersucht und mit der Calcium- und Strontiumbindung verglichen werden.

(33)

3 Experimenteller

Teil

3.1 Materialien und Chemikalien

3.1.1 Chemikalien

Acetonitril Merck (Darmstadt) Acetylphosphat (Lithium, Kaliumsalz) Sigma (Deisenhofen)

Adenosin-5´-triphosphat Boehringer (Mannheim) Ammoniumheptamolybdat Baker (Deventer, Niederlande) Bariumdichlorid Riedel de Haen (Selze)

Calciumdichlorid Baker (Deventer, Niederlande) Calcimycin (Calciumionophor A 23187) Sigma (Deisenhofen)

Chloroform Baker (Deventer, Niederlande) D2O Deutero (Kastellaun)

Diethylether Merck (Darmstadt) Dikaliumhydrogenphosphat Fluka (Buchs, Schweiz) Dimethylsulfoxid Sigma (Deisenhofen)

DM-Nitrophen MolecularProbes (Leiden, Niederlande) 1,4-Dithio-D,L-threit Biomol (Hamburg)

EDTA (freie Säure) Fluka (Buchs, Schweiz) EDTA (Dinatriumsalz) Merck (Darmstadt)

EGTA Sigma (Deisenhofen)

Ethanol Baker (Deventer, Niederlande) Fura II (Pentakaliumsalz) Sigma (Deisenhofen)

Glutathion Merck (Darmstadt)

Glyzerin Baker (Deventer, Niederlande) H218O Campro (Emmerich)

HEPES Sigma (Deisenhofen) Hydrazinhydrat Merck (Darmstadt)

Iminodiessigsäure Schuchardt (Hohenbrunn) Kaliumdihydrogenphosphat Fluka (Buchs, Schweiz)

(34)

Lasalocid (Calciumionophor X 357 A) Sigma (Deisenhofen)

Magnesiumsulfat Baker (Deventer, Niederlande) Magnesiumdichlorid Baker (Deventer, Niederlande)

Mangan-(IV)-oxid (gefällt, aktiv) Merck (Darmstadt)

MES Biomol (Hamburg)

Methanol Baker (Deventer, Niederlande) 4-Methylaminophenolsulfat (Photorex) Merck (Darmstadt)

MOPS Biomol (Hamburg)

NADH Boehringer (Mannheim) Natriumchlorid Baker (Deventer, Niederlande) Natriumhydroxid Fluka (Buchs, Schweiz) Natriumhydrogensulfit Fluka (Buchs, Schweiz) 2-Nitroacetophenon Merck (Darmstadt) Phosphoenolpyruvat Mononatriumsalz Boehringer (Mannheim) Phosphorsäure Merck (Darmstadt)

Salzsäure Baker (Deventer, Niederlande) Saccharose Fluka (Buchs, Schweiz) Strontiumdichlorid Sigma (Deisenhofen)

Thapsigargin MolecularProbes (Leiden, Niederlande) Triethylamin Fluka (Buchs, Schweiz)

TRIS Biomol (Hamburg)

3.1.2 Enzyme

(35)

3.1.3 Spezielle Materialien Säulen:

DEAE-Cellulose Merck (Darmstadt) Lichroprep RP18 Lobar Merck (Darmstadt) (20 g, ID 10 mm, Länge 240 mm)

Baysilone-Paste Bayer (Leverkusen) CaF2-Fenster Korth (Kiel)

Dowex 50 W X 8 (H+ Form, 100-200 mesh) Fluka (Buchs, Schweiz) Polygram SIL G/UV254 (DC Fertigfolien) Macherey-Nagel (Düren)

spezielle Software:

OPUS Bruker (Karlsruhe)

Origin Microcal Software (Northampton,USA) Biokine Bio-Logic (Claix, Frankreich)

3.1.4 Geräte

Fluoreszenzapparatur Bio-Logic (Claix, Frankreich)

FPLC: Pharmazia (Freiburg) Peristaltikpumpe P1 Gradientenformer GP-10 Detektor Uvicord II Fraktionssammler SuperFrac Schreiber REC 102

Vakuumzentrifuge UNIVAPO 100 H UniEquip (Martinsried) Zentrifuge Sorvall RC 5B Plus Du Pont (Bad Homburg) Zentrifuge Beckman (München) Ultrazentrifuge TL-100 Beckman (München) UV/Vis Spektrometer 810 Kontron

FT-IR Spektrometer 66V/S, 66V Bruker Bruker (Karlsruhe) Excimerlaser LPX 240i

mit 500 Hz Repetitionsrate Lambda Physics (Göttingen)

Kryostat R6 Lauda (Königshofen) pH-Meter 761 Calimatic Knick (Berlin)

(36)

Pumpenstand PC5 MZ 2C Vacuubrand (Wertheim) HPLC:

Beckman System Gold mit Beckman (München) Programmable Solvent Module 126 und

Scanning Detector Module 167

Steuerungseinheit: PC-8300 NEC (Tokio, Japan) Säule: C18-reversed-phase Säule Bischoff (Leonberg)

(ODS-Hypersil, 5 µ, 25 cm x 5 mm)

(37)

3.2 Chemische Synthesen

3.2.1 Synthese von Caged Phosphat

Die Synthese von Caged Phosphat erfolgte nach Walker et al.56 analog zur Caged ATP Synthese.

Darstellung von 2-Nitroacetophenonhydrazon

In einem 100 ml Zweihalskolben mit Rückflusskühler wurden 4 ml (4,96 g, 30 mmol) 2-Nitroacetophenon in 50 ml Ethanol (100%) gelöst. Unter Rühren wurden zuerst 3,3 ml (3,4 g, 67,5 mmol) Hydrazinhydrat und dann tropfenweise 1,7 ml (1,8 g, 29,8 mmol) Eisessig zugegeben. Die entstandene Mischung wurde für 4h zum Rückfluss erhitzt. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie überprüft.

Nach Abkühlen des Reaktionsgemisches wurde in einem braunen Weithalskolben das Lösungsmittel abgezogen.

Der verbleibende Rückstand wurde in 30 ml Chloroform aufgenommen und dreimal mit je 15 ml H2O ausgeschüttelt. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden schließlich mit 30 ml

und danach zweimal mit je 10 ml Chloroform extrahiert.

Die Chloroformphasen wurden vereinigt und über Nacht über Natriumsulfat bei + 4 °C getrocknet. Am nächsten Tag wurde das Natriumsulfat über eine Glasfritte (G3) abgesaugt und das Lösungsmittel bei abgedunkelter Raumbeleuchtung evaporiert.

Der Rückstand wurde in sehr wenig Chloroform aufgenommen und in einen 10 ml Kolben überführt. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Wasserstrahlpumpenvakuum wurde das gelbe Öl im reduzierten Ölpumpenvakuum über eine Zinckeapparatur fraktioniert destilliert.

Der Siedepunkt betrug 155 °C bei 0,8 mbar (Ölbadtemperatur 210 °C).

Ausbeute: 4,84 g (27 mmol, 90% der Theorie); Literaturausbeute: 95 % UV (Ethanol) ε248 nm : 9400 cm-1 M-1

(38)

Darstellung von 1-(2-Nitrophenyl-)diazoethan

In einem 50 ml Kolben wurden 0,66 g (3,7 mmol) 2-Nitroacetophenon-hydrazon in 26 ml Chloroform gelöst.

Unter Lichtausschluss wurde unter heftigem Rühren 2,55 g (29,3 mmol) MnO2 (aktiviert)

dazugegeben und 5 min bis zur Vervollständigung der Reaktion weitergerührt. Danach wurde über eine Glasfritte (G2) von MnO2 und Mn(OH)2 abfiltriert und die stark orange

Lösung in einen braunen 50 ml Kolben überführt. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer vorsichtig abgezogen. Für die weiteren Reaktionsschritte wurde von vollständiger Umsetzung ausgegangen.

Darstellung von Caged Phosphat

Das zuvor dargestellte 1-(2-Nitrophenyl-)diazoethan (3,7 mmol) wurde in 30 ml Diethylether gelöst und in einen braunen Weithalskolben überführt, der mit Alufolie umklebt und mit einem Trockenrohr als Druckausgleich versehen war.

Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 0,586 g (3,76 mmol) Natriumdihydrogenphosphat in 30 ml H2O, pH 4 (HCl) gegeben. 24 h wurde bei

Raumtemperatur und unter Lichtausschluss heftig gerührt.

Der Diethylether wurde anschließend am Rotationsverdampfer abgezogen.

Um unerwünschte Reaktionsprodukte abzutrennen, wurde die wässrige Phase, die das Rohprodukt, 1-(2-Nitrophenyl-)ethylphosphat (im weiteren: Caged Phosphat), enthält, mit je 15 ml Chloroform solange ausgeschüttelt, bis die organische Phase nicht mehr gelblich gefärbt war.

Aufreinigung des Caged Phosphats

(39)

Herstellung des TBK Puffers:

Bei 6 °C wurden 0,277 l (2 mol) Triethylamin und 0,733 l H2O in einen 1 l

Erlenmeyerkolben gefüllt.

Es bildet sich ein Zweiphasensystem aus. Eine 10 ml Messpipette wurde eingetaucht, die über einen Schlauch mit einer ansonsten verschlossenen Saugflasche, gefüllt mit Trockeneis, verbunden war. So wurde 24 h lang CO2 durch die Lösung geleitet, bis nur

noch eine Phase mit einem pH von 7,5 vorhanden war.

Das verunreinigte Caged Phosphat wurde direkt auf die Ionentauschersäule aufgetragen und mit einem Fluss von 1,5 ml/min mit einem linear ansteigenden Gradienten von 10 bis 200 mM TBK bei 4 °C unter Rotlicht chromatographiert (Laufzeit 1080 min). Caged Phosphat sowie Nebenprodukte der Reaktion wurden bei 278 nm detektiert und von einem Fraktionssammler aufgefangen.

Die aufgetrennten Fraktionen wurden per HPLC analysiert und die Caged Phosphat enthaltenden Fraktionen vereinigt.

Zur Entfernung des TBK wurde die Lösung mehrfach mit je 50 ml Methanol versetzt und bei maximal 40 °C Wasserbadtemperatur am Rotationsverdampfer evaporiert. Die Lösung wurde zum Schluss vollständig eingedampft und der Rückstand in wenig H2O wieder

aufgenommen.

Der Caged-Phosphat-Gehalt der Lösung wurde photometrisch bestimmt. Die wässrige Lösung wurde bei -20 °C gelagert.

UV:(H2O, Caged Phosphat) ε265nm = 4240 M-1cm-1

Ausbeute: 0,31 mmol (8,4 % der Theorie)

Verunreinigung mit anorganischem Phosphat (bestimmt nach 3.2.4): 60-80% (bezogen auf Caged Phosphat)

1H NMR: 7,8-7,9 ppm m (2 H, aryl), 7,6-7,7 ppm m (1 H, aryl), 7,45-7,35 ppm m (1 H,

aryl), 5,5-5,6 ppm m (1 H, benzyl), 1,3-1,4 ppm d (3 H, Methyl) entsprechend der Literatur.57

(40)

Abtrennung des anorganischen Phosphats

Um die Verunreinigung von Caged Phosphat mit anorganischem Phosphat zu verringern, wurden zwei verschiedene Methoden angewendet.

A: Fällung als Bariumsalz.74

Die konzentrierte Caged Phosphat Lösung wurde mit 100 mM Ba(OH)2 Lösung versetzt,

bis sich kein Niederschlag mehr bildete. Es wurde zentrifugiert, der Überstand in ein neues Reagenzglas überführt und mit CO2 versetzt, um das überschüssig Barium als Carbonat zu

fällen, erneut zentrifugiert und der Überstand eingeengt.

Zum Austausch der Bariumionen gegen Natrium wurde der Kationentauscher Dowex 50 W 8 verwendet. 1,5 g Dowex 50 W 8 wurden in einem Becherglas solange mit 1 N NaOH versetzt, bis ein pH von 12 erreicht war. Dann wurde die Natronlauge abgegossen und der Kationentauscher mit ca. 100 ml H2O neutral gewaschen.

Die Caged Phosphat Lösung wurde zugegeben und gerührt. Danach wurde vom Austauscherharz abfiltriert, der Ionentauscher wurde nachgewaschen und die erhaltenen Caged Phosphat Lösungen bis zur Trockne am Rotationsverdampfer evaporiert.

Mit dieser Methode wurde eine Reduktion der Verunreinigung des Caged Phosphat durch anorganisches Phosphat auf 1% erreicht.

B: Trennung über eine RP 18 Lobar Säule nach Dantzig et al.75

Auf eine RP18 Lobar Säule wurden 5 ml einer konzentrierten Caged Phosphat Lösung eingespritzt und mit bidestilliertem H2O mit einem Fluss von maximal 1,5 ml/min eluiert.

Das anorganische Phosphat eluierte innerhalb der ersten 50-70 ml, während das Caged Phosphat erst ab 100 ml von der Säule gewaschen wurde.

(41)

3.2.2 Synthese von Caged Phosphat [18O]4P

Darstellung von [18O]

4P

18O markiertes Phosphat wurde mir dankenswerterweise von Christoph Allin zur

Verfügung gestellt. Die Synthese erfolgte nach der Methode von Goody et al..76

Darstellung von 1-(2-Nitrophenyl-)diazoethan

Wie bereits in 3.2.1 beschrieben, wurde aus 0,65 g (2 mmol) 2-Nitroacetophenonhydrazon und 1,8 g (20 mmol) MnO2 in 15 ml CHCl3 das 1-(2-Nitrophenyl-)diazoethan frisch

hergestellt.

Für die weitere Reaktion wurde von vollständiger Umsetzung ausgegangen.

Darstellung von Caged Phosphat [18O]4P

2 mmol 1-(2-Nitrophenyl-)diazoethan wurden in 15 ml Diethylether gelöst und in einen braunen Weithalskolben überführt, der mit Alufolie umklebt und mit einem Trockenrohr als Druckausgleich versehen war.

Eine Lösung von 2 mmol H3P18O4 in 15 ml H2O, pH 4 (NaOH) wurde zugegeben und 90 h

bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluss heftig gerührt.

Im Wasserstrahlpumpenvakuum wurde das Reaktionsgemisch von Diethylether befreit und anschließend dreimal mit je 20 ml CHCl3 extrahiert. Die wässrige Phase wurde im

Ölpumpenvakuum eingeengt und in 10 ml TBK Puffer (10 mM) aufgenommen. Die weitere Aufreinigung erfolgte wie unter 3.2.1 beschrieben.

Ausbeute: 0,12 mmol (6 % der Theorie) mit einer Verunreinigung von 0,5 ± 0,1 % Orthophosphat

(42)

3.2.3 HPLC-Analyse von Caged Phosphat

Die Analyse der Caged Phosphat Lösungen erfolgte mit Hilfe der HPLC an einer unpolaren C18-reversed-phase Säule (ODS-Hypersil). Die Auftrennung der verschiedenen

Reaktionsprodukte der Synthese erfolgte durch den unten beschriebenen Gradienten mit einer Flussrate von 1,5 ml/min:

Laufmittel A: 50 mM Kaliumphosphat (pH 6,5) Laufmittel B: 50 % A und 50 % Acetonitril Äquilibrierung: 3 min 0% B

Gradient: 0% B auf 100% B in 20 min Äquilibrierung: 2 min 100% B

Die Detektion der Substanzen erfolgte bei 265 nm.

Caged Phosphat eluierte bei 9 min, das Hydrolyseprodukt 2-Nitrophenylethanol (nachgewiesen durch Koinjektion mit einem 2-Nitrophenylethanol Standard) bei 16 min. Der Anteil des Hydrolyseprodukts einer 50 mM Lösung von Caged Phosphat in H2O unter

Lichtausschluss bei Raumtemperatur wurde mittels HPLC durch Integration der Fläche unter den jeweiligen Signale von Caged Phosphat und 2-Nitrophenylethanol bezüglich der Gesamtfläche analysiert. Die Hydrolyse betrug nach 72 h ca. 0,15 % und nach 25 Tagen 13%.

3.2.4 Nachweis von anorganischem Phosphat

Über die Extinktion des Phosphomolybdänblaus (λmax=720 nm)77 wurde die Konzentration

von anorganischem Phosphat in konzentrierten Caged Phosphat Proben bestimmt. In einer Halbmikroküvette (1 mm Schichtdicke) wurde auf 100 µl Probe nacheinander

300 µl 1% SDS Lösung in H2O

250 µl 5% (NH4)6Mo7O24 Lösung in H2O

und 250 µl Photorexlösung pipettiert.

Zur Herstellung der Photorexlösung wurden 5 g Photorex (4-Methylaminophenolsulfat) und 15 g NaHSO3 in 500 ml H2O gelöst und im Dunkeln aufbewahrt.

(43)

3.3 Präparation des Sarkoplasmatischen Retikulums

3.3.1 Präparation der Vesikel

Die Präparation wurde nach der Methode von Hasselbach und Makinose,78 modifiziert von Dupont79 durchgeführt.

Von einem weißen Kaninchen (Standard ESB, 3-3,5 kg Gewicht) wurden die Rückenmuskulatur und Teile des Sprungmuskels der Hinterbeine herausgelöst (350 g Muskelmasse). Es wurde darauf geachtet, dass nur die weiße Muskulatur zur Präparation verwendet wurde.

Alle Schritte der Präparation wurden mit gekühlten Medien auf Eis durchgeführt.

Die Muskeln wurden mit einem Mixer (Waring Blendor) 20 Sekunden bei niedriger und anschließend 45 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit püriert. Dabei wurde darauf geachtet, dass ausreichend Puffer 1 (20 mM MOPS/KOH, pH 6,8, 100 mM KCl, insgesamt 0,8 l) zugegeben wurde, damit sich die Retikuli im Überstand der folgenden Zentrifugation sammeln konnten.

Die erste Zentrifugation erfolgte in einer Sorvall Zentrifuge mit einem GS 3 Rotor, 10 min bei 5200 rpm, 4 °C. Dabei wurden Fette, Myofibrillen sowie unlösliche Fasern abgetrennt. Der die Vesikel enthaltende Überstand wurden über einen Büchnertrichter mit vier Lagen Gaze von noch vorhandenen Faserresten abfiltriert. Das Pellet wurde verworfen.

Danach wurde das Filtrat im gleichen Rotor für 10 min bei 8000 rpm (10 000 g) und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand ebenfalls über vier Lagen Gaze filtriert.

Der Überstand wurde in einer Sorvall Zentrifuge mit einem SA 600 Rotor bei 16500 rpm (= 41000 g) und einer Beckman Zentrifuge mit einem Ti 28 Rotor bei 20000 rpm (= 48 000 g) 1h lang bei 4 °C zum vierten Mal zentrifugiert.

Der Überstand wurde entfernt und die die Vesikel enthaltenden Pellets mit je 2 ml des Puffers 2 (20 mM MOPS, 1 M NaCl, pH 7) mit einem Potter resuspendiert. Dabei wurde darauf geachtet, die sich im Zentrum des Pellets befindlichen braunen Mitochondrien nicht mit zu resuspendieren.

Die vereinigten Suspensionen wurden in kleinen Portionen mit einem Potter zerkleinert und homogenisiert. Die Gesamtmenge an Puffer 2 sollte 280 ml nicht überschreiten.

(44)

Die Pellets wurden, wie oben beschrieben, in weniger als 150 ml Puffer 1 resuspendiert. Anschließend wurden die Vesikel eine Stunde im SS34 Rotor bei 20 000 rpm pelletiert. Die resultierenden Pellets wurden mit einem kleinen Potter gründlich in 20 ml Puffer 1 resuspendiert, der 10 % Saccharose für die Lagerung in flüssigem Stickstoff enthielt.

Die so erhaltene Suspension wurde aliquotiert und in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch gelagert.

Ausbeute: 420 mg Ca2+-ATPase in nativen Vesikeln

3.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Konzentrationsbestimmung des Proteins erfolgte über die Extinktion bei 280 nm in 1% SDS Lösung. Für eine Konzentration von 1 mg/ml Protein ergibt sich eine optische Dichte von 1.80

3.3.3 Bestimmung der spezifischen Proteinaktivität

Die Aktivitätsbestimmung wurde nach einer modifizierten Vorschrift von East und Lee81 durchgeführt.

Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 90 µl einer 25 mM CaCl2-Lösung zu einer

voräquilibrierten Mischung von:

40 mM HEPES/KOH, pH 7,2, 100 mM KCl, 5,1 mM MgSO4, 1,01 mM EGTA, 2,1 mM ATP, 0,53 mM Phosphoenolpyruvat, 0,15 mM NADH, 7,5 IU Pyruvatkinase, 18 IU Lactatdehydrogenase und 10 µg ATPase

in einem Gesamtvolumen von 2,5 ml bei 25 °C gestartet. Die Oxidation von NADH über die Abnahme der Absorption bei 340 nm kontinuierlich verfolgt.

(45)

Die Aktivität wurde mittels Gleichung 3-1 berechnet:

[

]

Aktivität IU mg OD V ml m mg M cm nm ATPase nm       = ∗ ∗ − − − ∆ 340 1 340 1 1 1000 min [ ] [ ] ε [ ] Gleichung 3-1 mit:

∆OD340 = Absorptionsänderung durch NADH Oxidation bei 340nm

V= Gesamtvolumen in der Küvette

mATPase= Menge der ATPase in der Küvette

ε340nm= Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm =6220 M-1 cm-1

Bei der Aktivitätsbestimmung von nativen Vesikeln musste zusätzlich noch Calcimycin (A 23187) zugegeben werden, um eine Inhibierung der ATPaseaktivität durch Anreicherung von Calcium im Lumen zu verhindern. Für undichte Vesikel wurde ein Wert von 6,15 IU /mg Protein gefunden.

3.4 Fluoreszenzmessungen an der Ca2+-ATPase

3.4.1 Fluoreszenzmessung zur Bestimmung des Calciumgehalts der Präparationsmethode

Messaufbau

Die Fluoreszenzküvette befand sich in einem schwarzen Küvettenhalter. Die Anregung in der Küvette erfolgte mittels Lichtleiter auf der einen Seite durch eine in der Wellenlänge verstellbare Xenon Lampe (Biologic, 150 Watt). Die emittierte Fluoreszenz wurde auf der gegenüberliegenden Seite durch einen doppelten Monochromator geleitet, von einem Photomultiplier, vor den verschiedene Filter zur Selektion der Emissionswellenlänge geschraubt werden konnten, detektiert und von einem PC über das Programm Biokine verarbeitet.

(46)

Einführung von Hochdruckspritzen befanden, die eine Zugabe von kleinen Volumina Lösungen ohne Anheben des Rührers und somit schnelle Mischung ohne störendes Licht ermöglichten. Für die Zugabe von größeren Mengen wurde der Rührer angehoben und die Lösung direkt in die Fluoreszenzküvette pipettiert.

Die Anregung der Fluoreszenz erfolgte bei 380 nm. Die Detektion erfolgte oberhalb von 455 nm. Ein entsprechender Cut off Filter wurde vor den Photomultiplier geschraubt.

Messmethode

Die Methode beruht auf der Sensitivität der Fluoreszenz von Fura II gegenüber Calcium. Bei einer Freisetzung von Calcium in das Reaktionsmedium ist eine Verringerung der Fluoreszenz von Fura II zu beobachten.

Es wurden in der Küvette 2 ml des folgenden Mediums vorgelegt: 50 mM Mops/KOH, pH 7,2, 10 µM Fura II sowie 125 µM EGTA.

Eichgeraden für die Fluoreszenzänderung aufgrund von Calciumzugabe wurden jeweils durch mehrfache Addition von 5 µl einer 2 mM CaCl2 zum Reaktionsmedium erstellt.

Die Zugabe hochkonzentrierter Suspensionen von SR Vesikeln führt zu einer deutlichen Erhöhung der Fluoreszenz aufgrund von Streuung an den Vesikeln. Zum vorgelegten Medium wurden zweimal je 20 µl SR Suspension gegeben.

Zur Freisetzung von in den Vesikeln einlagerndem Calcium wurde das Calciumionophor X357A (Lasalocid) in konzentrierter, ethanolischer Lösung in 2-5 µl Schritten bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben.

Abschließend wurde durch Zugabe von zweimal je 5 µl CaCl2 Lösung sichergestellt, dass

die Fluoreszenzänderung im linearen Bereich der Fluoreszenzabhängigkeit stattgefunden hatte. Die Kontrollmessungen enthielten im vorgelegten Medium statt 125 µM 6 mM EGTA, während die anderen Parameter konstant blieben.

Die so erhaltene Fluoreszenzänderung wurde in % von denen der Testmessung subtrahiert. Die Menge des mit den Vesikeln in die Messsuspension eingebrachten Calciums betrug in nativen Vesikeln 17 nmol/mg Protein. Nach den in der Probenpräparation durchgeführten Waschschritten (vgl. 3.5.3) konnte keine Kontamination durch Calcium festgestellt werden.

(47)

3.4.2 Intrinsische Proteinfluoreszenzmessungen

Messaufbau

Der Messaufbau entspricht dem oben beschriebenen bis auf folgende Punkte:

Der Küvettenhalter war temperierbar. Die Anregung in der Küvette erfolgte mittels einer Xenon-Quecksilber Lampe (Biologic, 150 Watt). Vor dem Photomultiplier befand sich kein doppelter Monochromator.

Die Anregung erfolgte bei 290 nm. Oberhalb von 320 nm wurde die Fluoreszenzänderung detektiert. Dazu wurde ein 320 nm cut off Filter sowie ein schwarzer Filter, der das sichtbare Licht ausschließen sollte, vor den Photomultiplier geschraubt.

Um die relative Fluoreszenzänderung der Ca2+-ATPase zu messen, wurde ein Offset von 10 V vorgegeben.

Fluoreszenzmessung zur Bestimmung der Proteinaktivität

Bei Raumtemperatur wurden in einer Fluoreszenzvollküvette 2ml folgender Lösung vorgelegt: 50 mM MES/KOH, pH 6, 100 µg /ml Ca2+-ATPase und 50 µM CaCl2.

Durch die Vorinkubation mit Calcium lag die Ca2+-ATPase in der sogenannten E1

Konformation vor.

Nach 2-3 min Äquilibrierungszeit wurde durch mehrfache Zugabe von 10 µl einer EGTA/TRIS Lösung (pH 6, Endkonzentration in der Küvette 1 mM) das Calcium in der Lösung komplexiert und die ATPase somit in die E2-Konformation überführt.

Die daraus resultierende Erniedrigung der Fluoreszenz wurde um die Verdünnung durch die EGTA Zugabe korrigiert.

Durch Zugabe von insgesamt 2 mM CaCl2 wurde die E1-Konformation wieder hergestellt

und die Werte für den E1 nach E2-Übergang und dessen Umkehrung verglichen.

(48)

Kinetische Fluoreszenzmessungen der Phosphorylierung durch Phosphat

Die Phosphorylierung der Ca2+-ATPase durch anorganisches Phosphat wurde zeitaufgelöst über die relative Änderung der intrinsischen Proteinfluoreszenz bestimmt (Kapitel 2.4.2). 2 ml der gewünschten Pufferlösung mit 100 µg/ml ATPase wurden in der Fluoreszenzapparatur auf 4 °C temperiert, alle Lösungen wurden auf Eis gelagert.

Die Pufferlösung enthielt 2 mM EGTA, 0-15% DMSO, 0-20% Glyzerin, 1,8 mM Pi bzw.

1,8 mM MgCl2.

Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 µl einer 1 M MgCl2- bzw. Pi/TRIS Lösung

gestartet. Die Zeitauflösung der Datenaufnahme betrug 500 ms.

3.5 FT-IR Spektroskopie

3.5.1 Messanordnung

FT-IR Messungen wurden in klimatisierten Räumen an IFS 66V bzw. 66V/S Spektrometern durchgeführt.

Diese Spektrometer sind bis auf die Probenkammer evakuierbar (10 mbar).

Die im Institut angefertigte Probenkammer wird mit Luft durchspült, die durch einen Trockner mit CO2-Abscheider aufbereitet wurde, so dass keine CO2- und

Wasserdampfbanden im Spektrum auftreten.

In der Probenkammer befindet sich ein über einen Kryostaten bis -30 °C thermostatisierbarer Probenhalter aus Messing, dessen Temperatur mit Hilfe eines direkt verbundenen Peltierelements kontrolliert werden kann.

Ein wassergekühlter Globar aus Siliziumcarbid dient als Quelle für die Strahlung im mittleren Infrarot. Der Strahlteiler besteht aus einem KBr-Kristall.

Der Scanner kann mit einer Geschwindigkeit zwischen 1,6 und 320 kHz bewegt werden. Die Registrierung der Signale erfolgt mit einem N2(flüssig)-gekühlten, im Messbereich

sehr empfindlichen HgCdTe (MCT)-Detektor bei den Differenzspektren, sowie einem über den gesamten Spektralbereich linearen DTGS-Detektor bei den Übersichtsspektren.

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Die Photolyse wurde bei einer Wellenlänge von 308 nm mit einem LPX 240i bei 333 Hz durchgeführt. Der Laserstrahl wird dabei über Excimerspiegel in die Probenkammer und unter einem Winkel von 45° zum Infrarotstrahl auf die Probe gelenkt.

Die Energie der Laserblitze betrug zwischen 80 und 120 mJ bei einer Pulsdauer von ca. 20 ns.

3.5.2 Messparameter

Für die Messungen wurde, wenn nicht anders angegeben, eine Auflösung von 2 cm-1 gewählt.

Für die Übersichtsspektren wurden 50 Interferogramme mit einem DTGS-Detektor bei einer Scannergeschwindigkeit von 5 kHz aufgenommen und gemittelt.

Ein für eine Auflösung von 2 cm-1 geeigneter Cut off Filter bei 1975 cm-1 wurde vor dem MCT Detektor angebracht, um die Blende des Spektrometers bei der Messung der Differenzspektren weiter öffnen zu können, ohne das Detektorelement zu übersättigen. Damit konnte mehr Signal auf die Probe treffen und so ein besseres Signal-zu-Rausch- Verhältnis in dem interessierenden Spektralbereich zwischen 1800 und 900 cm-1 erreicht werden.

Für die Differenzspektroskopie wurde nur die höchste Scannergeschwindigkeit von 320 kHz im Single-Sided Modus benutzt.

Die Phasenkorrektur wurde mit der Mertz-Funktion durchgeführt, wobei die Phasenauflösung 10 cm-1 betrug. Die Blackman-Harris-3-Term-Funktion wurde als Apodisationsfunktion verwendet. Faktor zwei wurde beim Zerofilling benutzt. Um Rückfaltungen von Intensität in das Spektrum zu vermeiden, wurden die maximalen Faltungsgrenzen 3949,5 bis 0 cm-1 gewählt.

Die Proben wurden im Rapid-Scan-Modus vermessen, d.h. die Interferogramme wurden zeitaufgelöst gemessen und erst nach dem Ende der Messung aus ihnen die Spektren berechnet. Diese Vorgehensweise erhöhte die Zeitauflösung im Vergleich zur Spektrenberechnung direkt nach Messung des Interferogramms.

Da die zur vollständigen Photolyse der Caged Substanzen nötige Anzahl von Blitzen von der jeweiligen Laserleistung abhängig war, wurde zu Beginn einer Versuchsreihe als Testmessung eine Probe des Überstandes der Proteinpräparation schrittweise photolysiert. Die Veränderung der verschwindenden NO2-Bande der Caged Gruppe bei 1525 cm-1 wurde

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Die Blitzzahl für die nachfolgende Messreihe wurde so gewählt, dass sie sich im Sättigungsbereich der Kurve befand. Daher war von einer nahezu vollständigen Photolyse (98-100%) auszugehen.

Des weiteren wurde die Vollständigkeit der Photolyse nach der Messung durch eine erneute Blitzapplikation kontrolliert.

Für die Photolyse von DM-Nitrophen wurden zwischen 80-120 Blitze benötigt. Die Photolyse von Caged Phosphat erfolgte nach 40-50 Blitzen.

Die Zeitschemata für die Messungen der hochaffinen Kationen-Bindungsstelle und die Phosphorylierung ergaben sich wie folgt: Der Zeitpunkt des ersten Blitzes wurde als Nullpunkt definiert.

Tabelle 3-1: Zeitschema der Messungen zur hochaffinen Kationen-Bindungsstelle: Zeitbereich Zeitauflösung Anzahl der gemittelten

Interferogramme

Anzahl der Spektren

0,4 s bis 8,5 s 77,8 ms 1 110 8,5 bis 95,1 s 0,778 s 10 110 95,1 bis 678 s 3,87 s 50 150 678 bis 1544 s 7,74 s 100 110 1544 bis 2600 s 38,7 500 30

Für die D2O Messungen wurden statt 30 50 Spektren mit der Auflösung 38,7 s

aufgenommen, so dass der Endpunkt der Messung bei 3200 s (≈ 54 min) erreicht wurde.

Tabelle 3-2: Zeitschema für Phosphorylierung mit Caged Phosphat : Zeitbereich Zeitauflösung Anzahl der gemittelten

Interferogramme

Anzahl der Spektren

0,2 s bis 8,5 s 55,2 ms 1 150 8,5 bis 91,3 s 0,552 s 10 150 91,3 bis 229 s 2,758 s 50 50 229 bis 284 s 27,58 500 2

Für die D2O Messung wurde die Zahl der Spektren mit 50 gemittelten Interferogrammen

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Die Stabilität der Probe wurde durch Kontrollmessungen (Basislinien) überprüft. Das Erreichen einer genügenden Basislinienstabilität dauerte je nach Messreihe, Probe und Voräquilibrierungszeitraum 2-7 h.

Die Proteinproben wurden innerhalb von 48 h nach Beginn der Proteinpräparation gemessen. Danach war ein rapides Absinken der Proteinaktivität festzustellen, das sich in der Größe der Proteinbanden im Vergleich zu den postphotolytischen Banden bemerkbar machte.

3.5.3 Präparation des Proteins für die FT-IR Messungen

Das Protein wurde am Tag der Probenpräparation aufgetaut, auf Eis gelagert und schnellstmöglich verarbeitet.

Zur Herstellung calciumdurchlässiger (undichter) Vesikel nach Forge et al.,82 wurden 7 mg Protein (2 mg / ml) in einer 50 mM TRIS/HCl Lösung, pH 9,5, die 10 mM KCl sowie 2 mM EDTA enthielt, bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert.

Für die Zentrifugationen wurden eine Beckman Ultrazentrifuge, Beckman Rotoren (TLA 100.3 und 100.2) sowie Polycarbonat Zentrifugenröhrchen der gleichen Firma in den Größen 12 x 64 mm (TLA 100.3) und 13 x 51 mm (TLA 100.2) verwendet.

Es wurde außerdem darauf geachtet, dass das Protein in den Zeiten zwischen den Zentrifugationen auf Eis gelagert wurde.

Für die Untersuchung der hochaffinen Kationenbindung wurden 30 % Glyzerin zu der Proteinsuspension in den Zentrifugenröhrchen zugegeben und im TLA 100.3 Rotor für 15 min bei 100 000 rpm (541 000 g) und 4 °C zentrifugiert.

Anschließend wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 3 ml pH 7,3, 50 mM MOPS/KOH, 0,1 mM EGTA, 30 % Glyzerin resuspendiert und sofort für 15 min bei 100 000 rpm (g) und 4 °C zentrifugiert.

Der Überstand wurde wiederum verworfen und das Pellet im entsprechenden Reaktionsmedium resuspendiert, in das kleinere Zentrifugenröhrchen überführt und sofort bei 4 °C, 100 000 rpm (436 000 g) im TLA 100.2 Rotor 50 min zentrifugiert.

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Für die Messungen in D2O wurde zwar die Inkubation zur Erzeugung von undichten

Vesikeln in H2O durchgeführt, aber nach den Zentrifugationsschritten mit den

entsprechenden Lösungen in D2O resuspendiert.

Der pD der Puffer wurde nach Glasoe und Long83 mit einem normalen pH-Meter gemessen (pH Meteranzeige + 0,4 = pD) und mit KOD entsprechend eingestellt.

Probenpräparation für die Untersuchung der Phosphorylierung durch Phosphat:

Die Vesikel wurden wie vorher beschrieben undicht gemacht, mit 20 % Glyzerin versetzt und 8 min bei 100 000 rpm (TLA 100.3) zentrifugiert. Das Pellet wurde danach in 3 ml 50 mM MOPS/TRIS, pH 7,3, 2 mM EGTA, 20% Glyzerin resuspendiert und wiederum 8 min bei 100 000 rpm zentrifugiert. Nach Resuspendierung im Reaktionsmedium wurde das Protein 23 min bei 100 000 rpm (TLA 100.2) zentrifugiert. Danach wurde, wie oben beschrieben, mit der Präparation der FT-IR Proben fortgefahren.

3.5.4 Präparation der FT-IR Proben

Die FT-IR Proben wurden zwischen runde Fenster (Durchmesser 20 mm, Dicke 2 mm) aus IR durchlässigem CaF2 gebracht und vermessen. Auf dem Rand der Fenster wurde

Vakuumsilikonfett (Baysilone) sehr dünn verteilt. Auf der Fettschicht eines Fensters wurde ein 6 µm dicker Abstandsring (Spacer) aus Mylar (Dupont) fixiert, der die minimale Schichtdicke der Probe vergrößerte. Eine genauere Angabe der Schichtdicke ist allerdings aufgrund der undefinierten Schichtdicke des Fettrandes nicht möglich.

In einem der beiden CaF2-Fenster befand sich eine gefräste Nut von 1 mm Breite, 0,5 mm

Tiefe und 12 mm Innendurchmesser, die dazu diente, einen Kontakt zwischen Probe und Fett zu verhindern, indem sie überschüssiges Probenmaterial aufnahm.

Zur Präparation der Proteinproben wurde das Proteinpellet mittels eines Mikrospatels aus dem Zentrifugenröhrchen genommen. Ein kleiner Teil des Proteinpellets wurde mit einer gelben Pipettenspitze abgetrennt und in einer runden Bewegung auf das CaF2-Fenster mit

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Für die Proben ohne Protein mit gleicher Konzentration wie im Proteinpellet wurden 1,2 µl des Überstandes auf das Fenster mit Nut pipettiert und sofort mit dem zweiten Fenster verschlossen.

FT-IR Proben ohne Protein, die nicht aus dem Überstand der Proteinpräparation hergestellt wurden, wurden wie folgt präpariert:

1-3 µl der Lösungen wurden in der gewünschten Endkonzentration auf dem CaF2 -Fenster

mit der Nut im N2-Strom eingetrocknet und in entsprechender Menge Puffer bzw.

Reaktionsmedium wieder gelöst.

Nach Aufbringen der Probe auf das CaF2-Fenster mit Nut wurde das andere Fenster mit

gleichmäßigem Druck aufgelegt. So ließen sich homogene Proben ohne Luftblasen erhalten. Anschließend wurden die CaF2-Fenster aufeinandergepresst, seitlich mit

Silikonfett verschlossen und in im Institut selbst hergestellten Küvettenhalter aus Messing mittels 6 Schrauben fixiert.

Die so hergestellten Proben wurden je nach späterer Messtemperatur bei Raumtemperatur, + 4 bzw. - 18 °C gelagert.

Nach der Messung wurden die Fenster mit Spülmittel gereinigt, mit destilliertem Wasser nachgespült und in n-Heptan von restlichem Fett befreit.

3.5.5 Zusammensetzung der FT-IR Proben

Das von Molecular Probes bezogene DM-Nitrophen wurde als Säure geliefert und war in reinem H2O schwerlöslich. Deshalb musste zur Herstellung der DM-Nitrophen Lösung

KOH (Kationenbindung) bzw. TRIS (Phosphorylierung) eingesetzt werden. Es wurde darauf geachtet, dass der pH-Wert von 6 nicht deutlich überschritten und ca. 2 Äquivalente der jeweiligen Base zugesetzt wurden. Das DM-Nitrophen wurde nach Konzentrationsbestimmung entsprechend der Konzentration im Reaktionsmedium aliquotiert und in der Vakuumzentrifuge bis zur Trockne eingeengt.

Die Konzentrationsbestimmung der DM-Nitrophen Lösung erfolgte photometrisch in 50 mM MOPS/KOH, pH 7,2, 50 mM EGTA bei 345 nm.

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Das Gesamtvolumen des Reaktionsmediums inklusive des Pellets betrug 210 µl. Das Volumen des Proteinpellets wurde dabei auf 30 µl geschätzt.

Am Tag des Verbrauchs wurde die entsprechende Menge DM-Nitrophen in den 170 µl des angesetzten Reaktionsmedium gelöst.

Die DTT Lösung wurde jedes Mal frisch angesetzt, da DTT sehr hydrolyseempfindlich ist (pH 6,5, 20 °C, 40 h Halbwertszeit).84

1 mg Thapsigargin (Molecular Probes) wurde in insgesamt 300 µl Ethanol aufgenommen, in der Vakuumzentrifuge einrotiert und bei -20 °C gelagert. Am Tag der Probenpräparation wurde der Rückstand in 7 µl DMSO aufgenommen.

Für die Kontrollmessungen wurden jeweils 4 µl dieser Thapsigarginlösung (5 mM) nach der Resuspendierung des Pellets der 2. Zentrifugation direkt zugegeben. Thapsigargin blieb andernfalls an der Wand des Zentrifugengefäßes haften.

Die Proben für die Kationenbindung in H2O setzten sich wie folgt zusammen:

0,5 M MES/KOH pH 6,1 30 mM DM-Nitrophen 30 mM DTT

30 % Glyzerin

4 mM CaCl2 bzw. 12 mM SrCl2

Für das Reaktionsmedium in D2O wurden die entsprechenden Lösungen direkt in D2O

angesetzt.

Für die Untersuchungen zur Strontium Halbbesetzung wurden statt 30 mM DM-Nitrophen 20 mM verwendet, um Rückbindung an möglicherweise nicht vollständig photolysiertes DM-Nitrophen möglichst gering zu halten. Das Verhältnis von DM-Nitrophen zu DTT wurde konstant gehalten.

0,5 M MES/KOH pH 6,1 20 mM DM-Nitrophen 20 mM DTT

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Der pH-Wert wurde bei Raumtemperatur eingestellt und betrug pH 6,4-5 bei –8°C.64

Die Proben für die Phosphorylierung mit DM-Nitrophen enthielten folgende Konzentrationen: 0,44 M MES/KOH pH 6,0 10 mM DM-Nitrophen 20 mM DTT 20% Glyzerin 15% DMSO 1,8 mM MgCl2 0 bzw. 1,8 mM Phosphat/TRIS pH 6

Der pH wurde bei Raumtemperatur eingestellt und ist nach eigenen Messungen pH 6,2-3 bei 4°C.

Das Reaktionsmedium für die Untersuchung der Phosphorylierung mittels Caged Phosphat (unmarkiert/markiert) setzte sich wie folgt zusammen:

0,45 M MES/KOH pH 6,0 1,8 mM Caged Phosphat

bzw. Caged Phosphat [18O4] /TRIS pH 6

20% Glyzerin 15% DMSO 20 mM DTT

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3.6 Datenauswertung und Datenbearbeitung

Da die Basislinie während der Messung im Bereich der Messung driftete, wurde ein Makro zur Offsetkorrektur geschrieben. Die Absorption der Spektren wurden bei 1800 cm-1 gleich Null gesetzt, da sich in diesem Bereich keine Banden befinden.

3.6.1 Berechnung der Differenzspektren aus den Interferogrammen

∆E vn S vS v n r (~) log (~) (~) = − Gleichung 3-2

3.6.2 Berechnung der Differenzspektren mit interner Referenz

Die aufgenommenen Spektren wurden aus dem Spektrenfile extrahiert.

Sie enthielten die durch die photolytische Spaltung verursachten Banden, die von der Proteinreaktion induzierten Absorptionsänderungen sowie die Banden der postphotolytischen Reaktionen.

Um die während der Reaktion nicht veränderlichen Banden aus den Spektren zu eliminieren, wurden die Spektren zu Beginn der Messung (4-6 s) als interne Referenz verwendet. Dazu wurden sie gemittelt und von allen darauffolgenden Spektren abgezogen. Eine Skalierung der Spektren wurde nicht vorgenommen.

Da der Laserblitz die Probe auch erwärmte, war zu Beginn der Messung eine starke Basisliniendrift sowie eine leichte Wasserbande zu bemerken, die in den ersten Sekunden wieder abklang. Daher wurden diese Spektren nicht für die Berechnung der internen Referenz verwendet.

Abbildung

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Referenzen

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