DNS polimerázok alkalmazása PCR-nél

(1)

DNS polimerázok alkalmazása PCR-nél

Készítette: Altziebler Dániel, Bolyácz Márton, Samu Róbert, Szűcs Tamás

Kiselőadás az Enzimológia c. tárgyhoz 2019.11.20.

(2)

(3)

1. DNS polimerázok

 Ki fedezte fel őket?

 1956-ban Arthur Kornberg fedezte fel E. coli-ban a DNS polimeráz I-et

 Milyen élőlényekben fedezték fel őket? (Bebenek and Kunkel, 2004)

 5 db Escherichia coli-ban

 9 db Saccharomyces cerevisiae-ben

 16 db emberben

 Milyen családokba sorolhatók? (Braithwaite and Ito, 1993; Burgers et al., 2001)

 A, B, C, X és Y

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Ember

3

Arthur Kornberg

(4)

1. DNS polimerázok

 Milyen élettani folyamatokban van fontos szerepük?

 DNS replikációnál

 DNS hibajavító mechanizmusában

 homológ rekombinációnál

 testvér kromatidák kohéziójánál

 sejtciklus fontos lépéseinél

 immunrendszer kialakulásánál

 Milyen betegségeket okoz a hibás működése?

 ophthalmoplegia (szem vagy szem környéki izombénulás)

 xeroderma pigmentosum (rövidítve: XP; UV hatására bekövetkező DNS mutációt kevésbé képes korrigálni a szervezet javító mechanizmusa)

 onkogenezis (tumorképződés).

(5)

1. DNS polimerázok

 Milyen a szerkezete és milyen doménekből áll?

(Steitz, 1998)

 „Tenyér”: Ez tartalmazza a fehérje jellegzetes részét, ami kulcsfontosságú a katalitikus aktivitásban.

 „Ujjak”: A templát szál megfelelő helyzetét biztosítja.

 „Hüvelykujj”: A feladata a DNS megkötése és az enzim processzivitását* határozza meg.

* Annak mértéke, hogy mennyire kötődik hozzá a DNS polimeráz a DNS-hez, más szavakkal: mennyi ideig képes katalizálni a polimerizációt

DNS polimerázok szerkezete

5

(6)

1. DNS polimerázok

 Milyen katalitikus tulajdonságai vannak a DNS polimeráznak?

 5’ – 3’ DNS polimeráz aktivitás

 dATP, dCTP, dGTP és dTTP nukleotidokat képes megfelelő sorrendbe beépíteni. Ehhez kell egy templát DNS szál.

 3’ – 5’ exonukleáz aktivitás

 Az átíródás során előfordul, hogy rossz nukleotid épül be. Ezt képes korrigálni.

 5’ – 3’ exonukleáz , nick-transzláció aktivitás

 Átíródás során a duplaszálú rész egyik felét 5’ – 3’ irányban emészti maga előtt, és a helyére új szálat szintetizál. Így képes a szakadás kezdetét megszüntetni.

 Terminális transzferáz aktivitás

 Templátfüggetlen enzim aktivitás, mely random nukleotidokat beépítve képes egyes szálú DNS-t szintetizálni. Homopolimer farkazáshoz használják.

(7)

1. DNS polimerázok

7

5’ – 3’ DNS polimeráz aktivitás 3’ – 5’ exonukleáz aktivitás

(8)

1. DNS polimerázok

8

5’ – 3’ exonukleáz ,

Nick-transzláció aktivitás

Terminális transzferáz aktivitás

(9)

1. DNS polimerázok

 Milyen DNS polimerázok vannak?

 DNS polimeráz I

 E. coli-ból származó enzim. 5’ – 3’ DNS polimeráz aktivitása van, de 3’

– 5’ és 5’ – 3’ exonukleáz aktivitása is van.

 Fő felhasználásai: DNS szekvencia meghatározása, radioaktív próbák szintézise, kétszálú DNS túlnyúló végeinek feltöltése vagy

visszaemésztése, illetve egyszálú DNS-ből vektor létrehozása

 Klenow fragment

 A DNS polimeráz I fragmentje. 5’ – 3’ DNS polimeráz aktivitása és 3’ – 5’ exonukleáz aktivitása van. Azonban az 5’ – 3’ exonukleáz aktivitása hiányzik.

 T4 DNS polimeráz

 E. coli T4 nevű bakteriofágjából izolálták. Ugyanazok az enzimatikus aktivitásai, mint a Klenow fragmentnek, azonban a 3’ - 5’ exonukleáz aktivitása kb. 200-szor nagyobb a Klenow fragmenténél.

 Felhasználása megegyezik a DNS polimeráz I enzimével. ⁹

3’ – 5’

aktivitás 5’ – 3’ aktivitás Processzivitás DNS

polimeráz I Alacsony Van Alacsony

Klenow

fragment Alacsony - Alcsony

T4 DNS

polimeráz Magas - Alacsony

Szekvenáz Magas - Magas

Taq polimeráz - - Magas

1. táblázat Különböző DNS polimerázok összehasonlítása

(10)

1. DNS polimerázok

 Taq DNS polimeráz

 Thermus aquaticus-ból izolálták

 Termostabil enzim, amelynek nincs 3’-5’ exonukleáz aktivitása, ezért katalízise gyors (több mint 1000 nukleotid épül be a láncba percenként), processzivitása nagy.

 PCR eljárásnál előszeretettel használják (kb. 5000 bázispárig)

 Ha fontos a fidelitás, akkor más enzimet használnak

 TA klónozáshoz kiváló

 Terminális transzferáz

 Nyiroksejtek (lymphocyták) expresszálják emlős szervezetekben.

 A kereskedelemben kapható terminális transzferáz enzimet szarvasmarha DNTT génjét E.

coliba beültetve termeltetik.

 Templátfüggetlen enzim, mely random nukleotidokat beépítve képes egyes szálú DNS-t szintetizálni. Homopolimer farkazáshoz (poli-G farok) használják.

Thermus aquaticus hőforrásokban él

(11)

1. DNS polimerázok

 Pfu DNS polimeráz

 Pyrococcus furiosus-ból izolálták. Termostabil enzim, amelynek 3’ – 5’ exonukleáz aktivitása van, de hiányzik az 5’ – 3’ exonukleáz és terminális transzferáz aktivitása.

 Nagy fidelitású PCR reakcióhoz, primer extenzióhoz (transzkripciós iniciációs pont meghatározása), PCR klónozáshoz és tompa végek létrehozásához használják.

 Vent polimeráz (vagy Tli polimeráz)

 Thermococcus litoralis-ból izolálták. Van 3’ – 5’ exonukleáz aktivitása, viszont hőstabilitása nagyobb a fenti kettőnél (95 °C-on a felezési ideje 7 óra).

 Ötször nagyobb a fidelitása, mint a Taq polimeráznak. Ideális GC-gazdag templát és DNS hurkok új szálának polimerizálásához. Nagy pontosságú PCR reakcióhoz és primer extenzióhoz alkalmazzák.

 Szekvenáz

 T7 nevű bakteriofágból izolálták. Szerkezetét tekintve két alegységből áll, az egyik E. coli thioredoxin fehérjéje, a másik rész genetikailag módosított verziója T7 bakteriofág öt fehérjéjének

 A leggyorsabb DNS polimeráz enzim, emiatt a Sanger-féle láncterminációs szekvenáláshoz használják.

11

Szekvenáz enzim szerkezete

(12)

1. DNS polimerázok

 Herculase Enhance

 A nagy pontosságú Pfu polimeráz, Taq polimeráz és ArchaeMaxx fokozó faktor.

 Hosszú és GC-ben gazdag DNS-fragmentumok amplifikálására szolgál.

 Phusion

 Egy rendkívül megbízható és nagy sebességű új enzim a PCR klónozáshoz. Ez lehetővé teszi a magas hozamot, minimális enzimkoncentrációval.

 rTth DNS polimeráz

 Thermus thermophilus-ból származó rekombináns enzim 40 kb-nál nagyobb DNS- fragmensek amplifikálására.

Thermus thermophilus

(13)

1. DNS polimerázok

 rBst DNS polimeráz

 E. coli-ban termelt, a Bacillus stearothermophilus (Bst) termofil baktérium DNS polimeráz I génjének terméke.

 Képes szintetizálni a magas GC-tartalmú DNS-régiókat, ahol más nem termostabil DNS-polimerázok gyakran hibáznak.

 Összetett, például hajtűszerkezeteket tartalmazó templátok replikálására szolgál.

 Phi29 DNS polimeráz

 Bacillus subtilis phi29 fágból nyerték

 Ez az enzim elsősorban az egyszálú DNS-re hat és 70 kb-nál nagyobb szakaszokat képes szintetizálni

 Alkalmas pl. „rolling-circle”- és fehérjével kezelt DNS-amplifikációra

 Isis proofreading DNS polimeráz

 Pyrococcus abyssi-ből izolálták

 Az egyik legtermostabilabb hibajavító polimeráz a piacon, segítségével nagyon kevés hibával

rendelkező DNS szintetizáltatható 13

Bacillus stearothermophilus

(14)

1. DNS polimerázok

 SurePRIME^TM DNA polimeráz

 A Taq polimerázt kémiailag módosították úgy, hogy egyes aminosavakat hőre labilis blokkoló csoportokkal fedtek el, így a PCR reakció előtt az enzim inaktív formában van.

 Képtelen a dimerizálódott, és az annealing temperature alatt formálódó aspecifikusan bekötő primereket meghosszabbítani. Primer-dimerek akkor képződnek, ha két primerben van egymást kiegészítő rész, és emiatt egymáshoz kapcsolódnak. A 95 °C-ra történő melegítés aktiválja az enzimet, és biztosítja számunkra, hogy az első ciklus teljesen „tisztán” megy végbe.

 BioTherm™ DNS polimeráz

 termostabil DNS polimeráz Thermus aquaticus-ból izolálva.

 Akkor használják, ha nagyon kevés a kezdeti DNS mennyisége (kevesebb mint 100 DNS szál).

(15)

1. DNS polimerázok

 KOD DNS polimeráz

 extrém termofil Thermococcus kadakaraensis KOD1-ből izolálták.

 Három verziója van kereskedelmi forgalomban:

 KOD HiFi 6 kb-ig képes a cél DNS amplifikációjára.

 A KOD Hot Start enzim ugyanaz, mint a KOD HiFi, de hozzáadtak kétféle monoklonális antitestet, amelyek gátolják a polimeráz 3’-5’ exonukleáz aktivitását az annealing temperature környékén.

Képes magas GC tartalmú régiókat is szintetizálni, és a PCR termékek tompa véggel keletkeznek, amik megfelelőek klónozáshoz.

 A KOD XL DNS polimeráz a KOD HiFi DNS polimeráz és annak egy 3’-5’ exonukleáz aktivitás nélküli mutáns formájának az optimalizált keveréke. Hosszabb (akár 30 kb) és komplexebb GC-ben gazdag DNS szakaszok amplifikációjára lett tervezve.

15

Thermococcus kadakaeaensis

(16)

1. DNS polimerázok

2. táblázat DNS polimerázok összefoglalása

(17)

1. DNS polimerázok

17

2. táblázat DNS polimerázok összefoglalása (folytatás)

(18)

1. DNS polimerázok

2. táblázat DNS polimerázok összefoglalása (folytatás)

(19)

2. A PCR technológia



DNS felsokszorozása



Szükséges elemek



DNS templát



Primerek



dNTP-k



DNS-polimeráz

19

(20)

2. A PCR technológia

 Primerek tervezése

 Hossza kb. 20 nukleotid

 Hasonló feltapadási hőmérséklet

 Hairpin, primer dimer elkerülése

 Ismétlődő szekvenciák elkerülése

 3’ vég C vagy G

 Primertervező programok

 3’ vég pontos illeszkedés

(21)

2. A PCR technológia



PCR elve

 T nő 95°C Kétszálú DNS -> egyszálú DNS

 T csökken 45-65°C Primerek bekapcsolódása és polimerizáció

 T nő 75°C Polimeráz enzim optimum

 T nő 95°C Polimerizáció leáll és DNS hődenaturáció

 újra

21

(22)

2. A PCR technológia

22

denaturáció 94-95 ºC

primerek betapadása 45-65 ºC

polimerizáció 72-74 ºC

A PCR-reakció ciklusa

5’

3’

primer 1 primer 2

20-30 x

(23)

2. A PCR tecnológia



PCR-készülékek:

 Termoblokkos

 0,2; 0,5 ml mikro- centrifuga cső és/vagy 96-lyukú PCR-plate

 1,5-3 óra

 Forgótárcsás

 levegőn keresztül

 20-30 perc

23

Termoblokkos PCR-készülék Forgótárcsás PCR-készülék

(24)

3. A PCR típusai

(25)

Nested PCR

 Specifikusság növelése, kontamináció elkerülése

 Két primer párral végzett kétkörös PCR

 1.kör: külső primereket alkalmaznak, a megfelelő termékek mellett aspecifikus termékek is keletkeznek (kontamináció)

 2.kör: belső primereket használnak; a specifikus

termékek rövidebbek, mint az első körben; aspecifikus termékek nem keletkeznek

 További előny a hozam megnövekedése

(26)

Touchdown PCR

 Probléma: alacsony kapcsolódási hőmérsékleten aspecifikus termékek keletkezése

 Megoldás: optimálisnál magasabb

kapcsolódási hőmérséklet a PCR elején

 Az elején csak nagyon kevés primer köt be, de azok mind specifikusan

 Két ciklusonként csökkentik a kapcsolódási T-t, így egyre több primer képes bekötni

(27)

Real-time PCR



Kvantitatív PCR (Q-PCR): PCR termékek mennyiségi mérése valós időben



A DNS 2 szála közé illeszkedő és ennek hatására fluoreszkáló részecskét alkalmaznak



A fluoreszcencia mértéke arányos a keletkező termékek mennyiségével



Hátránya: az aspecifikus termékeket is méri

(28)

Q-PCR, TaqMan

 A probléma megoldására fejlesztették ki a TaqMan próbát

 A TaqMan próba komplementer a spcifikus termék valamelyik szálával

 A TaqMan próba szerkezete: egyik végén

fluoreszcens részecske, másik végén az emmitált fényt elnyelő festék

 Az emittált fény elnyelése csak a két vég közelsége során lép fel

 A láncreakció során a próba beköt, majd lebontódik a DNS polimeráz által a fluoreszcens

részecske és a festék távol kerülnek egymástól fluoreszcencia

 A fluoreszcencia mértéke egyenesen arányos a specifikus termékek mennyiségével

(29)

Inverz PCR

 Ismert szekvenciát szegélyező ismeretlen szekvenciák meghatározása

 A primerek egymáshoz képest fordított pozícióban kötnek be

 A PCR-t egyéb műveletek előzik meg: restrikciós enzimekkel hasítják a DNS templát két végét, majd összeligálják azokat, cirkuláris DNS-t képezve

 Az inverz PCR során a templáthoz képest „kifordított”

termékek keletkeznek: ismeretlen régiót ismert régiók szegélyeznek

 Ilyen formában a termék könnyen megszekvenálható az ismert régiókra tervezett primerekkel

(30)

A PCR alkalmazásai

(31)

PCR a molekuláris biológiában

Feltalálásakor forradalmasította a molekuláris biológiát, az addig használt technikák részét lecserélték PCR alapú

technikákra

Néhány példa PCR alapú technikákra:

• Genomi DNS vagy cDNS klónozása

• DNS Mutagenezis

• Kórokozók kimutatása

• Mutációk detektálása

• DNS szekvenálás

(32)

Szelektív DNS izolálás

A PCR segítségével lehetséges a genomi DNS-ből tetszőleges fragmenteket izolálni, a megfelelő DNS szakasz specifikus

amplifikációjával

Ez jól használható southern és northern blotnál, vagy DNS klónozásnál

(33)

Kriminalisztikai alkalmazás

 Genetikai ujjlenyomat

 A gyanúsított DNS-ét összehasonlítják a bűncselekmény helyszínéről származó DNS-el

 Egyetlen szál DNS is elég

 Amplifikáció-> Gélelektroforézis

 A bűnösség kizárására alkalmasabb, mivel van csekély esély rá, hogy két ember ugyanazzal a szekvenciával rendelkezzen

(34)

Orvosi és diagnosztikai alkalmazás

 Örökletes betegségek kimutatása

Nem kell a teljes genomot szekvenálni, elég a kérdéses géneket amplifikálni, majd azokat szekvenálni a mutáció kimutatása érdekében

 Prenatális tesztek

 Szervátültetés előtti kompatibilitás teszt

 Leukémia és limfóma korai diagnózisa

(35)

Fertőző betegségek diagnózisa

 Baktérium, vírus okozta fertőzések

 A patogén DNS-ét amplifikálják, a diagnózis már a tünetek megjelenése előtt felállítható

 Immundiagnosztikával szemben nem adhat álpozitív eredményt (múltban lezajlott fertőzések miatt), akkor is működik ha az immunválasz elmarad

(36)

Egyéb alkalmazások

 Régészet

 Paleontológia

 Filogenetika

 Apasági tesztek

(37)

Irodalomjegyzék

 Polaina, J., & MacCabe, A. P. (Eds.). (2007). Industrial Enzymes.

doi:10.1007/1-4020-5377-0

 Forensic Science Frank H. Stephenson, in Calculations for Molecular Biology and Biotechnology, 2003

 Wunderlich, L. (2014). Molekuláris biológiai technikák (Typotex)

 https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-bio logy/applications-of-pcr

 https://www.thermofisher.com/