Az extracelluláris vezikulák és membrán nanocsövek szerepe a mezenchimális ıssejtek és
T limfociták közötti transzportfolyamatokban
Doktori értekezés tézisei
Matula Zsolt
Semmelweis Egyetem
Patológiai tudományok Doktori Iskola
Témavezetı: Dr. Urbán Veronika, Ph.D., fıiskolai tanár Dr. Tátrai Péter, Ph.D., szenior kutató
Hivatalos bírálók: Dr. Nagy György, az MTA doktora, egyetemi docens Dr. Molnár Kinga, Ph.D, egyetemi adjunktus
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Nagy Károly, Ph.D., egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Tóth Sára, Ph.D., egyetemi docens
Dr. László Lajos, Ph.D., egyetemi docens
Budapest
2017
2 Bevezetés
A mezenchimális ıssejtek (MSC-k) olyan szöveti eredető ıs- vagy elıdsejtek, melyek már részben elkötelezıdtek valamilyen szövettípusra jellemzı fejlıdési irányba, tehát csak bizonyos sejttípusok létrehozására képesek. Természetesen aszimmetrikus osztódással önmegújításra is képesek, tehát a meghatározott funkcióra specializált utódsejt létrehozásán kívül képesek egy differenciálatlan, még egyértelmően ıssejtnek tekinthetı utódsejt létrehozására is. A mezenchimális ıssejtek elsısorban a mezodermális eredető szövetekre jellemzı sejttípusok létrehozására alkalmasak, tehát csont, porc, zsírszövet, simaizom, inak létrehozására képesek differenciációjuk során [1]. Egyes források szerint speciális tenyésztési körülmények között képesek ectodermális és endodermális irányú differenciációra is, bár ezen képességük, amelyet unortodox plaszticitásnak is szokás nevezni, erısen vitatott [2].
Manapság már széles körően elfogadottá vált az a nézet, miszerint a mezenchimális ıssejtek szinte valamennyi szervbıl és szövetbıl izolálható kötıszöveti ıssejteknek tekinthetık [3]. A csontvelın kívül nagyon könnyen hozzáférhetı forrásuk a zsírszövet, a köldökzsinór ún.
Wharton-kocsonyája, de mindemellett a timuszból, májból, tüdıbıl, vesébıl, lépbıl, izomszövetbıl, és még számos egyéb szövetbıl is – aortából vagy vena cava falából, sıt egyes források szerint agyszövetbıl is – éppúgy kinyerhetıek [4,5].
Kiemelkedı gyulladásgátló és immunszuppresszív aktivitásuk folytán a mezenchimális ıssejtek használata ígéretes terápiás lehetıségeket rejt magában [6]. Az MSC-k számos olyan rendellenesség esetén sikerrel alkalmazhatóak, melyek kiváltó oka a diszregulált és túlzott mértékő immunválasz. Ilyen rendellenességek például a graft versus host betegség (graft versus host disease, GVHD), az autoimmun Chron betegség, szklerózis multiplex, oszteoartritisz, 1-es típusú diabétesz mellitusz, szisztémás lupusz erithematosus (SLE), vagy éppen a kísérletes autoimmun enkefalomielitisz [7-10]. Gyakorlatilag a természetes és adaptív immunrendszer összes sejttípusának mőködésére képesek gátló hatást kifejteni [11-13].
Kutatásaim szempontjából fontos kiemelni, hogy a mezenchimális ıssejtek erıteljes gátló hatást gyakorolnak a T limfocitákra is: redukálják az aktivált T-sejtek osztódását, elısegítik a regulátor T-sejtek képzıdését, valamint megváltoztatják a különbözı T-sejt populációk citokin profilját [14,15]. Amíg az MSC-k által termelt citokineken és szolubilis faktorokon alapuló gátló hatásuk, valamint a ko-kultúrákban tapasztalható – részben a közvetlen sejt-sejt kapcsolatoknak is köszönhetı – erıteljes immunszuppresszív aktivitásuk jól ismert, az MSC- eredető extracelluláris vezikulák (EV-k) szerepe a T limfociták funkcionális gátlásában még kevéssé tisztázott. Mostanáig mindössze néhány tanulmány született, amelyekben a T
3
limfocitákra gyakorolt immunmoduláló hatásukat vizsgálták, viszont az eredmények meglehetısen ellentmondásosnak bizonyultak azzal kapcsolatban, hogy az EV-k hatékonysága in vitro kísérletek során megközelíti-e azt a szintet, amelyet az MSC-k közvetlen jelenléte biztosít [16-19].
Az elmúlt idıszakban az extracelluláris vezikulák szerepe a legkülönbözıbb membrán proteinek és citoplazmatikus komponensek irányított sejtközötti transzportjában egy nagyon intenzíven kutatott tudományterületté nıtte ki magát [20,21]. Az extracelluláris vezikulák a sejtek közötti komplex információ-átvitelben töltenek be nagyon fontos szerepet, hiszen képesek a különbözı vegyületek, fehérjék nagy koncentrációban történı célba juttatására, és egyben védelmet nyújtanak számos molekula – különbözı ribonukleinsavak, miRNS, mRNS – számára a degradáció ellen [22]. Nagyon fontos szerepet töltenek be a donor sejt funkciójának támogatásában, illetve térbeli kiterjesztésében, mint például az antigénbemutatás MHCII-antigén komplex szállításával, vagy a tumorsejtek terjedésének elısegítése. A legnagyobb tudományos érdeklıdés a mikrovezikulákat (MV) és az exoszómákat (EXO) övezi. E két EV populáció közötti különbség elsısorban a méretbeli különbségükbıl adódik, de a vezikulaképzés mechanizmusa is teljesen eltérı: az exoszómák átmérıje 50-100 nm közötti, és az ún. multivezikuláris testek exocitózisával jutnak az intercelluláris térbe spontán illetve különbözı stimulusok hatására is [23,24]. A mikrovezikulák ezzel szemben nagyobb méretőek, 100-1000 nm átmérıvel rendelkeznek, és közvetlenül a sejtet határoló plazmamembránról főzıdnek le különbözı stimulusokra [25]. Az exoszómákra és mikrovezikulákra egyaránt jellemzı, hogy rengeteg membrán asszociált proteint – köztük nagyon sok membrán receptort –, viszont nagyon kevés sejtmagi eredető fehérjét tartalmaznak. Mind a két EV populációra jellemzı, hogy a nem kódoló RNS molekulákon kívül nagyon sok miRNS-t és mRNS-t szállítanak, amit a sejtek át is írnak, miután felvették.
A miRNS-ek poszttranszkripciós szabályozásért is felelısek és epigenetikus változásokban is szerepük van. Az exoszómáknak ezen kívül az MHCII-peptid komplexek szállításában és az antigén prezentációban is szerepük van, valamint számos nem klasszikus módon (leaderless, nincs N-terminális szignálszekvencia) szekretálódó fehérje szekréciójáért is felelısek [26,27].
Saját kutatásaim során is tapasztaltam, hogy sajnos gyakori és nagy problémát jelent a gyakorlatban, hogy az MSC-k plaszticitása rövid idın belül radikálisan csökken, mígnem bekövetkezik a szeneszcencia állapota. Az in vitro kísérletes munkákkal kapcsolatban viszont általános érvényő elvárás, hogy amennyire lehetséges, alacsony passzázs-számú MSC-k kerüljenek felhasználásra. A hosszadalmas, sztenderdizálást-optimalizációt igénylı kísérletek esetében – mint amilyen az MSC-eredető extracelluláris vezikulákkal végzett kutatómunka is
4
– óriási haszna lehet egy immortalizált mezenchimális ıssejt-vonalnak, feltéve persze, hogy ezek a sejtek rendelkeznek a primer sejtek azon tulajdonságaival, amelyek a kísérletes munka szempontjából relevánsak. A kapott eredmények validálása a primer kultúrákon persze elkerülhetetlen lenne, de mindenképpen megkönnyítené a munkát, és az értékes primer kultúrák további felhasználása sem kerülne veszélybe. A replikatív szeneszcencia jelenségén kívül további problémát okoz a primer kultúrák nagyfokú heterogenitása is. Az MSC-k felhasználásával végzett in vitro munkák reprodukálhatósága nagymértékben megkérdıjelezhetı, mivel a kísérletek során általában különbözı donorokból származó, és nagyon eltérı élettartamú primer sejteket használnak. Tovább nehezíti a helyzetet, hogy például az egészséges donorokból izolált csontvelı-eredető MSC tenyészetek feltőnı heterogenitást mutatnak a növekedés, valamint a differenciálódási képesség tekintetében is, és ez a heterogenitás semmilyen módon nem hozható összefüggésbe a donorok életkorával vagy nemével [28]. A heterogenitás problémája szintén kiküszöbölhetı lenne primer MSC kultúrákból létrehozott immortális MSC vonalak létrehozásával.
Célkitőzések
1. Elsıdleges célunk a T limfociták és zsírszövet-eredető mezenchimális ıssejtek közötti transzportfolyamatok vizsgálata volt, melynek során a membrán összetevık és a citoplazma transzportját egyaránt nyomon követtük. Ebben a folyamatban külön megvizsgáltuk az egyes extracelluláris vezikula populációk – mikrovezikulák és exoszómák – szerepét, és összehasonlítottuk a ko-kultúrákban lezajló folyamatokkal. A sejtmembrán jelölését PKH67 fluoreszcens festék segítségével végeztük, a citoplazma átadását pedig calcein-esszé segítségével követtük nyomon.
2. A humán T limfociták mellett C57Bl6 törzsbıl származó egér timociták, humán Jurkat limfóma sejtek, valamint zsírszövet-eredető mezenchimális ıssejtek között is megvizsgáltuk a membrán és citoplazma komponensek átadásának hatékonyságát, és az emberi MSC-k mellet egérbıl származó, szintén zsírszövet eredető mezenchimális ısejteket is felhasználtunk. Az allogén kísérleti modellek mellett tehát xenogén modellek tesztelését és célul tőztük ki.
3. A citoplazatikus komponensek átadásának pontos folyamatát tisztázandó megvizsgáltuk külön a mikrovezikulák, valamint a közvetlen sejt-sejt kapcsolatok jelentıségét is. A
5
fluoreszcens calcein átadását a T limfociták és humán MSC-k között a ko-kultúrák konfokális mikroszkópos vizsgálatával próbáltuk kideríteni, ahol a membrán jelölést DiI, a citoplazma jelölését pedig calcein-esszé segítségével végeztük.
4. A mezenchimális ıssejtek T limfocitákra gyakorolt immunszuppresszív aktivitásának vizsgálatára a T-sejtek receptor-specifikus, vagy mitogénnel történı aktiválását követıen került sor. A T-sejt proliferáció gátlásán kívül – melynek vizsgálatához két különbözı esszét is alkalmaztunk (resazurin és CFSE sejtproliferációs esszé) – a citotoxikus és helper T-sejtek interferon-gamma termelésének gátlását is tanulmányoztuk. A kísérletek során külön megvizsgáltuk a humán Zs-MSC-eredető mikrovezikulák és exoszómák dózisfüggı hatását, az extracelluláris vezikuláktól mentesített MSC-kondícionált médium (MSC-KM) hatását hígítási sort is alkalmazva, valamint a közvetlen ko-kultúrák esetében fellépı T-sejt proliferáció és IFN-ƴ termelés gátlását. Ezeknél a kísérleteknél allogén kísérleti modellt alkalmaztunk, a ko-kultúrákban különbözı sejtarányokat is teszteltünk. A sejtosztódás gátlásának vizsgálatát Jurkat sejtek esetében is elvégeztük, külön megvizsgálva az MSC- eredető MV-k, EXO-k, MSC-KM hatását, valamint a humán MSC-k közvetlen jelenlétébıl adódó gátló hatást ko-kultúra modellekben.
5. Munkánk során emberi donorból származó, zsírszövet-eredető mezenchimális ıssejtek immortalizálását is célul tőztük ki, melynek megvalósításához lentivirális génbeviteli eljárást alkalmaztunk. A különbözı immortális sejtvonalak létrehozását más-más gének illetve génkombinációk bevitelével valósítottuk meg: hTERT, Bmi-1, hTERT+Bmi-1, hTERT+SV40T. Célunk a továbbiakban annak vizsgálata volt, hogy ezek a sejtvonalak továbbra is megfelelnek-e a mezenchimális ıssejtekkel szemben támasztott kritériumrendszernek, hosszan tartó tenyésztés során is megtartják-e multipotens állapotukat, vagyis differenciációs képességüket, valamint megırzik-e genomi stabilitásukat.
Módszerek
• A mikrovezikula és exoszóma preparátumokat a sejtkultúra felülúszókból a differenciál centrifugálás és gravitációs szőrés kombinációjával állítottuk elı.
6
• Az extracelluláris vezikulák méreteloszlását és koncentrációját dinamikus fényszórás mérések (Dynamic light scattering analysis, DLS), valamint az ún „resistive pulse sensing” jelenségen alapuló Izon qNano készülék segítségével határoztuk meg.
• Az extracelluláris vezikulák morfológia vizsgálatát transmissziós elektronmikroszkópia segítségével végeztük.
• A sejtek és extracelluláris vezikulák felszíni antigén-mintázatát – antitest-jelölést követıen – áramlási citometriás vizsgálatok segítségével állapítottuk meg.
• A membrán vezikulák és citoplazmatikus eredető anyagok átadásának vizsgálatához PKH67 fluoreszcens membrán jelölı festéket, szintén fluoreszcens DiI membránfestéket, valamint calcein-esszét használtunk. Az átadás hatékonyságát áramlási citométeres mérések segítségével állapítottuk meg, de ezen kívül konfokális lézer scanning mikroszkópia segítségével is megvizsgáltuk a ko-kultúrában lezajló folyamatokat.
• A mezenchimális ıssejtek, MSC-eredető extracelluláris vezikulák és az MSC- kondícionált médium immunszuppresszív hatásának vizsgálatához resazurin sejtproliferációs-esszét, karboxifluoreszcein szukcinimidil észter sejtproliferációs-esszét (CFSE), valamint intracelluláris interferon-gamma (IFN- γ) immunesszét használtunk.
• Az aktivált T limfocita eredető extracelluláris vezikulák mezenchimális ıssejtekre gyakorolt hatását prosztaglandin E2 immunesszé segítségével bizonyítottuk.
• Az immortalizált mezenchimális ıssejt-vonalak létrehozásához lentivirális génbeviteli eljárást alkalmaztunk.
• A provírus kópiaszámának meghatározásához, valamint a génexpressziós vizsgálatokhoz kvantitatív valós idejő PCR (RT-qPCR) reakciókat végeztünk.
• A különbözı immortalizáló gének hatékony kifejezıdését telomeráz enzimaktivitás méréssel (TRAPeze XL Telomerase Detection Kit), valamint a keletkezett géntermékek immuncitokémiai festésével is bizonyítottuk.
7
• A proliferációs -és sejtöregedés vizsgálatokhoz resazurin sejtproliferációs-esszét, valamint szeneszcencia-asszociált β-galaktozidáz festést használtunk.
• A primer ıssejtek, valamint a sikeresen immortalizált ıssejt-vonalak esetében is elvégeztük a differenciációs képesség vizsgálatát a következı módszerek segítségével:
- Immuncitokémiai vizsgálatok
- ALP aktivitás kimutatása kromogén szubsztrát hozzáadásával - Extracelluláris kalcium kimutatása Alizarin vörös festéssel - Intracelluláris lipidcseppek kimutatása Oil Red O festéssel
• A feltételezett transzformáció bizonyítására kariotípus meghatározást, valamint in vivo tumorképzı képesség vizsgálatot végeztünk NOD/SCID gamma egerekben. Az ehhez kapcsolódó sejtciklus vizsgálatokat propídium-jodidos jelölést követıen áramlási citométer segítségével végeztük.
Eredmények
1. Sem az egér timociták, sem a humán T-sejtek vagy Jurkat limfóma sejtek nem képesek számottevı, Zs-MSC eredető MV vagy EXO felvételére függetlenül attól, hogy allogén vagy xenogén kísérleti modellt alkalmaztunk. A ko-kultúra modellek esetében ugyanezt tapasztaltuk, ahol számottevı membránkomponens átadást nem tudtunk kimutatni.
2. Ezzel a megfigyeléssel összhangban azt találtuk, hogy az aktivált T-sejtek osztódását és IFN-γ termelését az MSC-eredető MV-k és EXO-k sem képesek gátolni még óriási feleslegben sem a sejtek számához viszonyítva.
3. Zs-MSC-k nagy mennyiségő membrán komponenst vettek fel, függetlenül attól, hogy ezek az összetevık melyik donor sejttıl származtak. A ko-kultúra modellek eredményeit sikeresen reprodukáltuk megfelelı mennyiségő MV vagy EXO partikulum hozzáadásával, így sikerült bizonyítanunk, hogy a membrán komponensek átadásáért az extracelluláris vezikulák felelısek.
4. A funkcionális vizsgálatainkból az is kiderült, hogy az MSC-k aktivált T limfocita- eredető EV-k hatására igen erıteljes PGE2 termelést mutatnak, amely dózisfüggı módon
8
megy végbe mind az MV, mind az EXO kezelés hatására. Ilyen módon sikerült bizonyítanunk, hogy a T limfociták az extracelluláris vezikulákon keresztül közvetlen módon képesek befolyásolni az MSC-k immunszuppresszív aktivitását.
5. Munkánk során megállapítottuk, hogy sem az egér timociták, sem a Jurkat limfóma sejtek nem képesek a MSC-eredető citoplazmatikus calcein felvételére, viszont az MSC-k és T- sejtek között egy nagyon intenzív, kétirányú citoplazmatikus transzportfolyamat zajlik. A sejtplazma eredető fluoreszcens calcein átadásához mindenképpen szoros sejt-sejt kapcsolatok szükségesek, és ebben a folyamatban az EV-k szerepe nem bizonyítható.
Vizsgálataink során egy eddig még ismeretlen kölcsönhatás meghatározó szerepét sikerült bizonyítanunk, ahol a citoplazma intenzív átadása a két sejttípus között membrán nanocsöveken keresztül valósul meg.
6. Az aktivált T-sejt osztódásának és IFN-γ termelésének gátlása szignifikánsan nagyobb volt a közvetlen sejt-sejt kapcsolatoknak köszönhetıen, mint szolubilis faktorok és citokinek alkalmazása esetén, vagyis az MSC-KM használatánál. A membrán nanocsövek által biztosított, MSC-k és T-sejtek között zajló intenzív citoplazmatikus transzportfolyamat tehát a T-sejtek funkciójára bizonyítottan hatással van, és valószínőleg az ıssejtek fenotípusára is befolyással bír.
7. Az MSC-k immortalizációját célzó kísérleteknél önmagában a Bmi-1 gén bevitelével sikerült jelentısen meghosszabítanunk a populáció élettartamát, ám 60.
populációkettızıdésnél (PD) a teljes populáció szeneszcenciát mutatott. A hTERT gén bevitele önmagában egy idı után transzformációt okozott bizonyos sejtben, amelyek késıbb jelentıs szelekciós elınyre tettek szert (PD83 után).
8. A hTERT és Bmi-1 gének együttes bevitelével sikerült olyan stabil immortális Zs-MSC sejtvonalat létrehoznunk, amelynek alapvetı tulajdonságai – többek között differenciációs potenciálja – a primer sejtekhez viszonyítva semmit sem változtak, és esetükben transzformációra utaló jelet sem találtunk.
9 Következtetések
Annak ellenére, hogy számos erıfeszítés irányul a mezenchimális ıssejtek immunszuppresszív aktivitásáért felelıs mechanizmusok pontos tisztázására, amelyek a T limfociták funkcionális gátlásáért felelısek [29,30], a kontaktus-függı, valamint membrán- közvetített jelátviteli folyamatok még nem teljesen tisztázottak. A legfrissebb eredmények egybehangzóan azt mutatják, hogy az immunválasz szabályozásában aktívan részt vevı, különféle bioaktív molekulák szállításában membránnal határolt partikulumok is részt vesznek. Számos ilyen bioaktív molekuláról bebizonyosodott már, hogy szállításuk extracelluláris vezikulák közvetítésével zajlik [31-33].
A saját kutatási eredményeink azt mutatják, hogy sem az egér timociták – melyeket nagyrészt éretlen T sejtek alkotnak – sem a humán perifériás T limfociták nem képesek számottevı, zsírszövet-eredető MSC-EV felvételére függetlenül attól, hogy allogén vagy xenogén kísérleti modellt alkalmaztunk. Ugyanez vonatkozik a T-sejt eredető limfoblasztoid Jurkat sejtvonalra is. Ezzel a megfigyeléssel összhangban azt tapasztaltuk, hogy egyik EV populációnak sem volt funkcionális hatása a T limfocitákra nézve, az aktivált T-sejtek osztódását és IFN-γ termelését az MSC-eredető mikrovezikuák és exoszómák nem voltak képesek gátolni. Érdekes módon a fordított kísérleti felállás esetében azt tapasztaltuk, hogy a Zs-MSC-k nagy mennyiségő membrán komponenst vettek fel, függetlenül attól, hogy ezek a membrán összetevık melyik donor sejttípustól származtak. A funkcionális vizsgálatainkból az is kiderült, hogy ha a mezenchimális ıssejteket kezeljük aktivált T limfocita-eredető extracelluláris vezikulákkal, az MSC-k válaszul egy igen erıteljes PGE2 termelést mutatnak, amely dózisfüggı módon megy végbe mind az MV, mind az EXO kezelés hatására.
A citoplazmatikus összetevık átadásának vizsgálata során megállapítottuk, hogy sem az egér timociták, sem a Jurkat limfóma sejtek nem képesek a MSC-eredető citoplazmatikus calcein felvételére, viszont az MSC – T-sejt ko-kultúra modelleknél megfigyeltük, hogy a két sejttípus között egy nagyon intenzív citoplazmatikus transzportfolyamat zajlik. Ebben az esetben viszont jelentıs különbségeket tapasztaltunk az allogén és xenogén modellek között, amely azt sejteti, hogy a T limfociták részérıl egy aktiv, membránösszetevıket érintı felismerési folyamat lehet meghatározó ebben a sejtes kölcsönhatásban. A citoplazmatikus calcein átadásához mindenképpen szoros sejt-sejt kapcsolatok szükségesek, és ebben a folyamatban az extracelluláris vezikulák szerepe nem bizonyítható. Hogy tisztázzuk, milyen mechanizmus felelıs az intenzív és kölcsönös citoplazmatikus calcein transzportért az MSC-k és T-sejtek között, megvizsgáltuk a ko-kultúrákat konfokális mikroszkóp segítségével is.
10
Rengeteg, T limfocitáktól származó membrán nanocsı volt megfigyelhetı a ko-kultúrákban, amelyek direkt összeköttetést biztosítottak a szöveti ıssejtekkel. Az MSC – Jurkat ko- kultúrák vizsgálata során a két sejttípus között ilyen direkt összeköttetést nem sikerült kimutatnunk, bár a Jurkat sejtek egymással sok esetben kapcsolódtak membrán nanocsövek segítségével.
Eredményeink alapján kijelenthetjük, hogy egy nagyon aktív kommunikáció zajlik a két sejtféleség között, melynek meghatározó résztvevıi a T-sejt eredető extracelluláris vezikulák, valamint a szintén T-sejt eredető membrán nanotubulusok. A T-sejtektıl származó mikrovezikulák és exoszómák felvétele, valamint a nanocsövekeken keresztül történı citoplazmatikus komponensek átadása egyértelmően megváltoztatja a Zs-MSC-k immunmoduláló aktivitását, egy méginkább szuppresszív fenotípust eredményezve, és egyben indukálva olyan gyulladásgátló szolubilis faktorok termelését is, mint például a PGE2. Kísérleteinkbıl az is kiderült, hogy citoplazmatikus összetevık átadása kétirányú az MSC-k és T-sejtek között, amibıl az következik, hogy MSC-eredető citoplazma összetevık is közvetlenül hatással lehetnek a T limfociták funkciójára.
Munkánk második nagy fejezetében emberbıl származó primer, zsírszövet-eredető mezenchimális ıssejteket immortalizáltunk lentivirális génbeviteli rendszer segítségével. A primer mezenchimális ıssejtek felhasználásával végzett kutatómunka során fellépı két sarkalatos probléma, a minták nagyfokú heterogenitása, valamint a replikatív szeneszcencia problémája is kiküszöbölhetı primer MSC kultúrákból létrehozott immortális sejtvonalak létrehozásával és alkalmazásával. A mezenchimális ıssejtek transzdukciója során a hTERT gén bevitelét kombináltuk a Bmi-1 és SV40T gének bevitelével. Munkánk során teszteltük azt is, hogy a hTERT vagy Bmi-1 gének bevitele önmagában képes-e a Zs-MSC-k immortalizálására, vagy csak együttes kifejeztetésük képes ezt sikeresen megvalósítani.
A Bmi-1 gén bevitelét követıen azt tapasztaltuk, hogy az átlagos provírus kópiaszám az idı elırehaladtával növekedett. Eszerint bizonyos Zs-MSCBmi-1 klónok, melyek magasabb szinten expresszálták a Bmi-1 gént, szelekciós elınyre tettek szert a populáció egyéb sejtjeivel szemben, viszont a populáció végül nem volt képes elkerülni a szeneszcencia állapotát és végül osztódásuk leállt (60. populációkettızıdés).
A hTERTgén bevitelét követıen szembesülnünk kellett azzal, hogy önmagában a hTERT által biztosított korlátlan replikációs képesség bizony meglehetısen termékeny talajt biztosít a potenciálisan transzformáló mutációk megszerzéséhez. A 83. populációkettızıdést követıen a populációban szelekciós elınyre tett szert egy olyan klón, amely transzformálódott. Ez a klonális eredető sejtvonal jóval intenzívebb sejtosztódást mutatott az eredeti populációhoz
11
képest, szeneszcencia-asszociált β-Galaktozidáz festıdést nem mutatott, és a kontaktgátlás teljes hiányát mutatta.
A hTERT és Bmi-1 gének együttes bevitelével viszont sikerült olyan immortális Zs-MSC sejtvonalat létrehoznunk, amelynek differenciációs potenciálja a primer sejtekhez visznyítva semmit sem változott, és esetükben transzformációra utaló jelet sem tapasztaltunk.
Irodalomjegyzék
1. Pittenger MF, AM Mackay, SC Beck, RK Jaiswal, R Douglas, JD Mosca, MA Moorman, DW Simonetti, S Craig and DR Marshak. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284:143-147.
2. Caplan AI and SP Bruder. (2001). Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends in Molecular Medicine 7:259-264.
3. Abu Kasim NH, V Govindasamy, N Gnanasegaran, S Musa, PJ Pradeep, TC Srijaya and ZACA Aziz. (2012). Unique molecular signatures influencing the biological function and fate of post-natal stem cells isolated from different sources. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine 9:E252–E266.
4. Meirelles LDS, PC Chagastelles and NB Nardi. (2006). Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. Journal of Cell Science 119:2204- 2213.
5. Hass R, C Kasper, S Bohm and R Jacobs. (2011). Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue- derived MSC. Cell Communication and Signaling 9:12.
6. Wang Y, X Chen, W Cao and Y Shi. (2014). Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nature Immunology 15:1009-1016.
7. Sun LY, DD Wang, J Liang, HY Zhang, XB Feng, H Wang, BZ Hua, BJ Liu, SQ Ye, XA Hu, WR Xu, XF Zeng, YY Hou, GS Gilkeson, RM Silver, LW Lu and ST Shi.
(2010). Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Transplantation in Severe and Refractory Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 62:2467-2475.
8. Gao F, SM Chiu, DA Motan, Z Zhang, L Chen, HL Ji, HF Tse, QL Fu and Q Lian.
(2016). Mesenchymal stem cells and immunomodulation: current status and future prospects. Cell Death Dis 7:e2062.
12
9. Bai L, DP Lennon, AI Caplan, A DeChant, J Hecker, J Kranso, A Zaremba and RH Miller. (2012). Hepatocyte growth factor mediates mesenchymal stem cell-induced recovery in multiple sclerosis models. Nature Neuroscience 15:862-U86.
10. Gordon D, G Pavlovska, JB Uney, DC Wraith and NJ Scolding. (2010). Human Mesenchymal Stem Cells Infiltrate the Spinal Cord, Reduce Demyelination, and Localize to White Matter Lesions in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.
Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 69:1087-1095.
11. Gebler A, O Zabel and B Seliger. (2012). The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends in Molecular Medicine 18:128-134.
12. Najar M, G Raicevic, H Fayyad-Kazan, D Bron, M Toungouz and L Lagneaux.
(2016). Mesenchymal stromal cells and immunomodulation: A gathering of regulatory immune cells. Cytotherapy 18:160-171.
13. Tyndall A. (2014). Mesenchymal stem cell treatments in rheumatology-a glass half full? Nature Reviews Rheumatology 10:117-124.
14. Castro-Manrreza ME and JJ Montesinos. (2015). Immunoregulation by Mesenchymal Stem Cells: Biological Aspects and Clinical Applications. Journal of Immunology Research 2015:394917.
15. Aggarwal S and MF Pittenger. (2005). Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood 105:1815-1822.
16. Blazquez R, FM Sanchez-Margallol, O de la Rose, W Dalemans, V Alvarez, R Tarazone and JG Casadol. (2014). Immunomodulatory potential of human adipose mesenchymal stem cells derived exosomes on in vitro stimulated T cells. Frontiers in Immunology 5:556.
17. Conforti A, M Scarsella, N Starc, E Giorda, S Biagini, A Proia, R Carsetti, F Locatelli and ME Bernardo. (2014). Microvescicles Derived from Mesenchymal Stromal Cells Are Not as Effective as Their Cellular Counterpart in the Ability to Modulate Immune Responses In Vitro. Stem Cells and Development 23:2591-2599.
18. Zhang B, Y Yin, RC Lai, SS Tan, ABH Choo and SK Lim. (2014). Mesenchymal Stem Cells Secrete Immunologically Active Exosomes. Stem Cells and Development 23:1233-1244.
19. Di Trapani M, G Bassi, M Midolo, A Gatti, PT Kamga, A Cassaro, R Carusone, A Adamo and M Krampera. (2016). Differential and transferable modulatory effects of mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles on T, B and NK cell functions. Scientific Reports 6.
13
20. Simons M and G Raposo. (2009). Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol 21:575-81.
21. Greening DW, SK Gopal, R Xu, RJ Simpson and W Chen. (2015). Exosomes and their roles in immune regulation and cancer. Semin Cell Dev Biol 40:72-81.
22. Raposo G and W Stoorvogel. (2013). Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology 200:373-383.
23. Blanchard N, D Lankar, F Faure, A Regnault, C Dumont, G Raposo and C Hivroz.
(2002). TCR activation of human T cells induces the production of exosomes bearing the TCR/CD3/zeta complex. Journal of Immunology 168:3235-3241.
24. Wahlgren J, TDL Karlson, P Glader, E Telemo and H Valadi. (2012). Activated Human T Cells Secrete Exosomes That Participate in IL-2 Mediated Immune Response Signaling. Plos One 7:e49723.
25. Osteikoetxea X, A Balogh, K Szabo-Taylor, A Nemeth, TG Szabo, K Paloczi, B Sodar, A Kittel, B Gyoergy, E Pallinger, J Matko and EI Buzas. (2015). Improved Characterization of EV Preparations Based on Protein to Lipid Ratio and Lipid Properties. Plos One 10: UNSP e0121184
26. Yanez-Mo M, PRM Siljander, Z Andreu, AB Zavec, FE Borras, EI Buzas, K Buzas, E Casal, F Cappello, J Carvalho, E Colas, A Cordeiro-da Silva, S Fais, JM Falcon-Perez, IM Ghobrial, B Giebel, M Gimona, M Graner, I Gursel, M Gursel, NHH Heegaard, A Hendrix, P Kierulf, K Kokubun, M Kosanovic, V Kralj-Iglic, EM Kramer-Albers, S Laitinen, C Lasser, T Lener, E Ligeti, A Line, G Lipps, A Llorente, J Lotvall, M Mancek-Keber, A Marcilla, M Mittelbrunn, I Nazarenko, ENM Nolte-t' Hoen, TA Nyman, L O'Driscoll, M Olivan, C Oliveira, E Pallinger, HA del Portillo, J Reventos, M Rigau, E Rohde, M Sammar, F Sanchez-Madrid, N Santarem, K Schallmoser, MS Ostenfeld, W Stoorvogel, R Stukelj, SG Van der Grein, MH Vasconcelos, MHM Wauben and O De Wever. (2015). Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles 4: 27066
27. El Andaloussi S, I Maeger, XO Breakefield and MJA Wood. (2013). Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery 12:348-358.
28. Phinney DG, G Kopen, W Righter, S Webster, N Tremain and DJ Prockop. (1999).
Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells. Journal of Cellular Biochemistry 75:424-436.
14
29. Ma S, N Xie, W Li, B Yuan, Y Shi and Y Wang. (2014). Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death and Differentiation 21:216-225.
30. Bernardo ME and WE Fibbe. (2013). Mesenchymal Stromal Cells: Sensors and Switchers of Inflammation. Cell Stem Cell 13:392-402.
31. de Candia P, V De Rosa, M Casiraghi and G Matarese. (2016). Extracellular RNAs: a secret arm of immune system regulation. J Biol Chem 291:7221-7228.
32. Gyorgy B, TG Szabo, M Pasztoi, Z Pal, P Misjak, B Aradi, V Laszlo, E Pallinger, E Pap, A Kittel, G Nagy, A Falus and EI Buzas. (2011). Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences 68:2667-2688.
33. Katsuda T, N Kosaka, F Takeshita and T Ochiya. (2013). The therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Proteomics 13:1637-1653.
A tézisek alapjául szolgáló publikációk
Zsolt Matula, Andrea Németh, Péter Lırincz, Áron Szepesi, Anna Brózik, Edit Irén Buzás, Péter Lıw, Katalin Német, Ferenc Uher, Veronika S. Urbán: The Role of Extracellular Vesicle and Tunneling Nanotube-Mediated Intercellular Cross-Talk Between Mesenchymal Stem Cells and Human Peripheral T Cells. Stem Cells and Development; 25:1818-1832 (2016) (IF: 3,562)
Péter Tátrai, Áron Szepesi, Zsolt Matula, Anna Szigeti, Gyöngyi Buchan, András Mádi, Ferenc Uher, Katalin Német: Combined introduction of Bmi-1 and hTERT immortalizes human adipose tissue-derived stromal cells with low risk of transformation. Biochemical and Biophysical Research Communications; 422:28-35 (2012) (IF: 2,406)
Áron Szepesi, Zsolt Matula, Anna Szigeti, György Várady, József Szalma, Gyula Szabó, Ferenc Uher, Balázs Sarkadi, Katalin Német: In Vitro Characterization of Human Mesenchymal Stem Cells Isolated from Different Tissues with a Potential to Promote Complex Bone Regeneration. Stem Cells International; 2016:3595941 (2016) (IF: 3,54)
A tézisek témájához szorosan nem kapcsolódó közlemények
Dóra Mihály, Zsolt Matula, Yi-Che Changchien, Gergı Papp, Péter Tátrai, Zoltán Sápi
15
First cloned human immortalized adipose derived mesenchymal stem-cell line with chimeric SS18-SSX1 gene (SS-iASC).Cancer Genetics; 216-217: pp. 52-60. (2017) (IF: 1,93)
Zsuzsanna Nerada, Zoltán Hegyi, Áron Szepesi, Szilárd Tóth, Csilla Hegedüs, György Várady, Zsolt Matula, László Homolya, Balázs Sarkadi, Ágnes Telbisz: Application of fluorescent dye substrates for functional characterization of ABC multidrug transporters at a single cell level. Cytometry Part A; 89:826-34 (2016) (IF: 3.222)
Zsolt Matula, Gyöngyi Kudlik, Veronika S. Urbán, Ferenc Uher: Quo vadis hematology?
Orvosi Hetilap; 157:1819-1829 (2016) (IF:0,349)
Gyöngyi Kudlik, Zsolt Matula, Tamás Kovács, Veronika S. Urbán, Ferenc Uher: At the border of pluri- and multipotency: the neural crest stem cells. Orvosi Hetilap; 156:1683-94 (2015) (IF:0,291)
Áron Szepesi, Zsolt Matula, Anna Szigeti, György Várady, Gyula Szabó, Ferenc Uher, Balázs Sarkadi, Katalin Német: ABCG2 is a selectable marker for enhanced multilineage differentiation potential in periodontal ligament stem cells. Stem Cells and Development;
24:244-52 (2014) (IF: 3,777)
Veronika Kovács- Haász, Bettina Dulka, Zita Pöstényi, András Polyák, Zsolt Matula, Anna Szigeti, Ana Ivanovska, Julianna Thuróczy, Ferenc Uher, Katalin Német, Lajos Balogh: A mesenchymalis ıssejtek felhasználásának lehetıségei az állatorvosi kutatásokban és gyógyításban 1. rész: Irodalmi áttekintés. Magyar Állatorvosok Lapja; 138:(6) pp. 349-360.
(2016) (IF: 1,89)
Veronika Kovács- Haász, Bettina Dulka, Zita Pöstényi, András Polyák, Zsolt Matula, Anna Szigeti, Ana Ivanovska, Julianna Thuróczy, Ferenc Uher, Katalin Német, Lajos Balogh: A mesenchymalis ıssejtek felhasználásának lehetıségei az állatorvosi kutatásokban és gyógyításban 2. rész: Saját vizsgálatok.Magyar Állatorvosok Lapja; 138:(7) pp. 401-412.
(2016) (IF: 1,89)
16
Gyöngyi Kudlik, Zsolt Matula, Veronika S Urbán, Ferenc Uher: A makrofágpolarizáció szerepe a sebgyógyulásban és a szövetregenerációban. Immunológiai szemle; 7:(1) pp. 27-37.
(2015) (IF: 0)
17
