A GOMBAHIFAK MIKROSZKÓPOS VIZSGALATA A GAZDANÖVÉNY SZÖVETEIBEN
VÁGÁS ENDRE
(Közlésre érkezett: 1973. december 10.)
A gombakártevők s e j t f o n a l a i n a k ( m y c é l i u m á n a k ) mikroszkópos ki- m u t a t á s a gazdasági n ö v é n y e i n k szöveteiben, de a k á r épület- és ipari f a - a n y a g a i n k b a n is, e g y a r á n t fontos feladat. Az utóbbi időben a felsoroltak mellett még a f a t ö n k ö k felületén végzett gombatermesztés m e l l é k t e r m é - k e k é n t jelentkező un. , , m i k ó f a " vizsgálatában is szerepet kapott. Nem jelentéktelen azonban e kérdés szemléltetéstechnikai vonatkozása sem;
azaz, hogy miként k ö v e t h e t j ü k n y o m o n és d e m o n s t r á l h a t j u k a g o m b a f o n a - lak behatolás-, t e r j e d é s - és kár tevésmód ját a gazdanövényben. A gomba- kártevők f i n o m sejtfonalaikkal ugyanis átszövik a gazdanövényt, miköz- ben a sejtek a n y a g á n a k jelentős részét felélik, f e l h a s z n á l j á k ; az ipari fa- anyag állományát pedig n a g y m é r t é k b e n átalakítják, fellazítják, sőt, ron- csolják.
A gombahifák k i m u t a t á s a a gazdanövény szövetei között sokáig meglehetősen problematikus mikrotechnikai f e l a d a t n a k látszott. N a p j a -
inkig erre a célra mindössze négy lényegesebb e l j á r á s t — Pianese 1896
—, Cartwright 1926 —, Margolena 1932 — és Markus 1951-ből származó módszereit — tart számon az irodalom. Az eddigi módszerek mindegyike lényegében ún. progresszív festőeljárás, azaz azon az elven alapszik, hogy a gombafonalak bizonyos f e s t é k a n y a g o k a t nagyobb m é r t é k b e n vesz- nek, fel — a metszetben erősebben színeződnek — m i n t a gazdanövény szövetei. Sajnos, az említett festődési eltérés — a m e l y n e k oka a gomba- fonalak és a növényi sejtfalak, sejtalkotórészek eltérő felépítésében ke- resendő — a környező szövet és a gombafonalak között nem mindig elég- gé szembetűnő. így a mycelium a környezetéből g y a k r a n alig t ű n i k elő;
másrészt az eddigi módszerekkel készült p r e p a r á t u m o k többnyire kevés- sé időállók, és ezért alig van mód a gyakorlati és t u d o m á n y o s szempont- ból igen fontos összehasonlító p r e p a r á t u m - g y ű j t e m é n y e k megőrzésére.
A progresszív módszerek h a t á s f o k á n á l lényegesen kedvezőbb ered- m é n y h e z jutunk, ha regresszív festőeljáráshoz f o l y a m o d u n k ; azaz a gaz- d a n ö v é n y szöveteiben lazán — egyben feleslegesen — kötődött festék- anyagok jelentékeny részét úgy v o n j u k ki (differenciáljuk), hogy a fes- tés e r e d m é n y é t a g o m b a f o n a l a k r a k o n c e n t r á l j u k . Az egyébként mérsé- kelt e r e d m é n y e k e t n y ú j t ó C a r t w r i g h t - f é l e eljárást differenciálás köz- beiktatásával a következőként a l a k í t h a t j u k élesen színező módszerré:
24*
A feldolgozásra szánt friss növényi anyagot 70%-os alkoholban, 5—10%-os formalinoldatban, esetleg Boum-oldatban rögzítjük; m a j d p a - r a f f i n b a ágyazzuk. Az ipari f a a n y a g o t általában nem rögzítjük. A kemé- n y e b b f a f a j t á k a t vízben főzve p u h í t j u k , m a j d közvetlenül — beágyazás nélkül — metsszük mikrotom segítségével. A közvetlen metszésre nem al- kalmas — könnyen töredező — faanyagot szintén p a r a f f i n b a ágyazottan metszük. Általában kb. 10—15 m i k r o n vastagságú metszeteket készítünk, m e r t a vékonyabb metszetekben amycéliumból csak f r a g m e n t u m o k vál- n á n a k m a j d megfigyelhetőkké a látótérben. Többnyire radiális és tan- genciális metszeteket készítünk, noha a keresztmetszeti képet sem nél- külözhetjük a gombafertőzöttség vizsgálatában.
A festéshez szükséges festékoldatok:
A) 1%-os vizes safraninoldat
(Safranin O, Color Index szám: 50 240)
B) Vízben oldható anilinkék (Color Index szám: 42 755) 2,5 g Desztillált víz 25 ml Telített vizes pikrinsavoldat 100 ml
1. A p a r a f f i n kivonása után, amelyet benzollal végzünk, a tárgyle- m e z r e ragasztott metszeteket acetonba, 70%-os alkoholba, m a j d desztil- lált vízbe helyezzük 4—5 percre.
2. Az ,,A"-oldatban 1—3 percig festünk, m a j d desztillált vízzel le- ö b l í t j ü k a metszetet.
1. ábra
A tárgylemez kezelése Kir/cbrid-féle csíptetővel.
. 4 8 2
3. A vízszintesen tartott tárgylemezen a metszetre néhány csepp ,,B" oldatot rétegezünk — a metszetet az oldattal bőven f e d j ü k —, majd gyenge lángon óvatosan forrásig hevítjük. A tárgylemezt a festékoldat felforralása közben célszerű, ha az ún. Kirkbrid-féle drótcsiptetővel t a r t - j u k a láng fölé (1. ábra). A csíptető rugósan rögzíti a tárgylemezt, és a csíptető szárainak összenyomásakor bocsátja el azt.
A tárgylemez lehűlése után a metszetet vízben öblítjük.
4. A festékfelesleget 1%-os nátronlúgoldatban kivonjuk; a metsze- t e t 2—3 másodpercig t a r t j u k az oldatban. A metszet téglavörös színt ölt.
5. A metszetet vízzel leöblítjük, m a j d háromszor cserélt acetonnal kezeljük. Az utolsó acetonkezelés addig tartson, amíg a metszet festék- felesleget már nem ad le.
2. á b r a
A kukoricaüszög (Ustilago maydis) hi fái, a szár alapszövetének sejtjeiben.
(Mikrofel vétel)
3. á b r a
Ustilago maydis: hifavég egy alapszöveti sejtben. (Mikrofelvétel)
4. ábra
Ustilago m a y d i s ; hifa a szár szállítószövetében. (Mikrofelvétel)
6. Víztelenítés és átderítés karbol-benzol oldatban (3 rész benzolban 1 rész kristályos karbolsavat oldunk fel). Ebben az oldatban befejeződik a metszetek differenciálása, egyben az eredeti kékes színük is visszatér.
7. A karbolsavat 4—5-ször cserélt benzollal alaposan kimossuk, m a j d kanadabalzsam segítségével állandósítjuk a készítményt.
A festés e r e d m é n y e k é n t — az általában halványan festődő alapszö- veti háttérből — a gombafonalak éles kékesvörös festődéssel tűnnek elő (2—4. felvételek). A nem fásodott részek kék, a fásodott sejtfalak vörös árnyalatokban színeződnek. A gombafonalak festhetősége az egyes gom- bacsoportok, sőt f a j o k esetében némileg eltérő. A preparátumok festése 10—15 éven túl sem változik számottevően.
Számos g o m b a f a j fonalait, egyben a sejtfalak cellulóz és lignin- anyagának a gomba kártétel alatti átalakulását szemléletesen feltünteti az alciánkék — auramin — safranin hisztokémiai jellegű festőeljárás is, melyet a Mikroskopie с. folyóiratban közöltünk az 1961. év folyamán.
ÖSSZEFOGLALÁS
A dolgozat a gombahifák kimutatására ez ideig felhasznált — kor- látozott teljesítőképességű — mikrotechnikai módszereket értékeli, m a j d a Cartwright-féle eljárás módosításának lehetőségét ismerteti. C a r l -
. 4 8 4
w r i g h t progresszív festőmódszerébe beillesztett — 1%-os nátronlúggal végzett — differenciálás eredményeképpen a szerző a gombafonalak éles festődését éri el az alapszövet mérsékelt színeződése mellett.
A dolgozat utal a gombahifák hisztokémiai jellegű kimutatásának lehetőségére is.
IRODALOM
1. Cartwright, K. St. G.: A satisfactory method of staining f u n g a l mycelium in wood sections. Annals of Botany. 1926. 43, 412.
2. Harms, H.: H a n d b u c h der F a r d s t o f f e f ü r die Mikroskopie. K a m p - L i n t f o r t , 1965.
3. Maácz, G. J.: Vágás. E.: A new method for staining, of lignified cell-walls.
Mikroskopie. 1961. 16, 40—43.
4. Maácz, G. J.; Vágás, E.: Investigation of s t r u c t u r e - density of the lignified p l a n t cell wall with triple staining. Mikroskopie. 1964. 19, 102—6.
5. Marcus, O.: Z u m Nachweis von Pilzhyphen in pflanzlichen Geweben. Mikrokosmos.
1951. 40, 268.
6. Pianese, G.: Beitrag zur Histologie u n d Ätiologie des Carcinoms. Beitr. z. P a t h . Suppl. I. 1896. 58. 193.
7. Vágás, E.; Maácz, G. J.: A quick method for staining the h y p h a e of Ustilago maydis. Stain Technology. 1960. 15, 129.
8. Wilier, К. H.: A n f a r b u n g von parasitischen Pilzen im Gewebe h ö h e r e r Pflanzen.
Z. f ü r wiss. Mikr. 1970, 70, 49—57.
A mikrofelvételek a szerző p r e p a r á t u m a i r ó l készültek.
. 4 8 5
