Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und Regulation der Radikalenbildung durch Angiotensin Rezeptoren

Volltext

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der Ruhr-Universität Bochum

Kommisarischer Direktor : Prof. Dr. med. Voigtmann

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Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und Regulation der Radikalenbildung durch Angiotensin

Rezeptoren

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Susanne Stemmler

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Abstract Stemmler Susanne

Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und Regulation der Radikalenbildung durch Angiotensin Rezeptoren

Reaktive Sauerstoffradikale (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der intrazellulären Signaltransduktion. Hohe ROS-Konzentrationen führen aber zu einer Schädigung von Proteinen, Enzymen oder Transkriptionsfaktoren und damit zu einer Störung der regulären Zellfunktion bei einer Reihe von Erkrankungen. Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) haben häufig eine arterielle Hypertonie und eine erhöhte kardiovaskuläre Mortalität. In der Untersuchung sollte jetzt geprüft werden, ob Veränderungen von intrazellulären ROS bei Patienten mit OSAS vorliegen und welchen Einfluß Angiotensin AT-2-Rezeptoren bei der Bildung der ROS haben.

Die ROS-Konzentration wurden fluoreszenzspektrophotometrisch in den mononukleären Leukozyten bestimmt. Innerhalb von 30 Minuten kam es zu einem spontanen Anstieg von intrazellulären ROS in den mononukleären Leukozyten von Patienten mit OSAS um 2.8±0.4 (MW ± SEM, n=13) und von den gesunden Kontrollpersonen um 3.9±0.6 (n=18). Die Stimulation der Zellen mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) führte zu einem Anstieg von intrazellulären ROS bei Patienten mit OSAS um 10.4±1.6 und bei den gesunden Kontrollpersonen um 13.8±1.5. Die Vorgabe des Singlet-oxygen-scavengers Natriumazid, des Peroxynitrit-scavengers Ebselen und des ACE-Hemmers Captopril führte zu einer signifikanten Verminderung der PMA-stimulierten intrazellulären ROS-Bildung (jeweils p<0.01). Die Angiotensin AT-2-Rezeptor-agonisten und der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist führten ebenfalls zu einer signifikanten Verminderung der PMA-stimulierten intrazellulären ROS-Bildung (jeweils p<0.05), der Angiotensin AT-1-Rezeptoragonist und der Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonist zeigten jedoch keine Wirkung.

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Dekan : Professor Dr. med. G. Muhr Referent : PD Dr. med. M. Tepel

Koreferent : Frau Professor Dr. med. M. Schläfke

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1. Schlaf-Apnoe Syndrom 1

1.2. Sauerstoffradikale und Calcium 3

1.3. Prinzip der Fluoreszenz und Durchführung der Messung 5

1.4. Fragestellung der Arbeit 8

2. Materialen und Methoden 9

2.1. Patienten und Kontrollpersonen 10

2.2. Blutentnahme, Präparation von mononukleären Leukozyten und

Versuchsablauf 12

2.2.1. Fluoreszenzmessung von reaktiven Sauerstoffradikalen 13

2.2.2. Fluoreszenzmessung von Calcium 13

2.3. Statistik 15

3. Ergebnisse 16

3.1. Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und bei gesunden Kontrollpersonen 16 3.2. Wirkung von Scavengern und ACE-Hemmern auf die Bildung

reaktiver Sauerstoffradikale 24

3.3. Wirkung am Angiotensinrezeptor 27

3.4. Konzentrationsmessung von Calcium und von reaktive Sauerstoff-radikalen unter Zugabe verschiedener Sauerstoffradikalstimulatoren

(PMA und Thapsigargin) 32

4. Diskussion 34

5. Zusammenfassung 39

6. Literaturverzeichnis 41

7. Danksagung 48

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Abbildungsverzeichnis

Abb.1 : Schematische Darstellung der Entstehung von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS)

Abb.2 : Entstehung der Fluoreszenz/Emission Abb.3 : Aufbau eines Fluorometers

Abb.4 : Präparation der mononukleären Leukozyten

Abb.5 : Fluoreszenz-Spektrum des radikalsensitiven Farbstoffes DCF-DA Abb.6 : Konzentrationsmessung von Natriumazid

Abb.7 : Konzentrationsmessung von Captopril

Abb.8 : Konzentrationsanstieg von ROS über 60 Minuten

Abb.9 : spontane reaktive Sauerstoffradikalbildung von OSAS-Patienten im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe

Abb.10 : PMA induzierte ROS-Bildung von OSAS-Patienten im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe

Abb.11 : Wirkung von verschiedenen Substanzen/Scavengern auf die ROS-Bildung bei Patienten mit OSAS

Abb.12 : Mechanismus der ROS-Bildung über die Angiotensin AT-1 und AT-2-Rezeptoren

Abb.13 : Wirkung eines Stickstoffmonoxiddonors (SNAP) auf die

ROS-Entwicklung unter dem Einfluß verschiedener Radikalenstimulatoren Abb.14 : Mechanismus der ROS-Bildung/Calciumionenkonzentration

Tabellenverzeichnis

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1. Einleitung

1.1. Schlaf-Apnoe-Syndrom

Die Prävalenz des obstruktiven Schlaf-Apnoe-Syndroms (OSAS) liegt bei ca. 1-2% der Bevölkerung. Hauptsächlich sind Männer zwischen dem 40-60 Lebensjahr betroffen. Bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom kommt es zu schlafbezogenen Atempausen, die länger als 10 Sekunden andauern. Der Schlafapnoe-Index (AHI) gibt die Anzahl der Atempausen pro Stunde an. Dabei sind Werte über 10/h pathologisch.

Zur Diagnosefindung ist die Anamnese (starkes Schnarchen, Kopfschmerzen, Abgeschlagenheit, Tagesmüdigkeit mit Einschlafneigung und Leistungsknick) einschließlich der Partnerbefragung von großer Bedeutung. Meßtechnisch wird als erstes ein Screening mittels ambulantem Schlafmonitoring durchgeführt und bei Hinweisen auf ein obstruktives Schlaf-Apnoe-Syndrom wird noch zusätzlich eine polysomnographische Langzeitmessung im Schlaflabor herangezogen. Während der Atempausen steigt der Streßfaktor bei den Patienten an. Dadurch werden vermehrt Hormone, z.B. Katecholamine, ausgeschüttet, welche zu einer Erhöhung des Energieumsatzes führen. Bei Oxidationsreaktionen, z.B. bei der Gewinnung von ATP, fallen häufig reaktive Sauerstoffradikale (ROS) an. Freie Radikale verursachen Schäden an biologischen Strukturen, so z.B. bei Lipiden, Proteinen, Kohlenhydraten oder der DNS. Bei den Lipiden kann es durch die Einwirkung der reaktiven Sauerstoffradikale zu Peroxidationen ungesättigter Fettsäuren in Zellmembranen kommen. Bei den Proteinen führt dies zu einer oxidativen Denaturierung, bei den Kohlenhydraten kommt es zu einer Spaltung (Depolymerisation) von Polysaccharieden und bei der DNS führt dies zu Hydroxylierungen von Basen, Strangabbrüchen und Quervernetzungen.

Daher werden verschiedene klinische Zustandsbilder mit freien Sauerstoff-radikalen als zusätzliches mitverursachendes Agens in Zusammenhang gebracht, wie z.B. bei Arthritiden, Herzkreislauf-Krankheiten (Herzinfarkt), Lungenödem, Schock sowie Diabetes mellitus.

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Patienten meist noch zusätzliche Risikofaktoren für z.B. Herzinfarkt (Diabetes mellitus, Adipositas, Hypertonie, Rauchen) aufweisen.

Durch die Gewinnung von mononukleären Leukozyten aus dem Blut von Patienten, kann selektiv in vitro die Sauerstoffradikalenfreisetzung stimuliert und mittels fluoreszenzspektrophotometrischer Messung bestimmt werden. In einem zweiten Arbeitsgang kann man unter Zugabe verschiedener Substanzen (z.B. von Scavengern oder bestimmten Medikamenten) versuchen, die gebildeten Sauerstoffradikale zu vermindern.

In anderen Studien wurde bereits gezeigt, daß biologische Scavenger vor Radikalen schützen. So wurde z.B. von Ballmer (Ballmer et al., 1988) beschrieben, daß Allopurinol durch Blockierung der Xanthinoxidasereaktion die Bildung von Superoxidradikalanionen (O2-) und von Wasserstoffperoxid (H2O2)

verhindert. Im Tierversuch wurden die postischämisch entstandenen Radikale vermindert.

Aber auch der Körper selbst verfügt über einige Enzyme, die die reaktiven Sauerstoffradikalen vermindern können, wie die Superoxiddismutase (SOD), die Catalase und die Glutathionperoxidase. Treten öfters hypoxische Phasen auf, kann dies laut Duan (Duan et al., 1998) zu einer Toleranzentwicklung des Körpers gegenüber diesen Phasen führen, wobei die reaktiven Sauerstoff-radikale (ROS) und ihre spezifischen Scavengerenzyme eine Rolle spielen.

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1.2. Sauerstoffradikale und Calcium

Unter " Radikal " versteht man eine atomare oder molekulare Einheit, die ein oder mehrere ungepaarte Elektronen auf der äußeren Hülle besitzen. Radikale können andere Moleküle durch Entzug eines Elektrons oxidativ schädigen. So kann z.B. die DNA verändert werden.

Reaktive Sauerstoffradikale mit potentiell schädigender Wirkung sind das Superoxidradikal Anion (O2-), das Hydroxylradikal (OH⋅), das

Wasserstoffperoxid-molekül (H2O2), verschiedene Superoxidradikale (RO⋅, R = Fettsäure) und der

Singulettsauerstoff (1/2 O2).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entstehung freier Sauerstoffradikale und des Wirkortes der Enzyme, welche eine "Scavenger" Funktion haben, von Pfaffendorf aus " Sauerstoffradikale und Arteriosklerose "

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die krebserregende, aber auch für die therapeutisch genutzte zellzerstörende Wirkung energiereicher Strahlung und einiger Zytostatika verantwortlich. So bilden z.B. die Zytostatika Bleomycin und Doxorubicin in vitro und in vivo spontan Radikale. Durch die energiereiche Strahlung entstehen z.B. durch homolytische Spaltung von Wasser ein Hydrogen- und ein Hydroxydradikal.

Andererseits nutzt der Körper aber auch die freien Radikale, so z.B. zur Abwehr von Krankheitserregern. Makrophagen bilden während der Phagozytose große Mengen an Superoxidradikal Anionen. Die Bedeutung für das menschliche Leben wurde erst in den letzten Jahren im vollen Umfang erfaßt.

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1.3. Prinzip der Fluoreszenz und Durchführung der Messung

Manche Moleküle können Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren. Dabei wird ein Außenelektron eines bestimmten Atoms in ein höheres Energieniveau angehoben. Kehrt dieses Elektron wieder auf sein Ausgangs-niveau zurück, gibt es einen Teil der Energie in Wärme und einen Teil in Licht längerer Wellenlänge (geringere Frequenz) und somit geringerer Energie ab (Emission/Fluoreszenz). Dies geschieht nach außerordentlich kurzer Zeit.

Abbildung 2: Entstehung der Fluoreszenzstrahlung / Emission, von Kaiser und Henning aus physikalischer Chemie

A-B : Ein Elektron absorbiert Energie und geht damit vom Zustand A nach B über

B-C : Die aufgenommene Energie wird schnell wieder abgegeben. Dies geschieht teilweise als Wärme

C-D : und teilweise als energieärmeres Licht

Die Fluoreszenz wird mit bestimmten Meßinstrumenten (z.B. Fluoreszenz-Spektrophotometer) nachgehalten. Je mehr Moleküle eines fluoreszierenden Stoffes in einer Probe vorhanden sind, um so mehr Licht wird absorbiert und um so höher ist daraufhin die Emission/Fluoreszenz. Die Intensität der Fluoreszenz kann dann umgerechnet werden und damit die Konzentration der jeweiligen Stoffe ermittelt werden.

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1.4. Fragestellung der Arbeit

Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom weisen vermehrte, längere nächtliche Atempausen auf. Dabei stellt sich die Frage: Kommt es durch diesen Sachverhalt zu einer vermehrten oxidativen Schädigung des Gewebes durch erhöhte reaktive Sauerstoffradikalenbildung?

In der Arbeit wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:

1. Bestehen Veränderungen der Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in mononukleären Leukozyten bei Patienten mit obstruktiver Schlaf-Apnoe-Syndrom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen?

2. Wie verändern ROS-Scavenger oder Angiotensin Converting Enzym Inhibitoren die Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen in mononu-kleären Leukozyten?

3. Über welchen Mechanismus führen Angiotensin Converting Enzym

Inhibitoren zu einer Hemmung der ROS-Bildung in mononukleären Leukozyten?

4. Besteht ein Zusammenhang zwischen der Bildung von reaktiven

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2. Materialien und Methoden

Die reaktive Sauerstoffradikalenbildung (ROS) wurde fluoreszenzspektrophoto-metisch mit dem Fluoreszenz-Spektrometer F 2000 in den mononukleären Leukozyten von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) und von gesunden Kontrollpersonen gemessen. Die Untersuchungen wurde bei 13 Patienten mit OSAS und bei 18 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt.

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2.1. Patienten und Kontrollpersonen

Es wurden insgesamt 13 Patienten im Alter von 32 bis 68 Jahren mit gesichertem obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom untersucht. Durch eine Polysomnographie-untersuchung im Schlaflabor wurde die Diagnose bestätigt. Zur klinischen und biochemischen Charakterisierung der Patienten wurden verschiedene Daten z.B. Lebensalter, Blutdruck/arterielle Hypertonie, Puls, einige Laborwerte und der Bodymass-Index (BMI) gemessen, statistisch ausgewertet und gegen die Daten der gesunden Kontrollpersonen in einer Tabelle eingetragen (Tabelle1). Die Daten sind Durchschnittswerte der einzelnen Parameter für das jeweilige Kollektiv.

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Tabelle1: Klinische und biochemische Daten von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen

Patienten mit OSAS Gesunde Kontrollperson

Alter (Jahre) 53,8±10,0 51,1±20,6 Anzahl 13 18 Bodymass-Index (kg/m2) 33,2±5,0 23,2±3,7 Puls (Schläge/Minute) 75±9,3 85±22,8 Blutdruck Systolisch (mmHg) * 128±17,6 130±16,9 Diastolisch (mmHg)* 76±9,2 75±10,4 Leukozyten (g/l) 5,7±1,0 9,4±3,7 Hämoglobin (g/dl) 15,4±0,9 13,5±2,1 Thrombozyten (g/l) 222±37,0 263±66,3 Kreatinin (mg/dl) 0,84±0,1 1,91±1,7 Harnstoff (mg/dl) 37±4,3 61±32,8 Calcium (mmol/l) 2,30±0,1 2,39±0,2 Kalium (mmol/l) 4,1±0,4 4,23±0,5 Natrium (mmol/l) 141±2,5 138±3,0 Hypertonie (%) 53,8 16,7 Koronare Herzkrankheit (%) 23,1 11 Diabetes mellitus (%) 8,0 33 Raucher (%) 23,1 11

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2.2. Blutentnahme, Präparation von mononukleären Leukozyten und Versuchsablauf

Es wurden jeweils 15-20ml Vollblut bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) sowie bei gesunden Kontrollpersonen entnommen und zur Gerinnungshemmung mit 1ml Heparin (Heparin-Natrium von Merck, Darmstadt

)

versetzt. Zur Präparation der mononukleären Leukozyten wurde das Vollblut 15 Minuten bei 2000U/min mit der Zentrifuge von Heraeus (Heraeus Holding GmbH) zentrifugiert , das überstehende Plasma verworfen und die Zellen 1:1 mit HBSS-Lösung (Hund´s balanced salt sodium mit: Natriumchlorid, 7,94g/L, Kaliumchlorid, 0,40g/L, Kaliumdihydrogenphosphat, 0,06g/L, D-Glucose, 1,0g/L, Calciumchlorid, 0,147g/L, Hepes, 2,383g/L, Natriumdihydrogenphosphat, 0,06g/L und Magnesiumchlorid, 0,203g/L bei einem pH-Wert von 7,40) vermischt. Nun wurde jeweils 3ml Histopaque (Sigma-Aldrich Company, Taufbeuren) in einem Reagenzglas vorgelegt, 5ml der Blut/HBSS-Mischung darübergeschichtet und erneut 15 Minuten bei 2000U/min. zentrifugiert. Dadurch wurden die Leukozyten von den übrigen Blutzellen getrennt und konnten mittels einer Pipette isoliert werden. Blutprobe ↓ +Heparin ↓ +Zentrifugation Blutzellen ↓ +HBSS 1:1 ↓ +Histopaque ↓ +Zentrifugation mononukleäre Leukozyten

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2.2.1. Fluoreszenzmessung von reaktiven Sauerstoffradikalen

Nach dem Waschen der mononukleären Leukozyten wurden diese mit 2ml HBSS-Lösung aufsuspendiert, mit 20µl DCF-DA (2.7.-Dichlorofluorescein-diacetat) gefärbt und für 20 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation bei 2000U/min für 5 Minuten und Isolation der mononukleären Leukozyten wurden diese mit 12ml HBSS versetzt, jeweils 1ml der Suspension in eine 10x10mm Quarzglasküvette von der Firma Helma gegeben, die zumessende Substanz zugegeben und nach 0, 30 und 60 Minuten wurde die Probe fluoreszenzspektrophotometrisch (Fluoreszenz-Spektrometer F 2000 Hitachi Ltd. Tokyo, Japan) in einem Intervall von 2 Hz über 60 Sekunden bei einer Exzitationswellenlänge von 488nm und einer Emissionswellenlänge von 534nm gemessen.

2.2.2. Fluoreszenzmessung von Calcium

Bei dieser Messung wurden die mononukleären Leukozyten nach dem Waschen mit 2ml HBSS-Lösung aufsuspendiert und mit 20µl des Farbstoffes Fura-2 ( 1-[2- (5-Carboxyoxazol-2-yl-6-aminobenzofuran-5-oxyl]-2´amino-5´-methylphenoxy-ethan-N,N,N´,N´-tetraessigsäure ) und 10µl Pluronic versetzt und für 45 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach der Zentrifugation für 5 Minuten bei 2000U/min und der Isolation der mononukleären Leukozyten wurde das Reagenzglas mit 12ml HBSS aufgefüllt, je 1ml dieser Suspension in eine 10x10mm Quarzglasküvette gegeben und über 400 Sekunden mit einem Intervall von 0,5 Sekunden bei den beiden wechselden Exzitationswellenlänge von 340 und 380nm und einer Emissionswellenlänge von 510nm gemessen.

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Abbildung 5: Fluoreszenz-Spektrum des Radikal-sensitiven Farbstoffes 2.7-Dichlorofluorescein. Die Fluoreszenz von DCF wurde bei 534nm mit einer Exzitationswellenlänge von 400nm bis 520nm gemessen nach Zugabe von steigenden Konzentrationen von Wasserstoffperoxid. Die eingefügte Abbildung zeigt die Fluoreszenz bei 534nm bei einer Exzitationswellenlänge von 488nm in Abhängigkeit der Wasserstoffperoxid-Konzentration.

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2.3. Statistik

Zum Vergleich der Ergebnisse wurde der U-Test von Wilcoxon, Mann und Whitney benutzt. Dieser Test für unverbundene Stichproben ist verteilungs-unabhängig. Man bringt die (m+n) Stichprobenwerte in einer gemeinsamen aufsteigenden Rangfolge. Die Summe der Rangzahlen von Stichprobe 1 sei R1, die von Stichprobe 2 sei R2.

U1=mxn+0,5xmx(m+1)-R1

U2=mxn+0,5xnx(n+1)-R2

U1+U2=mxn

Die Nullhypothese wird verworfen, wenn U als der kleinere Wert von U1 und U2 kleiner oder gleich dem tabellierten kritischen Wert U (m,n;a) ist.

Die statistische Auswertung erfolgte mit der Computer Software Graph Pad Prism Version 3,0 (Graph Pad, San Diego, USA).

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3. Ergebnisse

Zum einen wurde in dieser Arbeit untersucht, ob ein Unterschied in der reaktiven Sauerstoffradikalenbildung (ROS) von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) und einer gesunden Kontrollgruppe besteht. Zum anderen wurden verschiedene Substanzen getestet, die die Sauerstoffradikalenbildung hemmen oder fördern könnten, um so einen möglichen Reaktionsmechanismus und/oder -weg herauszufinden (insbesondere den Reaktionsmechanismus über den Angiotensin Subtyp AT-1- und AT-2-Rezeptor) und als dritte Untersuchung wurde der Calciumgehalt in den mononukleären Leukozyten gemessen.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in mehreren Abbildungen gegliedert. Bei den einzelnen Messungen wurde die gemessene Fluoreszenz meist zu einem Kontrollwert in Relation gesetzt (entweder zu den mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) stimulierten mononukleären Leukozyten oder zu der spontanen reaktiven Sauerstoffradikalen(ROS)-Entwicklung [ohne Stimulation]). Dabei wurde der Kontrollwert als 100% gewertet und die jeweiligen Ergebnisse im Verhältnis dazu gesehen.

3.1. Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und bei gesunden Kontrollpersonen

Um die benötigte Konzentration zur maximalen Hemmung der reaktiven Sauerstoffradikalenbildung (ROS) in mononukleären Leukozyten herauszufinden, wurden den Proben unterschiedliche Konzentrationen der jeweiligen Substanz, hier als Beispiel Captopril und Natriumazid (NaN3), zugegeben. Es wurden

jeweils eine Kontrollmessung ohne Substanzzugabe und 6 Messungen mit steigender Konzentration unter Stimulation mit dem Radikalenbildner Phorbol-myristat-acetat (PMA) durchgeführt.

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Abbildung 7 zeigt die Messung mit Captopril (n=6). Es wurden Endkonzentra-tionen von 0,1 bis 10,0µmol/L eingesetzt. Die maximale Hemmung der ROS-Bildung nach Stimulierung mit 10µmol/L PMA wurde bei einer Endkonzentration von ca. 5,0µmol/L erreicht. Die PMA induzierte ROS-Bildung ließ sich auf 65,4%±4,6% nach 60 Minuten vermindern.

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Abbildung 6: Konzentrationsabhängigikeit der Verminderung der Phorbol-myristat-acetat (PMA) induzierten Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in mononukleären Leukozyten durch Natriumazid (n=6). Die Messung von ROS in mononukleären Leukozyten erfolgte fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA). Die Veränderungen der Fluoreszenz nach Zugabe von 10 µmol/L PMA über 60 Minuten wurden gemessen und als 100% dargestellt. Die Veränderungen der Fluoreszenz nach Zugabe von 10 µmol/L PMA bei Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von Natriumazid (NaN3) sind dargestellt.

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Abbildung 7: Konzentrationsabhängigkeit der Verminderung der Phorbol-myristat-acetat (PMA) induzierten Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in mononukleären Leukozyten durch Captopril (n=6). Die Messung von ROS in mononukleären Leukozyten erfolgte fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA). Die Veränderungen der Fluoreszenz nach Zugabe von 10µmol/L PMA über 60 Minuten wurden gemessen und als 100% dargestellt. Die Veränderungen der Fluoreszenz nach Zugabe von 10µmol/L PMA bei Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von Captopril sind dargestellt.

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Die fluoreszenzspektrophotometrische Messung von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und von den gesunden Kontrollpersonen wurde jeweils über 60 Minuten beobachtet. Dabei wurde jede Probe 3 Mal (nach 0, 30, 60 Minuten) für je 60 Sekunden in das Fluoreszenzspektrophotophotometer eingebracht und die gemessene Fluoreszenz gemittelt. Dabei konnte ein kontinuierlicher Anstieg der reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) über 60 Minuten nachgewiesen werden.

In Abbildung 8 ist die kontinuierliche ROS-Entstehung wahlweise für die Substanzen Phorbol-myristat-acetat (PMA), Captopril plus PMA und Natriumazid (NaN3) plus PMA dargestellt (n=13). Es wurde jeweils eine Endkonzentration von

10µmol/L PMA und Captopril sowie von 1µmol/L Natriumazid eingesetzt.

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Abbildung 8: Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in mononukleären Leukozyten (n=13). Die ROS Bildung wurde nach Stimulation mit 10 µmol/L Phorbol-myristat-acetat (PMA) fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA) bestimmt. Die Originalabbildung zeigt den typischen Verlauf bei Anwesenheit von PMA, PMA plus Natriumazid (NaN3) und PMA plus Captopril.

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Abbildung 10: Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in mononukleären Leukozyten. Die ROS-Bildung wurde nach Stimulation mit 10µmol/L Phorbol-myristat-acetat (PMA) fluoreszenzspektrophotometrisch in einem Zeitraum von 60 Minuten mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA) bestimmt. Die Abbildung zeigt die ROS-Bildung bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS, n=13) im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe (Control, n=18). Der Ausgangswert der ROS-Konzentration ist mit 100% angesetzt.

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3.2. Wirkung von Scavengern und ACE-Hemmern auf die Bildung reaktiver Sauerstoffradikale

Zur Überprüfung der gefundenen Werte sowie zur fraglichen Unterscheidung von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom gegenüber den gesunden Kontrollpersonen in der Bildung von unterschiedlichen reaktiven Sauerstoffradikalen wurden einige Substanzen den Proben zugesetzt, die bekanntermaßen die Bildung bestimmter Sauerstoffradikalengruppen unterdrücken.

Die Superoxiddismutase (SOD) führt zu einer verminderten Konzentration des Superoxidradikal Anions (O2-), die Catalase führt zu einer verminderten

Konzentration des Wasserstoffperoxidmoleküls (H2O2), Natriumazid (NaN3) führt

zu einer verminderten Konzentration von Singulettsauerstoff (1/2 O2) und

Ebselen führt zu einer verminderten Konzentration von Peroxinitrit (ONOO-).

Ro-32 (2-[8 [(Dimethylamino)methyl]-6,7,8,9-tetrahydropyrido[1,2-a]indol-3-yl)-3-(methyl-1H-indol-3yl)maleimide, HCl) wurde als Hemmstoff der Protein Kinase C und Tyrphostin als Hemmstoff der Tyrphostin Kinase eingesetzt.

Außerdem wurde bei dem Vergleich von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und von gesunden Kontrollpersonen noch die als Medikamente verwendeten Angiotensin Converting Enzym Hemmer (ACE-Hemmer) Captopril und Ramiprilat sowie der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist Losartan (mit Exp3174 als pharmakologisch aktivem Metaboliten) mit untersucht.

In Abbildung 11 und teilweise in Abbildung 12 sind die jeweiligen Gruppen nach Zugabe einiger Scavenger-Substanzen und einiger Medikamente dargestellt. Hier konnte sowohl in der Gruppe der Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS), Abbildung 11 (n=13), als auch in der Gruppe der gesunden Kontrollpersonen, Abbildung 12 (n=6-18), eine Verringerung der reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) 60 Minuten nach Zugabe von Dimethylsulfoxid (DMSO), Natriumazid (NaN3) , Ebselen, des Protein Kinase Inhibitors Tyrphostin,

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nachgewiesen werden. Da Exp3174 kaum wasserlöslich ist, wurde DMSO als Lösungsmittel verwendet und das Ergebnis in Relation zu DMSO gewertet. Bei den Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) zeigte sich eine Verminderung der reaktiven Sauerstoffradikalenkonzentration (ROS) nach Zugabe von DMSO auf 48,3%±3,0%, von NaN3 auf 29,3%±3,1%, von Ebselen

auf 54,1%±3,7%, von Tyrphostin auf 60,8%±4,5%, von Ro-32 auf 26,4%±4,1%, von Captopril auf 65,4%±4,6%, von Ramiprilat auf 78,5%±5,4% und von Exp3174 auf 53,0%±10,6% (28,7%±10,6%) in Bezug auf den Kontrollwert (jeweils p< 0,02).

Bei den gesunden Kontrollpersonen ging die ROS-Konzentration nach Zugabe von DMSO auf 49,2%±4,5%, von NaN3 auf 25,1%±2,3%, von Ebselen auf

55,0%±4,3%, von Tyrphostin auf 59,2%±5,8%, von Ro-32 auf 20,3%±3,1%, von Captopril auf 67,2%±5,6%, von Ramiprilat auf 71,7%±3,6% und von Exp3174 auf 63,0%±5,3% (31,0%±5,3%) in Bezug auf den Kontrollwert zurück (jeweils p<0.02).

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Abbildung 11: Wirkung des Superoxid Anion Scavengers Superoxid dismutase (SOD), Hydrogenperoxid Scavengers Catalase, Dimethylsulfoxid (DMSO), Natriumazid (NaN3), Peroxinitrit-Savengers Ebselen, Tyrphostin Kinase Inhibitors

Tyrphostin, Protein Kinase C Inhibitors RO32, den Angiotensin Converting Enzym Inhibitoren Captopril und Ramiprilat sowie des Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 auf den durch Phorbol-myristat-acetat (PMA) induzierten Anstieg von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in mononukleären Leukozyten (n=13). Die Messung von ROS in mononukleären Leukozyten erfolgte fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA). Die Veränderungen der Fluoreszenz nach Zugabe von 10 µmol/L PMA wurde über 60 Minuten gemessen und alleiniges PMA als 100 % dargestellt.*** p<0.01 im Vergleich zu PMA.

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3.3. Wirkung am Angiotensinrezeptor

In einer weiteren Meßreihe wurde der Wirkungsmechanismus der reaktiven Sauerstoffradikalenbildung und -hemmung in den mononukleären Leukozyten, insbesondere die Wirkung an den Angiotensinrezeptoren (Subtyp AT-1/AT-2), genauer untersucht. Dabei wurde das Blut gesunder Kontrollpersonen verwendet. Da in der vorherigen Meßreihe bereits die ACE-Hemmer Captopril und Ramiprilat und der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist Exp3174 eingesetzt wurden, kamen nun noch die Angiotensin AT-2-Rezeptoragonisten CGP42112 und Pyrrolidin-dithiocarbamat Ammonium (PDTC), der Angiotensin AT-1-Rezeptoragonist Angiotensin l, der Angiotensin AT-1- und AT-2-Rezeptoragonist Angiotensin ll, der Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonist PD123319, der Calciumantagonist Verapamil sowie ein weiterer ACE-Hemmer, Lisinopril, hinzu. Wie in Abbildung 12 dargestellt, ließ sich hierbei zusätzlich zu den obengenannten Substanzen, eine signifikante Verminderung der reaktiven Sauerstoffradikalenkonzentration (ROS) bei Stimulation mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) bei dem Calciumantagonisten Verapamil auf 70,4%±4,5%, bei dem Angiotensin AT-1- und AT-2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll auf 82,6%±3,7% und bei dem Angiotensin AT-2-Rezeptoragonisten CGP42112 auf 75,9%±3,0% feststellen (jeweils p=0,03).

(34)

Abbildung 12: Die Wirkung der Angiotensin Converting Enzym Inhibitoren Captopril, Ramiprilat und Lisinopril, des Calciumantagonisten Verapamil, des AT-1- und AT-2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll, den AT-AT-1-Rezeptoragonisten Angiotensin1-7 und Angiotensin l, der AT-2-Agonisten CGP42112 und PDTC, des AT-2-Rezeptorantagonisten PD123319, des AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 und Dimethylsulfoxid (DMSO) auf den durch Phorbol-myristat-acetat (PMA) induzierten Anstieg reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) in mononukleären Leukozyten (n=6-18). Die Messung von ROS in mononukleären Leukozyten erfolgte fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichloroflu-orescein-diacetat (DCF-DA). Die Veränderung der Fluoreszenz nach Zugabe von 10µmol/L PMA wurde über 60 Minuten gemessen und alleiniges PMA als 100% dargestellt. *p <0,05, ***p <0,01 und +p <0,02 (mit DMSO) im Vergleich zu PMA.

(35)

Wie in bereits erwähnt, erfolgte eine Abnahme der durch Phorbol-myristat-acetat (PMA) induzierten reaktiven Sauerstoffradikalenbildung (ROS) nach Zugabe des Angiotensin 2-Rezeptoragonisten CGP42112, des Angiotensin 1 und AT-2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll sowie des Calciumantagonisten Verapamil. Dies legt die Vermutung nahe, daß die Regulierung der ROS-Entstehung bzw. Hemmung über die AT-1- und/oder AT-2-Rezeptoren erfolgt.

Daraufhin wurden Messungen mit dem Angiotensin AT-1- und AT-2-Rezeptor-agonisten Angiotensin ll ohne Zugabe von Phorbol-myristat-acetat (PMA) durchgeführt (n=13). Dabei wurden steigende Endkonzentrationen von 1,0 bis 10000 µmol/L des AT-1- und AT-2-Rezeptoragonisten eingesetzt. Die alleinige Zugabe von Angiotensin ll führte zu keiner signifikanten Änderung der ROS-Produktion in den mononukleären Leukozyten.

Da Angiotensin ll eine AT-1- und eine AT-2-rezeptoragonistische Wirkung besitzt, wurde bei einigen Messungen der Probe außer Angiotensin ll noch PD123319, ein Angiotensin Rezeptorantagonist, hinzugefügt, um die AT-2-Rezeptorwirkung auszuschalten und die alleinige AT-1-AT-2-Rezeptorwirkung des Angiotensin ll zu testen (n=13). Wie in Abbildung 13 zu sehen ist, wurden hierbei sowohl Messungen mit Stimulation der mononukleären Leukozyten durch Phorbol-myristat-acetat (PMA) als auch ohne Zugabe von PMA durchgeführt. Bei dieser Meßreihe konnte aber keine signifikante Änderung der Konzentration der reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) ermittelt werden. Es zeigte sich eine Verminderung der ROS-Konzentration nach Zugabe von PD123319, Angiotensin ll und PMA auf 90,8%+8,5%.

(36)

Die Untersuchung erfolgte zum einen mit Stimulation von Phorbol-myristat-acetat (PMA) und zum anderen ohne Stimulation. Da SNAP nicht ausreichend in Wasser löslich ist, wurde Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsmittel verwendet. Dabei zeigte sich bei beiden Meßreihen eine signifikante Erhöhung der ROS-Freisetzung gegenüber dem Kontrollwert.

Bei der ersten Meßreihe (ohne Zugabe von PMA) stieg die ROS-Konzentration auf 102,7%±15,2% gegenüber 50,46%±11% nur mit dem Lösungsmittel DMSO. Die zweite Meßreihe (mit Zugabe von PMA) ergab eine Erhöhung der ROS-Konzentration auf 176,4%±33,9% gegenüber 67,6%±8,9% nur mit dem Lösungsmittel DMSO.

(37)

Abbildung 13: Die Wirkung des Angiotensin AT-1-und AT-2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll in Gegenwart des Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonisten PD123319 (n=13) und des Stickstoff(2)oxid Donors S-Nitroso-N-acetylpenicillin-amin (SNAP, n=7) auf die Konzentration reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) in mononukleären Leukozyten ohne und mit Induktion durch Phorbol-myristat-acetat (PMA). Die Messung von ROS in den mononukleären Leukozyten wurde fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluoroscein-diacetat (DCF-DA) bestimmt. Die Veränderung der Fluoreszenz nach Zugabe von 10µmol/L PMA wurde über 60 Minuten gemessen und alleiniges PMA als 100% dargestellt.

** p < 0,01 im Vergleich zum Kontrollwert.

(38)

3.4. Calciummessung und reaktive Sauerstoffradikalenmessung unter Zugabe verschiedener Sauerstoffradikalenstimulatoren (PMA und Thapsigargin)

Bei dieser Meßreihe wurde die reaktive Sauerstoffradikalenbildung durch zwei verschiedene Stimulatoren ausgelöst. Zum einen durch das bis jetzt verwendete Phorbol-myristat-acetat (PMA) zum anderen durch Thapsigargin. Hierbei sollte geprüft werden, ob unterschiedliche Konzentrationen reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) entstehen. Außerdem wurde die Calciumionenkonzentration nach Zugabe der verschiedenen Sauerstoffradikalenbildner gemessen.

Die Messung mit Thapsigargin erfolgte nach derselben Vorschrift wie die Messung mit Phorbol-myristat-acetat (PMA). Auch hierbei wurden die ACE-Hemmer Captopril und Ramiprilat, der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist EXP3174 und Dimethylsulfoxid (DMSO) jeweils mit einer Endkonzentration von 10µmol/L eingesetzt. Wie bereits in Abbildung 11 beschrieben zeigte sich eine signifikante Verminderung der PMA induzierten reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS)-Konzentration bei den ACE-Hemmern wie auch bei dem Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten. Bei den Messungen mit dem Sauerstoffradikalen-stimulator Thapsigargin konnte, wie in Abbildung 14 (n=6) zu sehen ist, nur eine signifikante Verminderung der ROS-Bildung nach Zugabe des Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 auf 50,3%±7,4% nachgewiesen werden. Bei den anderen Messungen zeigten sich keine signifikanten Veränderungen in der ROS-Konzentration.

(39)

Abbildung 14: Die Wirkung der ACE-Hemmer Captopril und Ramiprilat sowie des Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 und von Dimethylsulfoxid (DMSO) auf den durch Phorbol-myristat-acetat (PMA) bzw. durch Thapsigargin induzierten Anstieg reaktiver Sauerstoffradikale (ROS), Abbildungen oben, (n=6-18) und von der Änderung der Calciumionenkonzentration in mononukleären Leukozyten, Abbildungen unten, (n=6).

Die Messung von ROS in den mononukleären Leukozyten erfolgte fluoreszenz-spektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluoroscein-diacetat (DCF-DA), die Messung der Calciumionenkonzentration erfolgte mit Hilfe des Farbstoffes Fura 2.

Die Veränderungen der Fluoreszenz nach Zugabe von 10µmol/L PMA bzw. von 10µmol/L Thapsigargin wurde über 60 Minuten gemessen und alleiniges PMA/Thapsigargin (Control) als 100% dargestellt.

(40)

4. Diskussion

In dieser Arbeit wurde die Bildung reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) in mononukleären Leukozyten bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) und im Vergleich dazu bei einer gesunden Kontrollgruppe untersucht. Ferner wurden in dieser Arbeit mögliche Reaktionsmechanismen und -wege der reaktiven Sauerstoffradikalen-(ROS)-bildung sowie -hemmung im menschlichen Körper diskutiert. Besondere Aufmerksamkeit galt dabei dem Angiotensin Subtyp AT-1- und AT-2-Rezeptor. Desweiteren wurde auch eine mögliche Veränderung der Calciumkonzentration in den mononukleären Leukozyten untersucht.

In geringer Konzentration sind reaktive Sauerstoffradikale (ROS) Nebenprodukte von physiologischen metabolischen Prozessen in den Zellen, Orie (Orie et al., 1999). Auch spielen sie bei der intrazellulären Signaltransduktion eine Rolle. Bei höheren Konzentrationen werden die ROS jedoch für die Entstehung einer Reihe von Erkrankung mitverantwortlich gemacht.

(41)

Bei der spontanen ROS-Bildung und unter Stimulation mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) konnte kein signifikanter Unterschied im Vergleich zwischen den Patienten mit OSAS und der gesunden Kontrollgruppe nachgewiesen werden.

Nach Zugabe einiger Medikamente, den ACE-Hemmern Captopril bzw. Ramiprilat und dem Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 (Losartan), zu den mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) stimulierten mononukleären Leukozyten konnte in Bezug auf den PMA induzierten Kontrollwert eine signifikante Verminderung der ROS-Bildung nachgewiesen werden. Es konnten jedoch keine Unterschiede zwischen den beiden Untersuchungsgruppen festgestellt werden.

In einer Veröffentlichung von Inagami (Inagami et al., 1998) wurden Nierenzellen unter anderem auf Subtypen des Angiotensinrezeptors untersucht. Dabei wurden 2 Subtypen, der AT-1-Rezeptor und der AT-2-Rezeptor, unterschieden, die eine antagonistische Wirkung zueinander zeigten. Es konnte bewiesen werden, daß die Stimulation von AT-1-Rezeptoren und AT-2-Rezeptoren unterschiedliche Wirkung auf den Blutdruck von Mäusen haben (über AT-1-Rezeptoren wird der Blutdruck gesteigert und über AT-2-Rezeptoren wird der Blutdruck gesenkt), sowie auf die Diurese und Natriurese in Rattennieren (der Angiotensin Rezeptoragonist CGP42112 führt zu einer Supression, der Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonist PD123319 führt zu einer Stimulation und der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist Losartan (Exp 3174) führt nur zu einer gesteigerten Natriurese)

.

(42)

getestet. Dabei zeigte sich nach allen Untersuchungen eine signifikante Verminderung der PMA induzierten ROS-Bildung bei den ACE-Hemmern Captopril und Ramiprilat, bei dem Calciumantagonisten Verapamil, bei dem Angiotensin AT-2-Rezeptoragonisten CGP42112, bei dem Angiotensin AT-1- und AT-2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll und bei dem Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten EXP 3174 sowie eine vermehrte ROS-Bildung bei dem Angiotensin AT-1-Rezeptoragonisten Angiotensin l.

Eine alleinige Gabe von Angiotensin ll (AT-1-und AT-2-Rezeptoragonist), ohne PMA Stimulation, in ansteigender Konzentration sowie mit dem Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonisten PD 123319 in Kombination (alleinige AT-1-Rezeptorwirkung) brachte dagegen keine signifikante Änderung der ROS-Konzentration gegenüber dem Kontrollwert.

In einer weiteren Meßreihe erfolgte eine reaktive Sauerstoffradikalenmessung (ROS) in den mononukleären Leukozyten mit dem Radikalenstimulator Thapsigargin im Vergleich zu Phorbol-myristat-acetat (PMA) sowie eine Messung der intrazelluläre Calciumionenkonzentration (je eine Meßreihe mit PMA und eine mit Thapsigargin). In einem Artikel von Tepel (Tepel et al, 1999) wurde die Aktivität des Na+/H+-Gegentransportsystems bei Patienten mit obstruktivem

Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe und der nächtliche Verlauf (bei den Patienten) gemessen. Bei den Patienten mit OSAS kommt es zu Hypoxiezuständen mit Hypercapnie während der Atempausen. In den Zellen kommt es zu einer anaeroben Stoffwechsellage wobei Milchsäure entsteht. So fallen laufend Protonen in den Zellen an. Dadurch wird der intrazelluläre pH-Wert verändert und bestimmte intracelluläre und extracelluläre Puffersysteme beeinflußt. Durch das Na+/H+ -Gegentransport-system werden H+-Ionen aus der Zelle transportiert und somit der pH-Wert reguliert.

(43)

In anderen Studien wurde bereits gezeigt, daß reaktive Sauerstoffmetabolite den durch Calcium übertragenen Zellmetabolismus und spezifische membran-gebundene Regulationsschritte in der Calciumsignalkaskade beeinträchtigen. Thapsigargin erhöht die cytoplasmatische Calciumionenkonzentration laut Thastrup (Tharsup et al., 1999) indem es die Wiederaufnahme der Calciumionen in die zellulären Speicher hemmt. Des weiteren beschreiben Nofer (Nofer et al., 1999) in einer Studie, daß das Na+/Ca²+-Gegentransportsystem in menschlichen Lymphozyten durch Thapsigargin induziert wird. Dieses System spielt eine große Rolle in der Regulation des Gleichgewichtssystems der Elektrolyte in den Zellen. Takeyama (Takeyama et al., 1993) zeigen in einer Arbeit, daß die oxidative Schädigung in Mitochondrien mit der Öffnung von nicht-spezifischen Calciumkanälen zusammenhängt.

Auch in dieser Meßreihe wurden den Proben verschiedene Medikamente, die ACE-Hemmer Captopril und Ramiprilat und der Angiotensin AT-1-Rezeptor-antagonist Exp3174, hinzugesetzt. Bei der thapsigargininduzierten ROS-Bildung konnte eine signifikante Minderung der ROS-Konzentration nach Zugabe des Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 festgestellt werden. Bei der Messung der intrazellulären Calciumionenkonzentration zeigte sich auch bei dem Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 eine signifikante Änderung nach Stimulation mit PMA sowie mit Thapsigargin.

Im Rahmen der hier durchgeführten Untersuchung konnte mit Hilfe der fluoreszenzspektrophotometrischen Messungen gezeigt werden, daß die Konzentration der reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) in mononukleären Leukozyten durch Zugabe verschiedener Medikamente signifikant gemindert werden kann.

(44)

Zusammenfassend, mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen und Befunden in der Literatur, läßt sich für einige Erkrankungen, z.B. Diabetes mellitus und Niereninsuffizienz, eine Erhöhung der reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in den mononukleären Leukozyten feststellen. Jedoch gilt dies nicht für Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom.

(45)

5. Zusammenfassung

Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und Regulation der Radikalenbildung durch Angiotensin Rezeptoren

Reaktive Sauerstoffradikale (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der intrazellulären Signaltransduktion. Hohe ROS-Konzentrationen führen dagegen zu einer Schädigung von intrazellulären Proteinen, Enzymen oder Transkriptionsfaktoren und damit zu einer Störung der regulären Zellfunktion bei einer Reihe von Erkrankungen wie Entzündungen, Arteriosklerose, arterieller Hypertonie, kardialen und vaskulären Erkrankungen oder Neoplasien. Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) haben häufig eine arterielle Hypertonie und eine erhöhte kardiovaskuläre Mortalität. In der vorliegenden Untersuchung sollte daher geprüft werden, ob Veränderungen von intrazellulären ROS bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom vorliegen und welchen Einfluß Angiotensin AT-2-Rezeptoren bei der Bildung der Sauerstoffradikale haben.

(46)

Der Zusatz des Singlet-oxygen-scavengers Natriumazid bzw. des Peroxynitrite-scavengers Ebselen ergaben eine signifikante Verminderung der PMA-stimulierten intrazellulären ROS-Bildung auf 29%±3% und auf 52%±4% des Kontrollwertes (jeweils p<0.01). Die Vorgabe des Angiotensin Converting Enzym Inhibitors Captopril führte zu einer signifikanten Verminderung der PMA-stimulierten intrazellulären ROS-Bildung auf 65%±5% des Kontrollwertes (p<0.01). Der Angiotensin AT-1- und AT-2-Rezeptoragonist Angiotensin II, der spezifische Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist Exp3174 und der Angiotensin AT-2-Rezeptoragonist CGP42112 verursachten ebenfalls eine signifikante Verminderung der PMA-stimulierten intrazellulären ROS-Bildung (jeweils p<0.05). Dagegen hatten der Angiotensin AT-1-Rezeptoragonist Angiotensin 1-7 und der spezifische Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonist PD123319 keine Wirkung auf die PMA-stimulierte ROS-Bildung. Dies deutet darauf hin, daß die intrazelluläre ROS-Bildung durch eine AT-2-Rezeptor Aktivierung blockiert werden kann.

(47)

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7. Danksagung

Der experimentelle Teil dieser Arbeit fand im Zeitraum von August 1998 bis April 2000 im nephrologischen Labor der medizinischen Klinik 1 der Universitätsklinik Marienhospital in Herne statt. Ich danke Herrn Professor Dr. med. W. Zidek für die Möglichkeit, dieses Thema im nephrologischen Labor zu bearbeiten.

Besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. med. M.Tepel, der stets für mich ansprechbar war und mir mit fachlicher Kompetenz zu Rate stand. Ebenso möchte ich mich bei der Station 6b bedanken, die mir bei der Auswahl der richtigen Patienten half, bei allen gesunden Freiwilligen, sowie bei allen Mit-Doktoranden, daß die Koordination im Labor so gut funktioniert hat und die Hilfsbereitschaft sehr groß war.

Auch meiner Familie, meinen Eltern und Geschwistern, sowie meinem Freund möchte ich danken, daß sie mir beim Schreiben dieser Arbeit mit Rat und Tat zur Seite standen.

(55)

8. Lebenslauf Persönliche Daten

Name : Susanne Stemmler

Geburtsdatum /-ort : 07.06.1972 in Würzburg Familienstand : Ledig

Anschrift : Buschweg 21 51519 Odenthal

Schulbildung

1978 - 1982 katholische Grundschule in Voiswinkel

1982 - 1988 Städtische-Realschule Bergisch-Gladbach mit Fachoberschulreife

1991 - 1994 Dietrich-Bonhoeffer-Gymnasium Bergisch-Gladbach mit allgemeiner Hochschulreife

Berufsausbildung :

1988-1991 Ausbildung bei der Bayer AG Leverkusen zur Chemielaborantin Studium : 1994 - 2000 1996 1997 1999 2000 1999 - 2000

Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum Physikum

1.Staatsexamen 2.Staatsexamen 3.Staatsexamen

Praktisches Jahr im Marienhospital in Herne Wahlfach: Gynäkologie

1998 - 2001 Doktorarbeit:

Im nephrologischen Labor des Marienhospitals in Herne unter der Leitung von PD Dr. med. M.Tepel.

Nebentätigkeiten :

1996 - 2000 Aushilfe im Pflegedienst im Klinikum Leverkusen Beruf :

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Referenzen

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