Közeli infravörös

Közeli infravörös

spektroszkópia és mikroszkópia

Gergely Szilveszter

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

Optikai spektroszkópia 2014. október 29.

black box

▼ grey box

(N)IR elfogad-

tatása

Rezgések és hullámok (USA vs. Magyarország)

(Tacoma Narrows Bridge, “Gallopin’ Gertie”, 1940. november 7.)

BME:

Schönherz Qpa vs. 4-6

3

Newton kísérletei – a fehéren túl I.

(1704)

Már korábban más is meg-

csinálta, de ő le is írta...

Newton kísérletei – a fehéren túl II.

5

Herschel kísérletei – a vörös alatt

1800. február 11.

Uránusz felfedezése:

1781. márc.

13-án háza udvaráról.

Coblentz kísérletei – az IR ujjlenyomat

etanol CH₃–CH₂–OH

dimetil-éter H₃C–O–CH₃

C₂H₆O, de IR sp. ≠!

7

IR – hő – energia

(egy régi trükk mai kivitelben)

An AC-130U gunship fires flares to emit masses of infrared and confuse heat seeking missiles.

http://www.wired.com/dangerroom/2012/10/infrared-obscurant/

IR sugárzással

a hőkövető rakéták ellen…

A kis

„csillagok”

melegebbek a hajtóműnél.

A molekulák rezgései

Deformációs rezgés

változás a kötésszögben

Szimm. vegyértékrezgés

változás a kötéshosszban

Aszimm. vegyértékrezgés

változás a kötéshosszban

fény-anyag kölcsön-

hatás (csúzlival

verébre)

NIR:

molekula / rezgési spektrosz-

kópia

9

Egy gyors példa a (M)IR-re

De ATR előtt gond a vizes (pl. biológiai) rendszerek-

kel...

1 2 3

O D

0 1 2 3

1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500

Wavelength (nm)

O D

víz (H ₂ O)

0 1 2 3

1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500

Wavelength (nm)

O D

bor

10 mm 4 mm 1 mm 10 mm

4 mm 1 mm

10 mm 4 mm 1 mm

etanol (CH 3 –CH 2 –OH)

És egy másik gyors példa NIR-re

OBI hatóság, Villány, Mór,

Pannon- halma...

termelők sok változó,

kicsi különbségek

▼ kemometria

Murray I.: Scattered information: philosophy and practice of near infrared spectroscopy. 11 In Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference, Ed by Davies A.M.C., Garrido-Varo A., NIR Publications, Chichester, pp. 1–12 (2004).

Jellemző NIR elnyelési sávok

Minden, ami nekünk kell:

víz, fehérjék, lipidek, szén-

hidrátok.

Foss

Infratec 1241 NIRSystems

Perten DA 7250

Perkin-Elmer Spectrum 400

infravörös berendezés

optikai konfiguráció

interferencia szűrő (ék, diszkrét)

mozgó diffrakciós rács

(holografikus) diódasor

(DA) interferométer (pl. Michelson)

(FT)

fényforrás

izzó (pl. W-halogén, Globar, Nernst)

fénykibocsájtó dióda (LED) hangolható

lézer

detektor

infravörös termikus (termoelem) infravörös foton

(félvezetők, pl.

PbS, InGaAs)

mérési elrendezés

reflexiós (R)

transzmissziós (T)

transzflexiós (TR)

1970-es évek

1980-as évek

1990-es évek

2000-es évek

2010-es évek

szűrők

mozgó diffrakciós rácsok

1970-es évek

1980-as évek

1990-es évek

2000-es évek

2010-es évek

szűrők

mozgó diffrakciós rácsok

Az eszközök csoportosítása,

fejlődése

reflexiós

mérési elrendezés (VIS-NIR / FT-NIR) transzmissziós

mérési elrendezés (NIT)

Foss NIRSystems 6500 + RCA

Foss Infratec 1241 GA

Mérési elrendezések – NIT és NIR

PE Spectrum 400 + NIRA

13 kisebb

hullámhossz nagyobb

energia

λ < λ

E ^{> E}

E < E

nagyobb hullámhossz

kisebb energia Ha

NIT & NIR, akkor NIR ≠ ... UV, VIS, NIR, (M)IR,

FIR, ...

Mérési elrendezések – NIT és NIR

E ^>>

λ <<

>> ^E

<< λ

(kvázi) inhomogén

magok

(kvázi) homogén

pelletek

15

Közeli infravörös spektrumok

NIT (ave) NIT (×10)

VIS-NIR (×3) FT-NIR (×3)

diszp. × 4 = FT

T

R

Hogyan mérjük? – 3-in-1

diszperziós (DS)

diódasoros (DA)

Fourier-transz- formációs (FT)

„bench-top”:

pre-

„process”:

poszt- diszperzív

Ez most egy pre- diszperzív elrendezés...

Hogyan mérjük? – diszperzió (DS)

.... ez pedig egy poszt- diszperzív elrendezés.

17

Hogyan mérjük? – FT

belső,

„referencia”

lézer

19 Mi mozog?

Semmi:

fix optikai rács.

Automata fényforrás- váltás = folyamatos (24/24) üzem.

Digitális VIS kamera élő képpel. (Pl.

liszt: szita kiszakadt.)

OPC, modbus ASCII, stb.

Hogyan mérjük? – diódasor (DA)

Precíziós mezőgazdaság:

„on-combine” technikák

Long D.:

On-Combine Sensing of grain protein with application to precision agriculture.

Oral presentation. 8^thAnnual Precision Agriculture Conference, Hays, KS, USA, January 19-20, 2005

talaj nitrogén profilja (felső ábra)

betakarított gabona „on-combine” NIR technikával mért fehérjetartalma (alsó ábra)

Precíziós mezőgazdaság:

„on-combine” technikák

21

„[...] These measurements can be:

at-line:

Measurement where the sample is removed, isolated from, and analyzed in close proximity to the process stream.

...-line, ...-line, de melyik? I.

Hatalmas potenciál:

sikerül a falat áttörnünk?

23

...-line, ...-line, de melyik? II.

William Whitford W., Julien C.:

Analytical Technology and PAT.

BioProcess InternationalJanuary 2007, 32–41

Az in-/on-line eszköze – a száloptika I.

Igen, törhetnek,

drágák...

:(

25

Az in-/on-line eszköze – a száloptika II.

Az in-/on-line eszköze – a száloptika III.

27

Technológiába illeszthető (egyéb) eszközök I.

Valósidejű:

keverő dobon (fix t helyett adott

minőség).

Több- csatornás elrendezés.

Technológiába illeszthető (egyéb)

eszközök II.

29

In-line rendszerek – pl. őrlemények

Biztos, hogy mindig kell száloptika?

Nem...

In-line rendszerek – pl. folyadékok

31

Mobil, hordozható (handheld) eszközök

Pl. Los Angeles-i rendörség, futószőnyeg szeméttelep.

NIR FT-IR Raman

Ha egyedül nem megy

33

A feltárás lépései – (IQ)Q = IQ ²

Identification – azonosítás

Ki vagy te?

éles spektrális különbségek keresése

korreláció, euklédeszi távolság stb.

Qualification – minősítés

Hová tartozol?

szubpopulációk definiálása finomabb eltérések alapján

főkomponens analízis (PCA), Mahalanobis-távolság stb.

Quantification – mennyiségi meghatározás

Mennyi az annyi?

referencia paraméterekkel kalibrációk

részleges legkisebb négyzetek (PLS) módszere stb.

A test („vas”) rendben, de

mi van a lélekkel?

Klasszikus API vs. biomolekulák

35

E. coli emlőssejtek

Kikkel termeltetünk?

Tabletta 1-2 paraméter,

de E. coli, CHO ?

Na akkor, modellezzünk...

37

A végső cél

Off-line-tól a real-time-ig

39

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon követése: PQS módszer

még a puttonyszám

...

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

41

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

43

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

►

►

►

►

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

45

►

►

►

►

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

47

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

Fermentáció ( E. coli ) off-line nyomon

követése: PQS módszer

49

A változékonyság leírása: PCA

Méret (PC1)

Kulcs feje (PC2)

Szín

(PC3)

nagy (kapu) átlagos (ajtó) kicsi (asztal)

kerek ovális téglalap sokszögű

oxidált fém kék ciklámen sárga

PC2 vs. PC1

Méret (PC1) Kulcs feje

(PC2)

nagy (kapu) átlagos

(ajtó) kicsi

(asztal) ovális ►

sokszögű ►

téglalap ►

51

PC2 vs. PC3

Szín (PC3) Kulcs feje

(PC2)

kerek ► ovális ► sokszögű ►

oxidált fém kék ciklámen sárga

téglalap ►

Gabona minták termesztési helyei

Franciaország (Clermont-Ferrand) betakarítás éve: 2007

Magyarország (Martonvásár)

betakarítás éve: 2005, 2006, 2007

Lengyelország (Dankow/Choryn) betakarítás éve: 2007

G×E hatás vs. PCA I.

53

fa jt a G × E k é s z ü lé k

é v já ra t

G×E hatás vs. PCA II.

Forma 1 Forma 2 Forma 3

Forma 4 Forma 5

Polimorf transzformációs vizsgálat:

fénymikroszkópos felvételek

Forma 2

55

Polimorf transzformációs vizsgálat:

in-line Raman-száloptika (PCA)

Fő(bb) kellékei

jól definiált mintasereg

pontos referencia módszerek

megbízható spektroszkópiai eszközök

egzakt matematikai, statisztikai, kemometriai eljárások

A kalibrálás és validálás elemei

Kalibrálás

többváltozós összefüggések, korrelációk keresése

a spektroszkópiai és a referencia adatsorok között

Validálás

a kalibrációs modell

teljesítményének értékelése független mintasorozattal vagy kereszt validálással

A kalibrálás és validálás áttekintése

57

X

y

referencia adatok a kalibrációhoz spektroszkópiai

mátrix a kalibrációhoz spektrum-

szelektálás spektrum- transzformáció

reprezentatív mintasereg

spektrum- felvétel

statisztikai adatfeldolgozás

Kalibrálás

referencia-

mérések

független mintasereg, kereszt validálás

spektroszkópiai mátrix a validáláshoz spektrum-

felvétel

referencia- mérések

referencia adatok

(mért) referencia

adatok (becsült)

y’

y’

y

y

+ ++++

++ ++ ++

+ +++++++

++++ + +

+ + +

+

X

összehasonlítás („scatter plot”)

Validálás

59

0 2 4 6 8 10

0 3 6 9 12 15 18 21

Time (hour) Gly (g L-1 )

6 8 10 12

l L-1 )

Fermentáció ( E. coli ) in-line nyomon követése: diszp. NIR-rel PCA, PLS

Habzás- gátló, glükóz adagolása...

Léptéknövelés: 1 litertől 5000 literig

Greiner István: Biotechnológiai gyógyszergyártás.

A Magyar Tudomány Ünnepe – 2013. Az MTA Kémia Tudományok Osztályának előadói ülése. „Kémia a jobb életminőségért” (2013. november 6.) http://www.chemonet.hu/osztaly/kemia/tudnap13/greiner.pdf

API meghatározása – simítás hatása a derivált képzésére

Az első és második deriváltak képzése a

kezeletlen spektrumokból más-más beállításokkal történik:

Diszperziós NIR esetén:

2, 4, 8, 12, 16, 20 nm-es (1, 3, 5, 7, 9, 11 pontos) kapu

[„gap-segment” derivált]

-0,0075 -0,0025 0,0025 0,0075 0,0125 0,0175 0,0225

1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500

hullám hossz (nm )

1. derivált log (1/R) [2|0 nm]

0,0400 0,0600 0,0800 0,1000 0,1200

(1/R) [20|0 nm]

NIR

2 nm

1. derivált

1. derivált

63

-0,0045 -0,0035 -0,0025 -0,0015 -0,0005 0,0005 0,0015 0,0025 0,0035 0,0045

1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500

hullám hossz (nm)

2. derivált log (1/R) [2|0 nm]

-1,20E-04 -1,00E-04 -8,00E-05 -6,00E-05 -4,00E-05 -2,00E-05 0,00E+00 2,00E-05 4,00E-05 6,00E-05

1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500

hullámhossz (nm )

2. derivált log (1/R) [5 pont]

-0,0900 -0,0700 -0,0500 -0,0300 -0,0100 0,0100 0,0300 0,0500 0,0700 0,0900

1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500

hullám hossz (nm )

2. derivált log (1/R) [20|0 nm]

-3,00E-05 -2,00E-05 -1,00E-05 0,00E+00 1,00E-05 2,00E-05 3,00E-05

1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500

hullámhossz (nm )

2. derivált log (1/R) [49 pont]

NIR FT-NIR

63

2 nm

20 nm

5 pont

49 pont 2. derivált

2. derivált

2. derivált

2. derivált

API meghatározása – diszperziós vs.

FT (pl. detektorok)

0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,97

0,98 0,98 0,98 0,97 0,97 0,97 0,98 0,99 0,98 0,98 0,98 0,97 0,97 0,95

0,96

0,96

0,96

0,97

0,95

0,96

11

8 8 8 8 8 9

7 7 7 7 7 7

0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

S D1_2nm D1_4nm D1_8nm D1_12nm D1_16nm D1_20nm D2_2nm D2_4nm D2_8nm D2_12nm D2_16nm D2_20nm 0,88 0,89 0,90 0,91 0,93 0,95 0,96

0,97

0,97

0,98

1,00

1,00

0,89

0,90

0,97

0,97

0,98

0,98

0,97

0,98

0,98

0,98

0,97 0,94

0,91

0,89

0,87

0,95 0,95 0,95 0,65 0,68 0,77 0,85

11

7 7 7 7 8

9 9

11

3

7 8

7 7 7 8

3 0

5 10 15 20 25

Faktor

0,75 0,78 0,79 0,81 0,82 ,72

1 6 0 2 3 4 8 8 0 2 4 0,84

0,80

0,78

0,75

,71

0,84

0,76

1 11 1,5

2 2,5

NIR FT-NIR

1,37 1,31 1,24 1,15 1,01 0,87

3 9 5 1 7 2 5 1,21 1,27 6 ,69 ,73

1,48

1,88

2,21

2,30

0,87

0,87

0,89 1,42 1,28 1,13 0,94

11 11

10 15 20 25

Faktor

alap spektrum

első derivált spektrum második derivált spektrum R

M S E ( ‰ )

API meghatározása –

teljesítménymutatók (figure of merit)

Kritikus - kontrollált Élelmiszer botrányok:

mert jobb az analitika + a híráramlás.

1 3

7 4 6 7 5

11 14 18 31 30

49

58 57 58 48

52

1 2 2 1 4 6 4

10 9 5

16 17 15 13 22

0 10 20 30 40 50 60 70

1994 1996 1997 1998 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015

közlemény (db)

év Web of Science

ScienceDirect

65

„near-infrared AND imaging AND pharma” kulcsszóra történő keresés

Web of Science

ScienceDirect

Progresszív fejlődés

Spektrális hiperkocka

Spektrális hiperkocka vs. tudomány

De mi volt 1994 előtt?

Gyilok.

Lewis E.N., Carroll J.E., Clarke F.:

A near infrared view of pharmaceutical formulation analysis.

NIR news 12(3), 16–18 (2001)

Az eszközök fejlődése – (hideg)

háborúkon keresztül (II. világháború)

Éjjellátók kezdete:

„vámpír egység”

(németek).

67

Az eszközök fejlődése – (hideg)

háborúkon keresztül (hideg háború)

http://www.togtech.com/huge-cold-war-camera-with-100-inch-infrared-lens-takes-two-to-operate/

Harc a hadizsák- mányért…

(USA vs.

Szu.).

Sok új USA / Szu. fegyver

német alapokon…

Az eszközök fejlődése – (hideg)

háborúkon keresztül (Korea, Vietnam)

Még ma is megvásárol- ható az interneten.

69

Az eszközök fejlődése – (hideg) háborúkon keresztül (pl. Irak)

http://www.wired.com/dangerroom/2013/04/darpa-infrared-cameras/

DARPA:

lásd még a robotkutyát

is…

Mai cél:

kisebb berendezés,

jobb felbontás.

Civil alkalmazások – hideg/meleg I.

Energia- osztályba

sorolás:

hol szökik a hő…

71

Civil alkalmazások – hideg/meleg II.

http://coolcosmos.ipac.caltech.edu/image_galleries/ir_zoo/coldwarm.html

A fej leghidegebb

pontja:

fülünk.

(Égett ujj…)

Melegvérű ember

vs.

hidegvérű gekkó …

... vagy skorpió.

Kutyalihegés

= hőleadás.

(Bőrén nincsenek

pórusok.)

Civil alkalmazások – hideg/meleg III.

Törött középső ujj gyógyulása

Szomato infra:

73

Egér a Marsról I.

Golde T.E., Bacskai B.J.:

Amyloid deposits can be rapidly detected in the brains of living mice using a novel ligand and near-infrared fluorescence imaging.

Nat. Biotechnol.23(5), 552–554 (2005)

Sokszor csak a bonc- asztalon látjuk az Alzheimer-

kór állapotát.

Korai észlelés és terápia:

jobb esélyek.

NIR kamera segít.

Itt már aktív:

IR besu- gárzás, DE

roncsolás- mentes

Egér a Marsról II.

75

Szexálás I.

Sumriddetchkajorn S., Chakkrit Kamtongdee C.:

Optical penetration-based silkworm pupa gender sensor structure.

Appl. Optics51(4), 408–412 (2012)

Tenyésztés szempontjából

fontos, hogy mi van a bábban.

Bábot megbontani

nem lehet, mert akkor elpusztul…

Szexálás II.

selyemhernyó bábjába!

77

Szexálás III.

Sumriddetchkajorn S., Chakkrit Kamtongdee C.:

Optical penetration-based silkworm pupa gender sensor structure.

Appl. Optics51(4), 408–412 (2012)

Lányoknál semmi extra …

… de a fiúknak világít a „farkuk”.

Pár/tíz mikrométeres nagyságrendek(től)

Látható kép: vizsgálandó terület megkeresése, majd (N)IR mérés

Nem, vagy csak kis mintaelőkészítést igényel: kevesebb hiba

Különböző mérési módok: heterogén minták könnyebb vizsgálata

Mikro/makroszkópos képalkotás I.

Meddig tart?

Más megoldás lehet jó…

(bemozdult fénykép)

79

Mikro/makroszkópos képalkotás II.

pont kép

Mikro/makroszkópos képalkotás III.

A 16 elemből álló detektorsor a mintát 100 µm × 6,25 µm vagy

81

FPA (Focal Plane Array)

Mikro/makroszkópos képalkotás IV.

videotelefon fejlesztése (AT&T): 1969!

Mikro/makroszkópos képalkotás V.

T (transz- misszió)

83

Mikro/makroszkópos képalkotás VI.

E

R

mintafelszín

E R

spekuláris reflexió

diffúz reflexió

gyengített teljes reflexió

(ATR)

R (reflexió)

mintafelszín mintafelszín

Mikro/makroszkópos képalkotás VII.

Cassegrain objektív

ATR kristály ÉS minta

elmozdulás (x,y)

31

Mikro/makroszkópos képalkotás VIII.

Technológia nyomon követése I.

bevonás

Képalkotás – tablettavizsgálatok

bevonat (Opadry Pink): idő előrehaladtával erősödő jel 1390 nm-en

korpusz: idő előrehaladtával gyengülő jel 2120 nm-en

87

Technológia nyomon követése II.

keverés

Eredetiségvizsgálat

Gendrin C. et al.:

Content uniformity of pharmaceutical solid dosage forms by near infrared hyperspectral imaging: A feasibility study.

Talanta73(4), 733–741 (2007)

Gendrin C. et al.:

Pharmaceutical applications of vibrational chemical imaging and chemometrics: A review.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis48(3), 533–553 (2008)

Képalkotás – tablettavizsgálatok

NIR VIS Hamis Eredeti

Pl. hamis Viagrában a

kék színt patkányméreg

adta.

Nem kell eltörni, a „NIR”

belelát.

(Megmarad a bizonyíték.)

Eredeti Hamis

Eredetiségvizsgálat vs. imaging:

makro (VIS)

Edzőteremben izomnövelő

helyett

„barkács cucc”.

89

Eredeti Hamis

Eredetiségvizsgálat vs. imaging:

makro (NIR)

PCA Abs.

Mátrixhatás.

• Képalkotás NIR tartományban:

nincs roncsolás

• 400 × 400 μm méretű mérési tartomány, 6,25 × 6,25 μm méretű képpontokkal

• 64 × 64 pont, azaz összesen 4096 pont, pontonként 128 spektrum átlagolásával

• Átlagos abszorbancia értékek alapján színezett ábrák

Technológiai probléma vs. imaging

Probléma a tabletta felületén:

mi az oka?

Spórolás miatt más alapanyag, bevonathiányt

okozott.

91

Hatóanyag R

=0,88-0,96

Filmbevonat (Opadry®) R

=0,41-0,54

Technológiai probléma vs. imaging:

korrelációs térképek (2D és 3D)

lószúnyog szárnya: 18,5 mm × 4,5 mm = 132 000 spektrum

Képes képtelenségek

Anyagok azonosítása

(vegyszer, lőpor) az

Szerkezet, összetétel megállapítása

roncsolás nélkül.

93

A (N)IR módszerek, technológiák előnyei

Roncsolásmentes (fermentáció, anyagazonosítás, homogenitás, bevonat, hamisítás, visszáru, csomagolóanyag stb.)

Gyors (jelsorozatok (másod)perces nagyságrendben képezhetők)

Rengeteg rejtett információ megfejthető (adatbányászat, oknyo- mozások)

Gyors visszacsatolás a technológiába, minőségellenőrzésbe, mi- nőségbiztosításba

FDA „alternatív” módszere

Költséghatékony, nagy áteresztőképességű

Tudásintenzív módszerek

Köszönetnyilvánítás

Párta László

, Ballagi András

Kiss Violetta

, Finta Zoltán

Horgos József

, Zelkó Romána

Jekő József

, Csorvássy István

Lakatos László

, Axel Rau

Izsó Eszter

, Tieger Eszter

, Lőrincz Áron

, Kontsek Endre

1

Richter Gedeon Nyrt.