Differenzielle und Quantitative Analyse eines transgenen Mausmodells mit endogener Dysfunktion des Proteasoms Dissertation

Volltext

(1)

Differenzielle und Quantitative Analyse eines

transgenen Mausmodells mit endogener

Dysfunktion des Proteasoms

Dissertation

z

ur Erlangung des Grades

Doktor der Naturwissenschaften

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

der Fakultät für Chemie und Biochemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Dipl.-Biochem.

Thomas Schulenborg

(2)

Referent

Prof. Dr. Katrin Marcus

Funktionelle Proteomik

Ruhr-Universität Bochum

(3)

„Science is like sex: sometimes something useful comes out, but that is not why we are doing it “

Richard P. Feynman *1918 - 1988

(4)
(5)

An dieser Stelle möchte ich mich bei all den Menschen bedanken, die mich bei der Entstehung dieser Arbeit unterstützt und begleitet haben.

Als erstes möchte ich mich bei Prof. Dr. Katrin Marcus bedanken in deren Arbeitsgruppe diese Arbeit entstanden ist. Liebe Katrin, danke für Deine kompetente und engagierte Betreuung. Es war schön zu wissen, dass Du immer ein offenes Ohr hattest und ich viel von Dir lernen konnte.

Herrn Prof. Dr. Helmut E. Meyer möchte ich danke sagen für seinen unermüdlichen Einsatz für das MPC und seine Mitarbeiter, der die hervorragende Ausstattung der Arbeitsgruppen erst ermöglicht hat.

Prof. Dr. Fred W. van Leeuwen und seinen Mitarbeitern danke ich für die Bereitstellung der Mauscortices und die interessanten Schriftwechsel.

Außerdem möchte ich Herrn Prof. Dr. Rolf Heumann dafür danken, dass er sich für die Begutachtung der Arbeit zur Verfügung gestellt hat.

Auch ohne Freunde und Kollegen wäre diese Arbeit so vermutlich nie entstanden. Caro, danke für Deine Freundschaft, die Denkanstöße, Diskussionen und Gespräche auch abseits des Themas.

Lieber Sven und liebe Claudia, die Koch- und Spielabende, die eigentlich mal als Matheauffrischkurs gestartet waren, werden mir immer in Erinnerung bleiben und waren stets eine schöne Abwechslung neben der Arbeit. Danke für Eure Freundschaft und die offenen Ohren.

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Ein Dank geht auch an alle „Brainies“ und sonstigen lieben Mitarbeitern des MPC, die eine angenehme Arbeitsatmosphäre geschaffen haben. Besonders wäre in der Verwaltung Dr. Michael Hamacher, Ute Köster, Petra Krämer und Birgit Aigner zu nennen, die viele organisatorische Dinge für die Mitarbeiter im MPC geregelt haben.

Bedanken möchte ich mich aber auch bei der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität, die im Rahmen der „Forschungsförderung Ruhr-Universität Bochum Medizinische Fakultät“ (FORuM) diese Arbeit mit einer Anschubfinanzierung

ermöglicht hat, sowie bei der Alzheimer Forschung Initiative e. V. (AFI) und der Internationale Stichting Alzheimer Onderzoek (ISAO), die ebenso diese Arbeit unterstützt haben.

Herrn Prof. Dr. Eckhard Friauf möchte ich auch noch danken, der mich 2008 schon in die AG Tierphysiologie an der TU Kaiserslautern aufgenommen und mich stets unterstützt hat.

Meiner Familie danke ich von Herzen. Liebe Mama, lieber Papa, danke, dass Ihr mich während der ganzen Zeit immer so liebevoll unterstützt habt, mir das Studium ermöglicht habt und immer für mich da wart. Danke! Karin, Dir danke ich für die Unterstützung bei der Arbeit, das ein oder andere wäre ohne Dich sicher schwieriger geworden.

(7)

V

ERÖFFENTLICHUNGEN UND

P

RÄSENTATIONEN

Veröffentlichungen

Hahner S, Jabs W, Klinski M, Lubeck M, Marcus K, Meyer HE, Schulenborg T, Suckau D. LC-ESI-MALDI: Integrierte Akquisition komplementärer MS-MS-Informationen für die Proteomanalytik. Biospektrum 2004 (3), 323

Langenfeld E, Redlich G, Schulenborg T, Zanger U, Vacun G, Marcus K, Meyer

HE. Proteomics as a part of systems biology digging for membrane proteins.

Mol Cell Proteomics 2005; 4(8):180

Redlich G, Langenfeld E, Schulenborg T, Helling S, Zanger U, Meyer HE, Marcus K. Analysis of phosphorylated membrane proteins in human

hepatocytes. Mol Cell Proteomics 2005; 4(8):282

May C, Helling S, Langenfeld E, Schulenborg T, Meyer HE, Lutter P, Marcus K. Selective labelling of plasma membrane proteins of Jurkat T-cells using cydye DIGE fluor minimal dyes. Mol Cell Proteomics 2005; 4(8):355

Schmidt O*, Schulenborg T*, Meyer HE, Marcus K, Hamacher M. How proteomics reveals potential biomarkers in brain diseases. Expert Rev Proteomics 2005 Dec;2(6):901

SchulenborgT, FischerDW, Meyer HE, van Leeuwen FW, Marcus K.

(8)

Helling S, Schmitt E, Joppich C, Schulenborg T, Müllner S, Felske-Müller S, Wiebringhaus T, Becker G, Linsenmann G, Sitek B, Lutter P, Meyer HE, Marcus K. 2-D differential membrane proteome analysis of scarce protein samples.

Proteomics 2006;6(16):4506

Potthoff S, Sitek B, Schulenborg T, Stegbauer J, Vinke, T, Meyer HE, Rump LC,

VonendO. The proteom of chronic renal failure. Hypertension 2006;48(4):759

Potthoff S, Sitek B, Schulenborg T, Stegbauer J, Vinke T, Rump LC, Meyer HE, Vonend O. Novel approaches to analyse glomerular proteins from smallest scale murine and human samples using DIGE saturation labelling. J Hypertension 2006;24:111

Potthoff S, Sitek B, Schulenborg T, Stegbauer J, Vinke T, Rump LC, Meyer HE, Stühler K, Vonend O. Fluorescence difference gel electrophoresis saturation labelling as a novel tool to analyze glomerular proteins from smallest scale murine and human samples.Nephrology Dialysis Transplantation2006;21:35

Schulenborg T*, Schmidt O*, van Hall A, Meyer HE, Hamacher M, Marcus K. Proteomics in neurodegeneration - disease driven approaches. J Neural Transm 2006;113(8):1055

Sitek B, Potthoff SA, Schulenborg T, Stegbauer J, Vinke T, Rump LC, Meyer HE, Vonend O, Stühler K. Novel approaches to analyse glomerular proteins from smallest scale murine and human samples using DIGE saturation labelling.

(9)

Sitek B, Sipos B, Schulenborg T, Marcus K, Schmiegel W, Hahn SA, Kloppel G, Meyer HE, Stühler K. High-performance proteomics; Proteome analysis of 1000

microdissected cells from pancreatic carcinoma precursor lesions. Mol Cell

Proteomics 2006;5(10):147

Sipos B, Sitek B, Alkatout I, Poschmann G, Schulenborg T, Marcus K, Hahn S,

Kloppel G, Luttges J, Dittert D, Baretton G, Schmiegel W, Meyer H, Stühler K.

Identification of molecular markers of pancreatic tumor progression using a proteomic approach. Pathology 2007;203(5):259

Marcus K, Kühn-Hölsken E, Schmidt C, Schulenborg T, Urlaub H. 'Proteomic basics - sample preparation and separation': the 1st European Summer School in Kloster Neustift, 12-18 August, 2007. Proteomics 2008;8(2):230

Potthoff SA, Sitek B, Stegbauer J, Schulenborg T, Marcus K, Quack I, Rump LC, Meyer HE, Stühler K, Vonend O. The glomerular proteome in a model of chronic kidney disease. Proteomics - Clinical Applications 2008;2(7-8):1127

Sitek B, Sipos B, Akatout I, Poschmann G, Stephan C, Schulenborg T, Marcus K, Goldring EC, Greenhalf W, Lüttges J, Dittert DD, Baretton G, Schmiegel W, Hahn SA, Klöppel G, Neoptolemos J, Meyer HE, Stühler K. Analysis of the pancreatic tumor progression by a quantitative proteomic approach and immunhistochemical validation. Journal of Proteome Research 2009;8(4):1647-56

Zhang Q, Schulenborg T, Tan T, Müller B, Friauf E, Fecher-Trost C. Proteome analysis of microvilli membrane fractions at the human feto-maternal barrier.

(10)

Buchartikel

Dormeyer W, Schulenborg T, Schnölzer M, Meyer HE and Marcus K. Analytik posttranslationaler Modifikationen Phosphorylierung und Acetylierung von Proteinen

Bioanalytik, Elsevier, Heidelberg, Editoren: F. Lottspeich & J. W. Engels, Kapitel 24, 2006, 617-634.

Ausgewählte Vorträge

„Proteomic analysis of the UBB+1 transgenic mice”, Netherlands Institute for Brain Research, Januar 2007, Amsterdam, Niederlande

„Proteomic analysis of the UBB+1 transgenic mice“, 5th Dutch Endo-Neuro-Psycho Meeting, Juni 2006, Doorwerth, Niederlande

„Separation of ribosomal proteins using 2D-PAGE and 2D-HPLC“, Human Brain Proteome Meeting, Januar 2004, Rauischholzhausen, Deutschland

Ausgewählte Präsentationen

„Detection of Phosphorylation Sites Using the 4000 Q Trap“, GBM Herbsttagung, September 2004, Münster, Deutschland

„Phospho Proteome Analysis of an Alzheimer’s Disease Transgenic Mouse

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„Morbus Alzheimer - Differential, Quantitative Proteome Analysis and Localisation of Post-Translational Modifications in a Transgenic Mouse with Endogenous Proteasome Inhibition”, 4th Endo-Neuro-Psycho Meeting, Juni 2005, Doorwerth, Niederlande

„Morbus Alzheimer - Differential, Quantitative Proteome Analysis and

Localisation of Post-Translational Modifications”*, 4. HUPO-Weltkongress der Proteomforschung, August 2005, München, Deutschland

*Posterpreis der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung (DGPF)

„Alzheimer’s Disease - Phospho-Protein Analysis of a Transgenic Mouse with Endogenous Proteasome Inhibition“, 5th Forum of European Neuroscience, Juli 2006, Wien, Österreich

„Alzheimer’s Disease - Phospho-Protein Analysis of a Transgenic Mouse with Endogenous Proteasome Inhibition“, 10th International Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders, Juli 2006, Madrid, Spanien

(12)

A

BKÜRZUNGSVERZEICHNIS

× g Erdbeschleunigung

%C Vernetzungsgrad (crosslinking) %T Totalacrylamidkonzentration (v/v) Volumen pro Volumen (w/v) Gewicht pro Volumen

1D Eindimensional

2D Zweidimensional

AD Alzheimer’s Disease (engl.: Alzheimer Krankheit)

AICD APP intrazelluläre Domäne APP Amyloid-Precursor Protein

APS Ammouniumpersulfat ASA Aminosäureanalyse Aβ Amyloid β CHAPS 3-[N-(Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-1-propansulfat Da Dalton DMF Dimethylformamid DTT Dithiothreitol ESI Elektrospray-Ionisation

FA formic acid (engl.: Ameisensäure)

GSK Glycogensynthase

kinase

h Stunde(n)

HPLC high performance liquid chromatography (engl.: Hochleistungs-flüssigkeitschromatographie)

HSP heat shock protein (engl.: Hitzeschockprotein)

IEF Isoelektrische Fokussierung IPG Immobilisierter pH-Gradient

(13)

M mol/L

m/z Masse-zu-Ladungs-Verhältnis

min Minute(n)

MS Massenspektrometrie

MS/MS Tandemmassenspektrometrie

MW molecular weight (engl.: Molekulargewicht)

p.a. pro analysi (lat.: für die Analyse) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS phosphate buffered saline (engl.Phosphatgepufferte Salzlösung

pH potentia Hydrogenii

PHF paarige helikale Fragmente pI Isoelektrischer Punkt

ProQ® DPS ProQ® Diamond Phosphospezifische Färbung

RNA ribonucleic acid (engl.: Ribonukleinsäure)

ROS reactive oxygen species (engl. reaktive Sauerstoffspezies)

RT Raumtemperatur

s Sekunde(n)

TBS tris buffered saline (engl.: Tris gepufferte Salzlösung)

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin TFA Triflouressigsäure

tg transgene Mäuse

Tris Tris(hydroxymethyl-)aminomethan U unit (engl..: spezifische Aktivität)

UB Ubiquitin

UBB+1 modifiziertes Ubiquitin B

(14)

I

NHALTSVERZEICHNIS

Danksagung

i

Veröffentlichungen und Präsentationen

i

Abkürzungsverzeichnis

vi

Inhaltsverzeichnis

viii

1

Einleitung

1

1.1 Das Ubiquitin-Proteasom-System 1 1.1.1 Ubiquitin 2 1.1.2 Das Proteasom 4

1.1.3 Degradation durch das Ubiquitin-Proteasom-System 5

1.2 Neurodegenerative Erkrankungen 7

1.2.1 Proteinablagerungen 8

1.2.2 Oxidativer Stress 8

1.2.3 Mitochondriale Dysfunktion 9

1.2.4 Zellulärer, Axonaler Transport 10

1.2.5 Charperonaktivität 10

1.2.6 Das UPS und neurodegenerative Krankheiten 11

1.3 Ubiquitin +1 11

1.3.1 Das UBB+1-Mausmodell 13

1.4 Proteom- und Phosphoproteomanalytik 15

1.4.1 Massenspektrometrie in der Proteomanalyse 16

1.4.2 Phosphoproteomanalyse 22

1.4.3 Differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) 27

2

Zielsetzung

33

3

Material und Methoden

34

(15)

3.2 Chemikalienliste 36

3.3 Probenaufarbeitung 39

3.3.1 Präparation der Maushirne 39

3.3.2 Proteinextraktion aus den Cortices 39

3.4 Proteinmengenbestimmung mittels Aminosäureanalyse 40

3.5 Differenzielle Gel-Elektrophorese (DIGE) 41

3.5.1 Markierung der Protein mit Fluoreszenzfarbstoffen 41

3.5.2 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 42

3.5.3 Differenzielle Gelbildanalyse 45

3.6 Statistische Güte 45

3.7 Proteinfärbung 47

3.7.1 MS-kompatible Silberfärbung nach Jungblut (1990) 48 3.7.2 Färbung mit Kolloidal-Coomassie nach Neuhoff (1988) 49

3.7.3 Pro-Q Diamond® phosphospezifische Färbung 49

3.8 Dephosphorylierung von phosphorylierten Proteinen 50

3.9 1D-Gelelektrophorese 50

3.10 Western Blot-Analyse 51

3.11 In-Gel-Verdau 53

3.12 Proteinidentifikation mittels nanoLC-ESI-MS/MS 53

3.13 Immunhistochemische Färbung 55

4

Ergebnisse

57

4.1 Methodische Entwicklung 57

4.1.1 Zweidimensionale differenzielle Gel-Elektrophorese 57

4.1.2 Etablierung der Phosphospezifischen Färbung 61

4.1.3 Etablierung der Vorläuferionenanalyse 68

4.2 Differenzielle Proteomanalyse 74

(16)

4.2.4 Analyse der Cortices der 22 Monate alten Mäuse 84

4.2.5 Die statistische Güte der Experimente 87

4.2.6 Validierung der differenziellen Regulation von 14-3-3ζ 89

4.2.7 Immunhistochemische Färbung von 14-3-3ζ 90

4.2.8 Zeitlicher Verlauf der relativen Expression von 14-3-3ζ 92 4.2.9 Bestätigung der Phosphorylierung von 14-3-3ζ 93

4.3 Phosphoproteomanalysen 94

4.3.1 Lokalisation der differenziellen Phosphoproteine 95

4.3.2 Lokalisation von Phosphorylierungsstellen 98

5

Diskussion

100

5.1 Methodische Diskussion 101

5.1.1 2D-Polyacrylamidgelelektrophorese 102

5.1.2 Phosphoproteomanalysen 109

5.2 Das UBB+1 Mausmodell 122

5.3 Diskussion der Ergebnisse 125

5.3.1 Das Déjà-Vu der Proteinfamilien 125

5.3.2 14-3-3ζ 126

5.3.3 Kohlenhydratkatabolismus 142

5.3.4 Heat Shock Proteine 147

5.3.5 Tubulin 150

6

Zusammenfassung

152

7

Literatur

154

8

Anhang

189

8.1 Spektren von αCasein 189

8.2 Auflistung der 2D-DIGE-Daten 190

8.3 Ergebnisse der Datenbanksuche 196

(17)

1

E

INLEITUNG

1.1

Das Ubiquitin-Proteasom-System

(18)

Proteine in Lysosomen innerhalb der Zelle degradiert werden. Weiterhin ermöglicht sie auch den Abbau von zell- und körperfremden Komponenten wie Viren und Bakterien und stellt damit auch eine Immunantwort dar (Deretic & Klionsky 2008). Die alternative Degradation erfolgt über das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), an dem sowohl Ubiquitin als auch das Proteasom beteiligt ist, worauf in den nächsten Abschnitten näher eingegangen wird.

1.1.1 Ubiquitin

(19)

Das translatierte UBB kann sowohl einzeln, als auch als Teil eines Pro-teinkomplexes vorliegen und ist an vielen zellulären Prozessen beteiligt. So bindet es, während der mitotischen G1-Phase an Cyclin und spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellzyklus. Weiter ist es in der DNA-Reparatur, der Embryogenese, der Transkription, der Apoptose und dem proteasomalen Abbau von Proteinen beteiligt (Wunsch & Haas 1995; Pickart 2002; Conaway et al. 2002). Die paarigen helikalen Fragmente (PHF) in den neurofibrillären Faserbündel in Gehirnen von Alzheimer-Patienten liegen ebenfalls ubiquitiniert vor und die Konzentration von UB im zerebralen Cortex und in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (CSF, engl. Cerebrospinal fluid) ist stark erhöht (Wang et al. 1991; Iqbal & Grundke-Iqbal 1997). UB bindet kovalent über eine Isopeptidbindung mit seinem C-terminalen Glycin (Gly76) an die ε-Aminogruppe von Lysin (Lys) eines Proteins und fungiert so als post-translationale Modifikation, die beispielsweise bei der Histoneregulation oder bei der Lokalisierung von Membranproteinen eine Rolle spielt (Hicke 2001; Haglund et al. 2003). Die erste Beobachtung der kovalenten Bindung von Ubiquitin an andere Proteine erfolgte 1977 von Goldknopf und Hunt (Hunt & Dayhoff 1977; Goldknopf & Busch 1977) und bereiteten damit, zusammen mit der Entdeckung des ATP-abhängigen Abbaus von Proteinen durch Herschko (Hershko & Tomkins 1971), den Weg für die Entdeckung des Ubiquitin-abhängigen Proteinabbaus durch Ciechanover, Hershko und Rose Anfang der 1980er Jahre (Hershko et al. 1979; Hershko et al. 1980; Ciechanover et al. 1980). UB selbst besitzt sieben Lysinreste (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48 und Lys63) an die sich andere Ubiquitin-Monomere anheften können und viele verschiedene Poly-UB-Ketten-Topologien bilden können.

Die zuerst beschriebene Poly-UB-Kette war über Lys48 konjugiert (Chau et

(20)

DNA-Reparatur zu spielen scheint (Spence et al. 1995). Man unterscheidet zwischen Mono-, Multi- oder Polyubiquitinierung. Bei der Multiubiquitinierung befindet sich an mehreren Lys-Resten ein UB, wohingegen bei der Polyubiquitinierung an einem Lys-Rest eine Polyubiquitinkette sitzt, bei denen jeweils weitere Ubiquitine über eine der sieben eigenen Lys-Reste gebunden sind. Für die Mono- und die Multiubiquitinierung ist bekannt, dass sie eine wichtige Rolle bei vielen Sekretionsprozessen spielen (Mukhopadhyay & Riezman 2007). Im Gegensatz dazu steht die Polyubiquitinierung des Lys48, die hauptsächlich mit der proteasomalen Degradation in Verbindung gebracht wird, obwohl sie vermutlich noch weitere Funktionen besitzt (Pickart & Fushman 2004). Aktuelle Arbeiten zeigen, dass andere Ketten, z. B. über Lys62, aber ebenso die ubiquitinabhängige Degradation ermöglichen (Kirkpatrick et al. 2006; Saeki et al. 2009; Xu et al. 2009).

1.1.2 Das Proteasom

(21)

1.1.3

Degradation durch das Ubiquitin-Proteasom-System

(22)

(E1), Ubiquitinkonjugasen (E2) und Ubiquitinligasen (E3) beteiligt sind, wird über ein UB über den C-Terminus an die ε-NH2-Gruppe eines internen Lysinrestes

gehängt (Pickart & Eddins 2004).

Die Komplexität und Spezifität der Proteinubiquitinierung wird deutlich, wenn man auf die Anzahl der Gene schaut, die in den beteiligten Enzymklassen jeweils beteiligt sind. Beim Menschen sind zwei E1 Isoformen, mehr als 50 E2- und mindestens 1.000 E3-Proteine beschrieben (Sun 2003). Die hohe Spezifität und Selektivität, z. B. durch zelltypspezifische Expression und hochspezifischer Protein-Substrat-Selektivität, wird der Vielzahl an E3-Ligasen zugeschrieben (Ding & Keller 2006).

(23)

der als ER-abhängige Degradation bekannt ist (Vembar & Brodsky 2008). Zusätzlich zur Proteinqualitätskontrolle besitzt das UPS eine essenzielle Rolle bei anderen zellulären Prozessen, wie Regulation des Zellzyklus oder der Induktion von Apoptose (Hershko & Ciechanover 1998), was zeigt, welche zentrale Rolle das UPS innerhalb der Zelle einnimmt.

1.2

Neurodegenerative Erkrankungen

(24)

1.2.1 Proteinablagerungen

Zu extra- oder intrazelluläre Ablagerung von fehlerhaft gefalteten Proteinen kommt es durch anormale Protein-Protein-Interaktion (Jellinger 2007; Kovacs & Budka 2009) oder durch Mutationen innerhalb einer Aminosäure-sequenz. Diese Mutationen können wiederum zu Fehlfaltungen oder zur teilweisen Entfaltung des nativen Proteins führen und begünstigen häufig die Bildung von Aggregaten und sogar fibrilläre Strukturen (Morris et al. 2009; Ovadi & Orosz 2009). Vermutet wird ein Zusammenhang zwischen diesen Proteinaggregaten und den neurodegenerativen Erkrankungen über toxische Substanzen, die in den frühen Phasen der Erkrankungen entstehen und der pathogenen Rolle löslicher Oligomere von fehlgefalteten Proteinen (Skovronsky et

al. 2006; Haass & Selkoe 2007; Irvine et al. 2008; Soto & Estrada 2008; Israeli & Sharon 2009). Bei den aggregierenden Proteinen handelt es sich unter anderen um β-Amyloid, α-Synuclein, τau, Prione und polyglutaminhaltige Proteine.

1.2.2

Oxidativer Stress

(25)

Erkrankungen zu beobachten ist (Calabrese et al. 2007; Nunomura et al. 2009). So konnte beispielweise gezeigt werden, dass bei Fehlfaltungen innerhalb des Glutamatrezeptors, übermäßig ROS und NO gebildet werden (Nakamura & Lipton 2009). Proteine sind generell ein Ziel von ROS und können als Proteinradikale reduziertes Glutathion (GSH) oxidieren. GSH ist ein Tripeptid, welches in großer Zahl in den Zellen als Antioxidans vorliegt, das durch die Oxidation zum Dimer Glutathiodisulfid (GSSG) wird. Unter NADPH-Verbrauch kann das Dimer wieder zu zwei reduzierten GSH gespalten werden und wieder seine antioxidative Wirkung bereitstellen. GSSG wiederum beeinflusst die Kalziumhomeostase, Astrogliose und weitere Prozesse, wie sie bei neurodege-nerativen Erkrankungen zu beobachten sind (Bond & Greenfield 2007). Zellen, die auf diesen oxidativen Angriff nicht mit kompensatorischen Reaktionen, wie beispielsweise antioxidative Proteine, antworten können, leiten die Apoptose ein.

1.2.3 Mitochondriale Dysfunktion

(26)

führen, was letztendlich die Zelle veranlasst Nekrose bzw. Apoptose zu induzieren (Ribe et al. 2008; Celsi et al. 2009).

1.2.4

Zellulärer, axonaler Transport

Ein weiteres pathologisches Merkmal von neurodegenerativen Erkran-kungen sind die Störung des zellulären und axonalen Transports (Roy et al. 2005; De Vos et al. 2008). Der größte Teil des intrazellulären Transports findet entlang des Mikrotubulussystems statt, das über die ganze Zelle ein Netzwerk bildet. Axonale Komponenten werden im Zellkörper synthetisiert und dann über die Mikrotubuli in die axonalen Fortsätze transportiert. Erfolgt der Transport, beispielsweise von Neurofilamenten, in die Gegenrichtung wird die Energie durch Mitglieder der Kinesinfamilie zur Verfügung gestellt und durch unterschiedliche Phosphorylierungsstufen der Neurofilamente gesteuert (Morfini et al. 2006; Yates

et al. 2009). Aber auch einige pathogene Proteine, wie Amyloid Precursor Protein,

τau, Presenilin und Synuclein sind an der Regulation axonaler Transporte beteiligt (Roy et al. 2005), wodurch die wichtige Bedeutung dieser Proteine deutlich wird.

1.2.5

Charperonaktivität

(27)

Polypeptide bzw. fehlerhaft gefalteten Proteinen und verhindern die Aggregation (Chaudhuri & Paul 2006).

1.2.6

Das UPS und neurodegenerative Krankheiten

Eine Vielzahl aktueller Publikationen zeigt, dass das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) nicht nur die zuvor beschriebene physiologisch Rolle spielt, sondern auch pathologisch eine wichtige Rolle einnimmt (Layfield et al. 2005; Ding et al. 2007; Dantuma & Lindsten 2009; Lehman 2009; Tsukamoto et al. 2009). Für die neurodegenerativen Erkrankungen werden jeweils spezifische pathophysio-logische Merkmale beschrieben. Das UPS scheint dagegen sowohl bei der Alzheimer- (AD) und Parkinsonkrankheit (PD), als auch bei der Prionkrankheit und bei der Huntingtonkrankheit (HD) involviert zu sein (van Leeuwen et al. 1998b; Lim & Tan 2007; Deriziotis & Tabrizi 2008). Aber auch bei anderen Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) (Kim et al. 2009), Spinozerebelläre Ataxie (Wang et al. 2007a) Autismus (Glessner et al. 2009) und Krebs (Kaelin, Jr. 2002) finden sich Studien, die zeigen, dass das UPS eine Rolle spielt.

1.3

Ubiquitin +1

Ubiquitin B+1 (UBB+1) entsteht durch eine neue Variante der Mutation auf

(28)

die Zelle wieder abgebaut werden können. Tatsächlich wurden zwei solcher falsch transkribierter Proteine, Amyloid-Precursor-Protein +1 (APP+1) und Ubiquitin +1

(UBB+1), in neurofibrillären Faserbündeln von Alzheimerpatienten, aber auch in

humanen Proben anderer Tauopathien gefunden (Hol et al. 1998; van Leeuwen et

al. 1998b; van Dijk et al. 2004; van Leeuwen et al. 2006a; van Leeuwen et al. 2006b; van Leeuwen et al. 2006c). UBB+1 fehlt das C-terminale Gly76, welches durch 20

Aminosäuren ersetzt wird. Daher kann es nicht mehr kovalent an andere Proteine binden, wird aber als fehlerhaftes Protein erkannt und durch normales UB für die Degradation durch das UPS gekennzeichnet (Ciechanover & Brundin 2003; de Vrij

et al. 2004) (siehe Abbildung 1-3).

(29)

Wieso es zu dieser Dinucleotiddeletion kommt, ist noch nicht bekannt. Weiterhin ist unklar, welcher Mechanismus hinter der Akkumulation dieser „+1 Proteine“ steckt, bzw. wie sie bei gesunden Hirnen entfernt werden (Gerez et al. 2005). In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass z. B. APP+1 von

Neuroblastom-Zellen erfolgreich sekretiert wurde (Hersberger et al. 2001; Hol et al. 2003). Ähnliches wurde für UBB+1 bisher nicht beschrieben, allerdings konnte die

Folgen der Bildung von UBB+1 beobachtet werden: bei geringer Konzentration von

UBB+1, verhält es sich wie ein gewöhnliches Substrat des UPS und wird über den

normalen UPS-Degradationsweg abgebaut. Liegt UBB+1 allerdings in hoher

Konzentration vor, kann es das Proteasom inhibieren, zur Aggregatbildung beitragen und zum neuronalen Zelltod durch Apoptose führen (de Vrij et al. 2001; Lindsten et al. 2002; Ciechanover & Brundin 2003; van Tijn et al. 2007; van Tijn et al. 2008).

1.3.1 Das UBB

+1

-Mausmodell

Aufgrund der Entdeckung von UBB+1 in den AD-spezifischen Ablagerung

bei AD-Patienten entwickelten Fischer et al. ein transgenes Mausmodell, das UBB+1

in spezifischen Regionen des Hirns parallel zum UB exprimiert (Fischer et al. 2009). Die cDNA von UBB+1 wurde mit dem Thy1.2-Promoter bzw. mit dem

CamKIIα-Promoter in C57/Bl6-Mäuse eingeschleust, so dass die zwei unterschiedliche heterozygote Linien 8630 (Thy1.2) und 3413 (CamKIIα) entstanden. Die Autoren konnten zeigen, dass die UBB+1-mRNA zu 67% bzw. 49%

der Menge des endogenen UB entsprach und mit einer Konzentration von 1 bzw. 1,5µg/g Gesamt-mRNA im Hirn vorlag. Die Werte für die Proteinkonzentration von UB liegt Literaturwerten entsprechend bei ca. 10 mg/g (Ponelies et al. 2005), so dass vermutet wurde, dass entweder die Translation von UBB+1 sub-optimal

(30)

(Lindsten et al. 2002; Fischer et al. 2003). Die transgenen Mäuse der Linie 8630 zeigen eine UBB+1-Expression in Neuronen des Cortex und des Hippocampus,

sowie in den motorischen Neuronen des Rückenmarks. Die Linie 3414 weist dagegen eine postnatale UBB+1-Expression in den Neuronen des Cortex, des

Hippocampus, der Amygdala und des Striatums (siehe Abbildung 1-4) auf (Fischer et al. 2009). Die Expression in diesen Regionen ist spezifisch für transgene Mauslinien, die den CamKIIα-Promoter tragen (Mayford et al. 1996; Feng et al. 2000). Die transgenen Mäuse zeigen keine offensichtlichen neuropathologischen oder neurologischen Phänotypen und weisen keine PD-, HD- oder AD-typischen Pathologien, wie neurofibrilläre Faserbündel oder Plaques auf. Allerdings ist die bisher in vitro gezeigt Inhibierung des UPS in vivo in beiden Mauslinien zu beobachten, so dass auch eine erhöhte Menge an ubiquitinierten Proteinen (siehe Abbildung 1-4) im Cortex detektierbar ist (van Tijn et al. 2008; Fischer et al. 2009).

Abbildung 1-4: Sagittaler Hirnschnitt einer transgenen UBB+1

-Maus der Linie 3413. Deutlich sind die Färbungen gegen den uniquen C-Terminus des UBB+1 in Hippocampus (H), Striatum (S)

und Cortex (C) zu erkennen. (Fischer et al. 2009)

(31)

mehrtägigen Training, selbstständig eine unter der Wasseroberfläche befindliche Plattform finden müssen. Die transgenen Mäuse legen im Vergleich zu Wildtypmäusen einen deutlichen längeren Weg bis zur Plattform zurück und suchen diese unabhängig vom zuvor durchgeführten Training in allen vier Sektoren. Somit zeigt die Linie 3413 kognitive Defizite, wie sie unter anderem auch bei AD-Patienten zu sehen sind.

1.4

Proteom- und Phosphoproteomanalytik

Bei der AD zeigt sich, wie oben bereits beschrieben, dass in den AD-typischen Ablagerungen verschiedene fehlgefaltete Proteine zu finden sind. Vermutlich durch eine Dysregulation des UPS werden diese Proteine nicht mehr abgebaut und gelangen so in die Ablagerungen von AD. Da dieses auf der Proteinebene geschieht, bietet der Einsatz der modernen Proteomanalyse eine vielversprechende Möglichkeit weitere Proteine zu identifizieren, die möglicherweise an diesen Prozessen beteiligt sind.

(32)

ein komplexes Proteingemisch, in dem sich die Unterschiede in den Mengen der einzelnen Isoformen in einem Bereich von sieben bis acht Größenordnungen bewegen (Anderson & Anderson 1996). Dieses Gemisch setzt sich aus einer Vielzahl an Proteinen zusammen, die abhängig von auf den Organismus einwirkenden exogenen und endogenen Faktoren gebildet werden.

Die Proteomanalyse lässt sich weiter in Struktur-, Interaktions- und Expressionsproteomanalyse differenzieren (Fountoulakis 2004). Die Struktur-proteomanalyse befasst sich auf Proteomebene mit der Analyse der dreidimensionalen Struktur von Proteinen. Ein Ziel ist über die räumliche Struktur auf die Funktion des Proteins schließen zu können, die sich aus der reinen Aminosäuresequenz nicht ableiten lässt. Die Interaktionsproteomanalyse beschäftigt sich mit der Analyse der Protein-Protein-Interaktionen mit dem Ziel das biologische Netzwerk aller Protein-Wechselwirkungen, dem Interaktom, darzustellen. Im Rahmen der Expressionsproteomanalyse findet die differenzielle Betrachtung des Proteoms zweier oder auch mehrerer Zustände die größte Verwendung. Im Gegensatz zur Transkriptomanalyse kann hier nicht nur die Expressionshöhe bzw. –unterschiede bestimmt werden, sondern auch zusätzliche Informationen über potenzielle PTM gewonnen werden und besitzt somit im Vergleich zur Transkriptomanalyse einen höheren Informationsgehalt.

1.4.1 Massenspektrometrie in der Proteomanalyse

(33)

Proteinkomplexe mittels der MS analysiert werden können, erfolgt die Analyse in der Regel auf Peptidebene (Teramoto et al. 2007; Zhou et al. 2007; Heck 2008). Ein Massenspektrometer besteht in der Regel aus einer Ionenquelle und einem Massenanalysator, dem ein Detektor zur Aufzeichnung der Daten angeschlossen ist.

Zur Ionisierung von Biomolekülen wurden verschiedene Methoden, wie die chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI, engl. atmospheric pressure

chemical ionisation) (Lovett et al. 1979), die Elektronionisierung (EI) (Eckert-Maksic

et al. 2001), Elektrosprayionisation (ESI) (Fenn et al. 1989) und Matrix-unterstützte

Laser-Desorption/Ionisation (MALDI, engl. matrix assisted laser desorption

/ionisation) (Karas & Hillenkamp 1988) entwickelt. Allerdings finden in der

Proteomanalyse hauptsächlich die sanften Ionisierungstechniken ESI und MALDI Verwendung, die in der Gasphase intakte Peptid-, Peptidfragment- und Proteinionen produzieren. In der Regel erfolgt die Analyse auf Ebene der Peptide. Dazu werden die Proteine zuvor mit spezifischen Proteasen, wie Trypsin, verdaut und im Folgenden ionisiert.

Bei der MALDI-Technik werden die Probenmoleküle mit einer niedermolekularen Matrix co-kristallisiert, die bei der eingestrahlten Laserwellenlänge ein Absorptionsmaximum besitzt. Die lokale Energiezufuhr des Laserimpulses führt zu einem Zustand, der als pressure pulse bezeichnet wird, bei dem die Matrixmoleküle mit den Probenmolekülen wie ein Vulkan explosionsartig in die Gasphase sublimieren. Die Matrix- und Probenmoleküle, die hochgeladen sind und vom Festkörper weg expandieren, bilden einen Cluster, die MALDI-plume. Die von Karas vorgeschlagene lucky survivor-Theorie (Karas et

(34)

durch Sublimationsprozesse in einfach geladene Probenmoleküle überführt werden. Allerdings sind die meisten Details und der präzise Mechanismus der Ionisation beim MALDI-Prozess noch nicht aufgeklärt (Karas & Kruger 2003).

Bei der ESI werden molekulare Gasphasenionen durch Desolvatisierung, d. h. Transfer von Ionen aus der Lösung in die Gasphase, aus der Analytlösung erzeugt (Fenn et al. 1989). Dies ermöglicht eine direkte Analyse gelöster Peptide. Die Peptide sind in wasserhaltigen organischen Lösungsmitteln gelöst und werden unter atmosphärischem Druck in einem elektrischen Feld fein versprüht. Der gelöste Analyt wird kontinuierlich einer stromleitenden Kapillare zugeführt. Die Potenzialdifferenz zwischen der Kapillaren und dem Massenspektrometer trennt die positiven von den negativen Ladungen. Handelt es sich um den Nachweis von positiv geladenen Ionen, so fungiert die Kapillare als Anode und die Gegenelektrode am Massenspektrometer als Kathode – beim Nachweis von negativ geladenen Ionen genau umgekehrt. Die negativ geladenen Ionen werden an der Anode oxidiert, während die an der Oberfläche akkumulierten positiv geladenen Ionen weiter zur Kathode gezogen werden. Es bildet sich der charakteristische Taylor-Konus aus, der schließlich in einen filamentartigen Flüssigkeitsstrom übergeht (Taylor 1964; Ikonomou et al. 1991). Bei abnehmender Entfernung von der Kathode destabilisiert sich dieser, und es bilden sich hochgeladene Tröpfchen ( ≈ 105 Ladungen pro Tröpfchen) von wenigen

Mikrometern Durchmesser. Durch Evaporation und Coulomb-Explosionen desolvatisiert das Lösungsmittel und es entstehen gasförmige Ionen (Luttgens et

al. 1992).

(35)

nano-reversed-phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC engl. high performance

liquid chromatography) durchgeführt (Wilm & Mann 1996). Diese ermöglicht durch

die Auftrennung der Analyte nach ihrer Hydrophobizität die Analyse komplexer Mischungen.

Die MALDI-Ionenquelle ist in den meisten Fällen mit einem Flugzeit-massenanalysator (TOF, engl. time of flight) gekoppelt. Bei TOF- Massen-analysatoren wird ausgenutzt, dass das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) proportional zum Quadrat der Flugzeit ist und somit direkt über die Flugdauer bestimmt werden kann. Weitere Massenanalysatoren sind der Quadrupol (Q), die 3D- und die 2D-Ionenfalle, sowieso Ionenzyklotronresonanzanalysatoren (ICR) und Orbitraps (Griffiths & Wang 2009). Die Trennung der Ionen erfolgt in diesen durch Filterung von Ionen unterschiedlicher Masse in hochfrequenten elektrischen Wechselfeldern.

(36)

Quadrupol-Analysatoren sind die 3D- bzw. 2D-Ionenfallen (Paul & Steinwedel 1953; Prestage et al. 1990) bei denen Ionen in einem Quadrupolfeld „gefangen“ gehalten werden. Alle erwähnten Massenanalysatoren lassen sich miteinander in einem Gerät kombinieren, so dass eine Vielzahl von verschiedenen Massenspektrometern, wie Triplequadropole, Quadrupol-TOF (Q-TOF), TOF-TOF, oder Quadrupol-LIT, zur Verfügung stehen. Zwischen den beiden Analysatoren sitzt eine Kollisionszelle, die die Tandemmassenspektrometrie mit diesen Geräten ermöglicht. Die Kombination von zwei Massenanalysatoren erlaubt die räumliche Trennung von Generierung der Peptidfragmentionen und ihrer Analyse, so dass der physikalisch bedingte „blinde Bereich“ (low mass

cutt-off), der bis hoch zu 200 m/z reicht, hier nicht auftritt. Diese räumliche Trennung ermöglicht die Detektion von kleinen Massen und kann für eine Reihe unterschiedlicher MS/MS-Analysemethoden verwendet werden. Die gebräuchlichste ist die sogenannte Produktionenanalyse (product ion) bei der ein Peptid (Vorläuferion, engl. precursor ion) im ersten Quadrupol (MS1) selektiert wird, in der Kollisionszelle (q) fragmentiert und die entstandenen Peptid-fragmente im zweiten Quadrupol (MS2) gemessen werden. Eine weitere MS/MS-Analysemethode ist die Vorläuferionenanalyse (precursor ion) bei der MS2 so geschaltet ist, dass nur ein bestimmtes Peptidfragmention, wie z. B. PO−3-Ionen bei

m/z 79 (siehe 1.4.2), gemessen wird. Bei diesen Einstellungen werden nur Peptide detektiert bei denen in der Kollisionszelle ein Fragment mit dem definierten m/z-Verhältnis entsteht. Alternativ kann auch eine Neutralverlustanalyse (neutral loss) durchgeführt werden. MS1 und MS2 werden parallel mit einem bestimmten Versatz ausgewertet, z. B. 80 Da für den Verlust von HPO3 (siehe 1.4.2). Die größte

(37)

analysiert, so dass keine Zeit zur Aufnahme von überflüssigen Daten verschwendet wird und somit die hohe Sensitivität erreicht wird (Korfmacher et

al. 1991; Griffiths & Wang 2009). Wird eine Vielzahl solcher Übergänge über die Software des Massenspektrometers eingegeben, springen die elektrischen Felder der Quadrupole von einer Einstellung zur nächsten und man spricht von einem

multiple reaction monitoring.

Die Fragmentierung in der Kollisionszelle erfolgt in den meisten Fällen durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID, engl. collision-induced dissociation). Dabei entstehen durch Kollision der Peptide mit gasförmigen inerten Molekülen wie Stickstoff oder Argon typischerweise y- und b- Ionen (siehe Abbildung 1-5) die wichtige Informationen bei der Analyse von Proteinen bzw. Peptiden liefern (Roepstorff & Fohlman 1984; Biemann 1988). Für jedes Peptid bildet sich ein charakteristisches Fragmentierungsmuster, so dass die Sequenz eindeutig identifiziert werden kann.

CHR1 CO N H CHR2 CO NH CHR3 CO NH CHR4 CO NH CHR5 N2 COOH H2N CHR+ H N 2 CHR2 CO N H CHR3 CO a1 b1 c1 a2 b2 c2 a3 b3 c3 a4 b4 c4 x1 y1 z1 x2 y2 z2 x3 y3 z3 x4 y4 z4 N-terminale Ionen C-terminale Ionen y4 b3 Immoniumionen Fragmentionen

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1998 veröffentlichten Zubarev und Kollegen eine neue Methode zur Fragmentierung von mehrfachgeladenen Protein- und Peptidionen (Zubarev et al. 1998; McLafferty et al. 1998). Bei der sogenannten electron capture dissociation (ECD) wird die Fragmentierung durch eine Reaktion des mehrfachgeladenen Peptids mit einem Elektron geringer thermischer Energie erreicht. Das Peptid fragmentiert nicht wie bei der CID durch intramolekulare Vibrationen, sondern durch eine Freisetzung der elektrischen, potenziellen Energie, die nach der Aufnahme des Elektrons vorhanden ist. Die Fragmentierung erfolgt zwischen der Amidgruppe und dem α-Kohlenstoff des Peptidrückgrats, so dass c- und z-Ionen entstehen (siehe Abbildung 1-5). Da für die Erzeugung der Elektronen ein statisches Magnetfeld benötigt wird, findet ECD nur FT-ICR-Massenspektrometern Anwendung (Thingholm et al. 2009). Um eine vergleichbare Fragmentierung für andere Massenspektrometer zu ermöglichen, wurde die Elektronen-transferdissoziation (ETD, engl. electron transfer dissociation) entwickelt (Syka et al. 2004; Schroeder et al. 2005). Die Fragmentierung erfolgt hier durch Anion mit geringer Elektronaffinität, wie Anthrazen und Azobenzol, die als Elektronendonor fungieren.

1.4.2

Phosphoproteomanalyse

(39)

Histidinresten konnten sie nachgewiesen werden (Puttick et al. 2008). Allerdings ist Phosphohistidin sehr instabil, besitzt nur eine Halbwertszeit von 30 Minuten und die Analyse ist daher sehr schwierig (Sickmann & Meyer 2001).

Phosphorylierungen sind transiente, reversible Modifizierungen von Proteinen, die durch spezifische Kinasen erfolgen und zu einer Konformations-änderung des Proteins führt. Diese Änderung erwirkt innerhalb eines kleinen Zeitfensters eine Änderung der Aktivität und der Interaktion des Proteins. Da die Modifikation reversibel ist, kann sie innerhalb kürzester Zeit durch spezifische Phosphatasen wieder rückgängig gemacht werden und erlaubt eine schnelle Steuerung der Aktivität durch Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungs-reaktionen. Innerhalb eines Proteins können sich mehrere Phosphorylier-ungsstellen befinden, die durch verschiedene Kinasen phosphoryliert werden können und die Proteine daher verschiedene Funktionen innerhalb der Zelle ausüben können.

(40)

Die geringe Abundanz vieler Phosphoproteine, die geringe Phosphory-lierungsstöchiometrie und die dynamische Regulation von Phosphoproteinen machen einen besonderen Umgang mit den zu analysierenden Proben und der Anwendung von spezifischen Analysemethoden nötig. Angefangen bei der Probenpräparation bis hin zur Strategie zur Charakterisierung von Phospho-proteinen. Bereits bei der Lyse von Zellen werden sowohl Proteasen als auch Phosphatasen aktiv und degradieren die Proteine bzw. Phosphatgruppen gehen verloren. Daher sollte die Probenpräparation bei 4 °C erfolgen, um die Aktivität der Enzyme möglichst gering zu halten. Zusätzlich zu den üblichen Protease-inhibitoren wird auch eine Mischung aus verschiedenen PhosphataseProtease-inhibitoren zugesetzt. Es existieren eine Reihe von verschiedenen Klassen von Phosphatase-inhibitoren, die spezifisch die vorkommenden alkalischen und sauren Phosphatasen, sowie Serin/Threonin- und Tyrosinphosphatasen inhibieren (Thingholm et al. 2009). Zusätzlich sollten auch Kinaseinhibitoren, wie EDTA oder EGTA, zugesetzt werden um den biologischen relevanten Phosphory-lierungszustand zu ermitteln.

Die Detektion von Phosphoproteinen kann über verschiedene Techniken erfolgen. So können phosphorylierte Proteine durch 32P oder 33P radioaktiv

markiert und nach erfolgter 1D- oder 2D-PAGE autoradiografisch detektiert werden (Thingholm et al. 2009). Die Markierung mittels radioaktivem Phosphor kann sowohl in-vivo, wie auch in in-vitro erfolgen, ist aber durch endogen vorliegendes ATP nicht zu 100% gewährleistet (Steen et al. 2002). 32P ist zudem für

(41)

verwenden (Conrads et al. 2002; Thingholm et al. 2009). Eine weitere Möglichkeit zur Detektion von Phosphoproteinen besteht in der Verwendung von Antikörpern gegen Phosphoserin-, Phosphothreonin- und Phosphotyrosinresten (Kaufmann et

(42)

Fluoreszenzfarbstoffen, verwendet und auf einem Gel phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Proteine detektiert werden. Aufgrund der reversiblen Färbung kann aus diesen Gelen direkt die Lokalisierung der Phosphorylierungsstellen durch massenspektrometrische Methoden erfolgen.

Dazu werden die ausgeschnittenen Proteine zunächst tryptisch gespalten und die Peptide entweder direkt in die massenspektrometrische Analyse gegeben oder die Phosphopetide über immobilisierte Metallionenaffinitätschro-matographie (IMAC, engl. immobilized metal ion affinity chromatography), Titandioxidchromatographie (TiO2) oder über Ionenaustauschchromatographie

konzentriert (Thingholm et al. 2009). Die Sequenzierung der Peptide und Identifizierung der Phosphorylierungsstelle erfolgt mit mittels der Tandemmassenspektrometrie. Durch die geringe Ionisationseffizienz und dem Verlust der labilen Phosphatgruppe kommt es allerdings zu einer geringen Anzahl an Fragmentionen, was die Identifizierung erschwert. Das durch CID entstandene Fragmentspektrum kann typische Signale des Verlustes von Phosphorsäure (H3PO4 (98 Da)) von Phosphoserin- und Phosphothreoninresten zeigen, allerdings

erhält man nur wenig Sequenzinformationen, da der Großteil der Kollisions-energie nicht für die Peptidfragmentierung verwendet wird (Thingholm et al. 2009). Ein weiterer Neutralverlust ist an Phosphotyrosinresten mit einem Verlust von HPO3 (80 Da) zu beobachten. Allerdings ist die Bindung der Phosphatgruppe

(43)

in Triple-Quadrupol-Massenspektrometern im negativen Scanmodus nach dem Signal von PO3−-Ionen (m/z 79) gesucht wird (siehe Abbildung 1-6). Wird ein

entsprechendes Signal (m/z 79 oder m/z 216) Vorläufer-Ionen-Analyse detektiert, werden im positiven Modus die entsprechenden Peptide isoliert und Fragmentspektren aufgenommen (Carr et al. 1996; Collins et al. 2005).

Abbildung 1-6: Funktionsweise des Vorläuferion-Scans. Das m/z-Verhältnis der Ionen wird zunächst im Q1 bestimmt, bevor sie Q2 analog zu dem ermittelten Verhältnis erreichen. Im Q2 werden sie in die Produkt-Ionen zerlegt, wobei Q3 bei der Vorläufer-Ionen-Analyse so eingestellt ist, dass nur

-3

PO -Ionen mit einem m/z-Verhältnis von 79 detektiert werden.

So erhält man nicht nur Informationen über die phosphorylierte Aminosäure, sondern auch die Sequenz des Peptids. Weitere Strategien zur Detektion von Phospohopeptiden basieren auf den sanfteren Ionisierungsmethoden ECD und ETD. Die Fragmentierung erfolgt hier nur am Peptidrückgrat und labile Modifizierungen wie die Phosphatgruppen bleiben intakt. Die phosphorylierten Aminosäuren zeigen sich als c- und z-Fragmentionen im Spektrum und die Phosphorylierungsstelle kann so identifiziert werden (Stensballe et al. 2000; Kleinnijenhuis et al. 2007).

1.4.3 Differenzielle Gelelektrophorese (DIGE)

(44)

erfassten differenziellen Proteine führt dabei zur differenziellen und quantitativen Proteomanalyse. Es bedarf jedoch sehr stringenter Bedingungen beim experimentellen Aufbau einer solchen Studie. Da viele exogene Faktoren Einfluss auf das Proteom nehmen, liegt das Hauptaugenmerk einer differenziellen Analyse in der Regel auf der Betrachtung eines einzelnen Parameters, wie z. B. behandelt gegen unbehandelt oder gesund gegen krank. Die oben beschriebenen Methoden zur massenspektrometrischen Quantifizierung erfolgen in der Regel nach tryptischem Verdau, bei dem Informationen über Proteinisoformen verloren gehen können. Der dynamische Bereich der Peptide- bzw. Proteinabundanz liegt in der Massenspektrometrie bei weniger als 10³ (Timms & Cramer 2008), wohingegen der dynamische Bereich der Proteinmenge innerhalb eines Proteoms aber im Bereich von 108 – 1010 liegt (Anderson & Anderson 2002).

Eine Möglichkeit komplexe Proben besser darzustellen ist die zweidimen-sionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), die eine sehr hohe Auflösung von bis zu 10.000 Proteinen besitzt (Klose 1999). Die Auftrennung der Proteine erfolgt hier über den isoelektrischen Punkt (pI) und dem Molekulargewicht (MW) der Proteine. 1975 etablierten Klose und O’Farrell unabhängig voneinander die isoelektrische Fokussierung (IEF), bei der sich mit Hilfe von Trägerampholyten, die im elektrischen Feld einen pH-Gradienten aufbauen, die Proteine anhand ihres pI auftrennen lassen (O'Farrell 1975; Klose 1975). Im Gegensatz dazu entwickelten Görg et al. zehn Jahre später immobilisierte pH-Gradienten bei denen Immobiline in eine Gelmatrix einpolymerisiert sind (Gorg et al. 1985). Kombiniert mit der zweiten Dimension, der von Laemmli beschriebenen SDS-PAGE (Laemmli 1970), erstreckt sich der analytische Bereich von pH 3-11 und ca. 5-200 kDa.

(45)

quantifiziert. Neben den Färbungen mit Coomassie (Neuhoff et al. 1988) und Silber (Heukeshoven & Dernick 1988; Jungblut & Seifert 1990) werden auch Fluoreszenzfärbungen wie SyproRuby, SyproOrange und SyproRed (Rabilloud 1994; Yan et al. 2000) zur Visualisierung eingesetzt. Diese Farbstoffe besitzen eine Nachweisgrenze von bis zu 1 ng, decken aber auch lediglich einen dynamischen Bereich von maximal 103 ab (Stühler 2003). Die optische Detektion von

fluoreszenzmarkierten Proteinen deckt einen weitaus größeren dynamischen Bereich ab (Timms & Cramer 2008). Daher kombinierten Ünlü und Kollegen die beiden Methoden zur differenziellen Gelelektrophorese (DIGE) die eine Detektion von weniger als 1 fmol bei einem dynamischen Bereich von 105 – 106 ermöglicht,

was sie sensitiver als massenspektrometrische Methoden macht (Ünlü et al. 1997; Tonge et al. 2001; Schulenborg et al. 2006).

(46)

Daher besitzen die unterschiedlich markierten Proteine die gleichen Trenneigenschaften bei der IEF, die sich auch nicht von denen der nicht markierten Proteine unterscheidet.

Abbildung 1-7: Cy-Farbstoffe zur Markierung von Lysinresten in der DIGE. Dargestellt sind die NHS-Farbstoffe für die Kopplung an Lysinresten bei der minimal-DIGE. Angegeben sind jeweils das Molekulargewicht, die Wellenlänge des Anregungs- und Emissionsmaximums. Abbildung modifiziert nach (Timms & Cramer 2008)

Da das Molekulargewicht auch sehr ähnlich ist, co-migrieren die Proteine auch bei der Auftrennung nach ihrem Molekulargewicht. Durch die unterschiedlichen Anregungswellenlängen und Emissionsmaxima kann jede Probe ohne Einflussnahme der anderen Fluorophore nach der Auftrennung visualisiert werden. Durch die drei Farbstoffe können bis zu drei Proben gleichzeitig auf einem 2D-Gel analysiert werden, wodurch sich die Anzahl der benötigten Gele für eine quantitative Analyse reduziert. In der Regel wird NHS-Cy2 für die Markierung eines internen Standards verwendet der auf allen Gelen des Experiments aufgetragen wird (Alban et al. 2003). Er wird zu gleichen Teilen aus allen Proben gemischt und dient als Ladekontrolle zur Normalisierung der Spotvolumina und erleichtert den Vergleich über mehrere Gele, der durch Gel-zu-Gel-Variationen in Multi-Gel-Experimenten entstehen kann.

(47)

minimal-DIGE noch ca. 50 µg Protein eingesetzt werden, so kann für eine Analyse mittels

saturation-DIGE die 5 – 50fach geringere Menge eingesetzt werden

(Greengauz-Roberts et al. 2005; Sitek et al. 2006b).

Abbildung 1-8: Cy-Farbstoffe zur Markierung von Cysteinresten in der DIGE. Dargestellt sind die Farbstoffe für die Kopplung an Cysteinresten bei der saturation-DIGE. Angegeben sind jeweils das Molekulargewicht, die Wellenlänge des Anregungs- und Emissionsmaximums. Abbildung modifiziert nach (Timms & Cramer 2008)

Allerdings existiert für das saturation-DIGE kein dritter Farbstoff, so dass maximal zwei Proben auf einem Gel aufgetrennt und analysiert werden können. Dennoch hat sich diese Methode bei quantitativen Analysen sehr geringer Proteinmengen bewährt und konnte zur Darstellung des Redox-Statuses von Proteinen beitragen (Greengauz-Roberts et al. 2005; Chan et al. 2006; Hurd et al. 2007).

(48)

metabolischen Markierung erfolgt die Aufnahme von stabilen 15N-Isotopen durch

die Proteinbiosynthese (Iliuk et al. 2009). Eine Weiterentwicklung dieser Technik ist die Markierung mit stabilen Isotopen über Aminosäuren in Zellkultur, SILAC (engl. stable isotope labeling with amino acids in cell culture), die 2001 von Franza und Rochon patentiert, aber erst 2002 durch die Arbeitsgruppe von Mann bekannt wurde (Ong et al. 2002; Franza Jr. & Rochon 2003). Bei der enzymatischen Markierung mit 18O erfolgt die tryptische Proteolyse in H218O. Dabei lagern sich bis

zu zwei stabile Sauerstoffisotope an den C-Terminus des Peptids und erhöhen dadurch dessen Masse (Yao et al. 2001). Die Auswertung der massenspektrometrischen Daten dieser beiden Methoden ist nicht trivial und erfolgt über spezielle Programme, die die theoretische Isotopenverteilung berechnen (Sperling et al. 2008; Sykes & Williamson 2008; Hebeler et al. 2008). Bei den chemische Markierungsreaktionen, wie der ICPL (engl. isotope-coded protein

label), ICAT (engl. isotope coded affinity tag), iTRAQ™ (AB SCIEX) (engl. isobaric tags

for relative and absolute quantification), TMT® (Thermo Fisher) (engl. tandem mass tag)

oder ExacTag™ (PerkinElmer) werden isotopenmarkierte Moleküle wie Nicotinyl-N-Hydroxysuccinimid, Nicotinoyloxy-Succinimid oder Iodacetamid an die zu quantifizierenden Proteine bzw. Peptide gekoppelt (Gygi et al. 1999; Munchbach et al. 2000; Elliott et al. 2009). iTRAQ™, TMT® und ExacTag™ sind kommerziell

(49)

2

Z

IELSETZUNG

Ubiquitinhaltige Ablagerungen sind charakteristisch für eine Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen und lassen auf eine Beteiligung des Ubiquitin-Proteasom-Systems schließen. Bei Alzheimer Patienten konnte eine aberrante Form des Ubiquitin, UBB+1, in den Ablagerungen gefunden werden und dient als endogener Reporter für die Proteasomaktivität. UBB+1 ist in der Lage das Proteasom zu hemmen und so die Dysfunktion des Ubiquitin-Proteasom-Systems zu induzieren. In fast allen neurodegenerativen Erkrankungen kann eine Dysfunktion beobachtet werden. Daher sollen im Rahmen dieser Arbeit weitere Downstreameffekte der Expression von UBB+1 identifiziert werden. Dies erfolgt über die zwei-dimensionale differenzielle Gelelektrophorese mit folgender statistischer Auswertung und der Identifizierung der enthaltenen Proteine. Da bei den in der Literatur beschriebenen Phänotypen auch Phosphorylierungen eine Rolle spielen könnten, ist zudem eine differenzielle Analyse des Phosphoproteoms sinnvoll.

(50)

3

M

ATERIAL UND

M

ETHODEN

3.1

Geräteliste

µ-Precolumn™-Vorsäulenhalter LC Packings Dionex, Idstein, D 2D-PAGE-Kammer (24x30cm²) Desaga, Wiesloch, D

4000 Q Trap™ MS/MS System AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt,D

Abstandhalter 1,5x10x300mm³ Desaga, Wiesloch, D Aminosäurenanalyse-Fluoreszenz- detektor Multi λ 2475 Waters GmbH, Eschborn, D Aminosäurenanalyse-Trennmodul Separations Module 2695 Waters GmbH, Eschborn, D Aminosäurenanalyse-Trennsäule XBridge C18 (2,1 x 150 mm²) Waters GmbH, Eschborn, D

Analysenwaage CP225D Sartorius AG, Göttingen, D Blotting-Papier Whatman GB002 Schleicher & Schuell, Dassel, D

C18 PepMap 300 µm ID x 5 mm LC Packings Dionex GmbH, Idstein, D C18 PepMap 75 µm ID x 25 cm LC Packings Dionex GmbH, Idstein, D Elektrophoresekammer

Desaphor VA300

Desaga GmbH, Wiesloch, D

Famos™ LC Packings Dionex GmbH, Idstein, D

Gelgießstand Desaga GmbH, Wiesloch, D

Glasplatten Desaga GmbH, Wiesloch, D

Graphitelektroden, NovaBlot GE Healthcare, München, D

Heizblock HB110 GFL mbH, Burgwedel, D

IPGphor III GE Healthcare, München, D

(51)

Mörser Aachener Quarz-Glas Technologie Heinrich, Aachen, D

Multiphor II GE Healthcare, München, D

Nanospray-Quelle NanoSpray® AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt,D

Netzteil EPS 3501XL GE Healthcare, München, D Nitrocellulosemembran PROTRAN

BA-79

Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, D

Novex Gelkasetten (1,5mm), 8x8cm² Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D Odyssey Imaging System LI-COR Biosciences GmbH, Bad

Homburg, D

Pico Tip™, FS360-20-10-N New Objective, Cambridge, USA

Pistill spec.LAB, Berlin, D

Probenaufgabetrichter; sample cups GE Healthcare, München, D Reaktionsgefäße 0,5 mL, 1,5 mL Eppendorf AG, Hamburg, D Reaktionsgefäße 15 mL, 50 mL Greiner Bio-One GmbH, Essen, D

Rotor MLA 130 Beckmann Coulter GmbH, Krefeld, D

Scanner, Umax Mirage II Umax Systems GmbH, Willich, D

Schüttler Typ 3005 GFL mbH, Burgwedel, D

Schüttler Typ 3016 GFL mbH, Burgwedel, D

Superfrost plus plus Menzel Gläser GmbH & Co KG, Braunschweig, D

Switchos™ LC Packings Dionex GmbH, Idstein, D

Tischzentrifuge 5414 D Eppendorf AG, Hamburg, D

Tischzentrifuge Biofuge Fresco Heraeus Holding GmbH, Hanau, D

Typhoon Trio GE Healthcare, München, D

Ultimate™ LC Packings Dionex GmbH, Idstein, D

(52)

Ultrazentrifuge Optima Max Beckmann Coulter GmbH, Krefeld, D Umwälzkühler TC 300 Thermo Haake GmbH, Karlsruhe, D Vakuumzentrifuge 53001 Eppendrof AG, Hamburg, D

VORTEX Genius 3 Buddeberg GmbH, Mannheim, D

XCell SureLock™ Mini Cell Invitrogen, Karlsruhe, D Computerprogramme:

CorelDRAW Graphics Suite X4 Corel Corp., Unterschleißheim, D

Decyder GE Healthcare, München, D

ImageQuant GE Healthcare, München, D

Analyst 1.41 AB SCIEX Deutschland GmbH,

Darmstadt,D

Odyssey 2.1 LICOR Biosciences GmbH; Bad

Homburg,D

Proteomweaver™ Bio-Rad Laboratories GmbH, München,D

Modiro™ Protagen AG, Dortmund, D

3.2

Chemikalienliste

α-Casein, bovine, ≥ 70% Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D ε-Aminocapronsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D 1,4-Dithiothreitol (DTT) AppliChem GmbH, Darmstadt, D

2-Iodacetamid AppliChem GmbH, Darmstadt, D

3,3’-DiAminoBenzidin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D 3-[N-(Cholamidopropyl)-dimethyl-

ammonio]-1-propansulfat (CHAPS)

SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, D

AccQ Tag Eluent A Waters GmbH, Eschborn, D

AccQ Fluor Derivatisierungs-reagenz Waters GmbH, Eschborn, D

Acetonitril Biosolve BV, Valkenswaard, NL

(53)

Aggarose Merck KGaA, Darmstadt, D

Ameisensäure Merck KGaA, Darmstadt, D

Ammoniumhydrogencarbonat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D Ammoniumpersulfat Bio-Rad Laboratories GmbH, München,D

Ammoniumsulfat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Bromphenolblau Bio-Rad Laboratories GmbH, München,D

Complete Mini™ Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, D

Coomassie Brillantblau G-250 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Dimethylbenzen Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Dimethylformamid (DMF) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Essigsäure Merck KGaA, Darmstadt, D

Ethanol MEK vergällt Chemikalienlager, Ruhr-Univ. Bochum Ethylendiamintetraessigsäure-

dinatriumsalzdihydrat (EDTA)

Merck KGaA, Darmstadt, D

Fluorophore Cy2, Cy3, Cy5 GE Healthcare, München, D Formaldehydlösung 37%, säurefrei Merck KGaA, Darmstadt, D

Gelatine Merck KGaA, Darmstadt, D

Glycerin Merck KGaA, Darmstadt, D

Glycin AppliChem GmbH, Darmstadt, D

Harnstoff, p.a. Merck KGaA, Darmstadt, D

IPG-Puffer pH 3-10 GE Healthcare, München, D Isopropanol, 99,5% J. T. Baker BV, Deventer, NL

Kaliumhexacyanoferrat (III) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D Lithiumdodecylsulfat (LDS) AppliChem GmbH, Darmstadt, D

Lysin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Methanol Merck KGaA, Darmstadt, D

Mineralöl (Cover Fluid) GE Healthcare, München, D

N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Bio-Rad Laboratories GmbH, München,D

(54)

Natriumcarbonat Merck KGaA, Darmstadt, D

Natriumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Natriumdodecylsulfat (SDS) AppliChem GmbH, Darmstadt, D

Natriumfluorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Natriumorthovanadat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D Natriumthiosulfat-Pentahydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D Nickelammoniumsulfat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Norleucin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Okadasäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Phenolrot, p.a. Merck KGaA, Darmstadt, D

Phosphorsäure 85% Merck KGaA, Darmstadt, D

ProQ Diamond Phospho Stain Invitrogen, Karlsruhe, D

Salzsäure J.T. Baker BV, Deventer, NL

Servalyte pH 4-7 SERVA Electrophoresis GmbH,

Heidelberg, D

Silbernitrat, p.a. Merck KGaA, Darmstadt, D

Starting Block Perbio Science GmbH, Bonn, D

Thioharnstoff, p.a. Riedel de Haën GmbH, Seelze, Hannover,D

Tricin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Trifluoressigsäure (TFA) Merck KGaA, Darmstadt, D Tris(hydroxymethyl-)aminomethan

(Tris Base)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Tris(hydroxymethyl-)aminomethan- Hydrochlorid(Tris HCl)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Triton X-100 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Trypsin Promega GmbH, Mannheim, D

Wasserstoffperoxid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

Xylol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,D

(55)

3.3

Probenaufarbeitung

3.3.1

Präparation der Maushirne

Die benötigten Cortices stammen von C57/Bl6-Mäusen der Linie 3413, die von Herrn Prof. Dr. van Leeuwen nach erfolgter Genotypisierung bereitgestellt wurden. Die Cortices werden nach der Präparation in flüssigem Stickstoff schockgefroren und im Anschluss bei -80°C gelagert.

3.3.2 Proteinextraktion aus den Cortices

Der Cortex wird zusammen mit 150 µL DIGE-T-Pufer unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff 5 min gemörsert und das fein geriebene Pulver im Anschluss für 30 min bei 4 °C geschüttelt (2.500 min-1, VORTEX Genius 3, Buddeberg,

Mannheim, Deutschland). Das Homogenat wird 30 min bei 220.000 × g (4 °C) zentrifugiert (Ultrazentrifuge Optima Max, Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland; Rotor: MLA 130, Beckman Coulter GmbH) und der Überstand abgenommen. Das Sediment wird erneut gemörsert und geschüttelt. Der Überstand nach der Zentrifugation wird mit dem ersten vereinigt, in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei -80 °C gelagert.

DIGE-T-Puffer: 7 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 4 % CHAPS 30 mM Tris 2 mM Natriumorthovanadat 1 µM Okadasäure 50 mM Natriumflourid

(56)

3.4

Proteinmengenbestimmung mittels Aminosäureanalyse

Aufgrund der hohen Harnstoffkonzentration wird die Probe 1:40 verdünnt. 5 µL dieser Verdünnung wird im Vakuumkonzentrator bis zur Trockne eingeengt und mit 400 µL 6 M Salzsäure und einem Kristall Phenol bei 150 °C in einer Stunde hydrolysiert (saure Gasphasenhydrolyse). Nach Abkühlung auf Raumtemperatur werden die Proben in 10 µL 20 mM Salzsäure gelöst und 30 µL AccQ-Fluor-Boratpuffer (Waters GmbH, Eschborn, Deutschland) mit Norleucin als internem Standard, sowie 10 µL AccQ-Fluor-Derivatisierungsreagens zugefügt und bei 55 °C für 10 min inkubiert (Strydom & Cohen 1994). Die Auftrennung der derivatisierten Aminosäuren erfolgt chromatographisch mittels einer reversed-phase Säule (Novapak RP18 (2,1 mm ID x 150 mm Länge (Waters GmbH, Eschborn, Deutschland) und einem Fluss von 300 µL/min innerhalb von 60 min. Das verwendete Gradientensystem (siehe Tabelle 3-1) setzt sich aus drei Lösungsmitteln zusammen: Lösungsmittel A ist ein Natriumacetatpuffer (pH 5,0, AccQ-Tag™ Eluent A), Lösungsmittel B besteht aus 100% (v/v) Acetonitril und Lösungsmittel C ist Reinstwasser.

Tabelle 3-1: Ternärer Gradient zur Aminosäurenanalyse

Zeit/min % Lösungsmittel A % Lösungsmittel B % Lösungsmittel C

0,5 99 1 0 24 95 5 0 29 91 9 0 39,5 83 17 0 48 0 60 40 51 100 0 0 60 100 0 0

(57)

Aminosäurezusammensetzung bzw. der Proteinmenge erfolgt über die Peakflächen der einzelnen Aminosäuren mittels der Software Millenium32 Version 4.00 (Waters

GmbH, Eschborn, Deutschland), wobei die Fläche des derivatisierten Norleucins als Referenz dient.

AccQ-Fluor-Derivatisierungsreagens:

10 mM Chinolin-6-yl-carbaminsäure-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ester in Acetonitril

3.5

Differenzielle Gel-Elektrophorese (DIGE)

Die Analyse der Cortex-Zelllysate erfolgt unter Verwendung der „Differenziellen Gel Elektrophorese“ (DIGE). Die Methode wurde gewählt, da sie die simultane Auftrennung eines internen Standards, der Wildtyp- und transgenen Cortex-Zelllysaten innerhalb eines Gels ermöglicht, sowie eine hohe Sensitivität bei der Visualisierung besitzt. Auch der hohe dynamischer Bereich von fünf bis sechs Zehnerpotenzen (Lilley & Friedman 2004) unterstützt die Wahl dieser Methode.

3.5.1 Markierung der Proteine mit Fluoreszenzfarbstoffen

(58)

3.5.2 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Auftrennung der komplexen Proteinlysate erfolgt zunächst nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI), bei dem die Proteine entlang eines pH-Gradienten bis zu dem pH-Wert migrieren, an dem ihre Nettoladung null beträgt. In der zweiten Dimension erfolgt die Trennung über die SDS-PAGE nach der elektrophoretischen Mobilität (Laemmli 1970).

3.5.2.1 Isoelektrische Fokussierung

(59)

Tabelle 3-2: Spannungsverlauf der IEF (24 cm Streifen)

Zeit/h Schritt Spannung/V

6 Halten 100 1 Gradient 500 3 Halten 500 1 Gradient 1.000 2 Halten 1.000 2,5 Gradient 6.000 16 Halten 6.000 max. 75 mA ∑~110 kVh

Tabelle 3-3: Spannungsverlauf der IEF (7 cm Streifen)

Zeit/h Schritt Spannung/V

2 Halten 100 1 Gradient 500 1 Halten 500 0,5 Gradient 1.000 1 Halten 1.000 4 Halten 4.500 max. 50 mA ∑~20 kVh Rehydratisierungspuffer: 8 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 2 % (w/v) 3-[(Cholaminopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) 2 % (v/v) IPG-Puffer, pH 3-10 100 mM Dithiothreitol (DTT)

3.5.2.2

SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Abbildung

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