Sz en t Is tv án E gy et em
metszeteket készítette. Továbbá köszönömDr. Bartyik János (EnyingiAgrárRt), f!állatorvosnak,hogylehet!vétette a biopsziás mintavételeket szarvasmarhákból, ésDr.Bajcsy Árpád Csabának (Szülészeti és Szaporodásbiológiai Tanszék és Klinika), hogy segítségünkre volt a biopsziás mintavételi eljárás kidolgozásában.Á lla to rv os -t ud om án yi D ok to ri I sk ol a A n eo na ta lis F c re ce pt or ( F cR n) gé ne xp re ss zi ój án ak s zö ve ti lo ka liz ác ió ja kü lö nb öz ! él ett ani stádiumú kér ! dz ! kb en P hD é rt ek ez és t éz is ei K és zí te tt e: M ay er B al áz s 20 05 16
Szent István Egyetemin fetal and neonatal piglets. VIII. Colonization is required for newborn piglets to make serum antibodies to T-dependent and type 2 T-independent antigens.J Immunol. 169, 6822-6830.
Állatorvos-tudományi Doktori Iskola Témavezet! és témabizottsági tagok:
K ös zö ne tn yi lv án ítá s
Szeretnékköszönetetmondanitémavezet!mnek,Dr. Frenyó V. Lászlónak, aki mindvégigmellettemálltés támogatta munkámat.Dr. Frenyó V. László, PhD egyetemi tanár SzIE, ÁOTK, Élettani és Biokémiai Tanszék Különösenhálás vagyokkonzulenseimnek,Dr. Kacskovics ImrénekésDr.Jancsik Veronikának, akik bevezettek a molekuláris-biológiai illetve szövettani vizsgálati módszerek világába. A kísérlettervezés, a laboratóriumi munka ésa publikációk írása során szintén sokat tanultamt!lük. Köszönöm a sokrét" segítséget kollégan!imnek,Dr. Zolnai Annának és Dr. KisZsuzsannának, valamint kollégámnak Doleschall Mártonnak. Hálával tartozom asszisztenseinknek MéhesÁgnesnek,Horn Ilonának és Bíró Zsoltnaka laboratóriumban nyújtott kiválótechnikai segítségért. Hálás vagyokazÉlettani ésBiokémiai Tanszékösszes munkatársának.
Dr. Kacskovics Imre, PhD tudományos f!munkatárs SzIE, ÁOTK, Élettani és Biokémiai Tanszék Dr. Jancsik Veronika, PhD egyetemi magántanár SzIE, ÁOTK, Anatómiai és Szövettani Tanszék Készült 8 példányban. Ez a 8. sz. példány. Mayer Balázs 15
Köszönet illeti MészárosÁgnest(Országos ÁllategészségügyiIntézet), aki a paraffinosszövettani 2
E l ! zm én ye k
bovine mammary gland around the time of parturition. J Dairy Res. (in press) Az újszülött immunrendszere a megszületést követ! hetekben meglehet!sen fejletlen éséppen ezért nemtud hatékonyan részt venni a fert!zések megakadályozásában. Ezt az id!leges védelmi hiányt pótolják az anya immunrendszere által termelt ellenanyagok, amelyek a kórokozók széles spektrumával szemben nyújtanak specifikus védelmet. Anyai, vagymaternalis immuntranszportnak nevezzükazt a folyamatot, amelyneksorán azanyajelent!s mennyiség" immunglobulin„átadásával”biztosítja azújszülött életben maradását az élet els! id!szakában. Ezt a rendszert végs! soron egyfajta„immunológiai tapasztalat”közvetítésének is felfoghatjuk, hiszen az anyában olyan ellenanyagok találhatók, amelyeket a környezetében található kórokozókkalszemben termelt. Minthogy az újszülött természetes élettere megegyezik azanyáéval, azilymódonnyert „tapasztalat” hatásos az újszülöttet fenyeget!kórokozók semlegesítésében is. Az evolúciósorán többfélemechanizmusalakult ki, amely lehet!véteszi, hogyazanyai ellenanyagokátkerüljenek az újszülöttbe, és ezzel passzív védettséget biztosítsanak a kezdeti id!szakban, mindaddig, amíg a fiatal szervezet immunrendszere védekezni képes a fert!zésekkel szemben.Referált magyar nyelv" folyóiratokban megjelent közlemények: Mayer B., Zolnai A., Frenyó V. L., Jancsik V., Szentirmay Z., HammarströmL. ésKacskovics I.2004. Amaternalis immunitás átadása kér!dz!kben. Magyar Állatorvosok Lapja 126. 31-38. Kis Zs., Mayer B., Juhász V., Doleschall M., Frenyó V. L., Kacskovics I.2004. AszarvasmarhaneonatalisFc- receptorának(bFcRn)t!gybeli expressziója és IgG-köt! képessége.Magyar Állatorvosok Lapja 126. 598-605.
E gy éb k öz le m én ye k
Referált angol nyelv" folyóiratokban megjelent közlemények: Butler, J. E., Weber, P., Sinkora, M., Baker, D., Schoenherr, A., Mayer, B., Francis, D., 2002. Antibody repertoire development 314A z ér te ke zé s al ap já ul s zo lg ál ó kö zl em én ye k
Kér!dz!k eseténa maternalis (anyai) immunanyagok átadása kizárólag a kolosztrális immunglobulin-transzfer révén valósul meg. Szarvasmarhában azellés el!ttpár héttel jelent!sen lecsökken a vér immunglobulin(Ig)G1 koncentrációja, és az IgG1 szelektív transzporttal jut az anyai keringésb!l a kolosztrumbaa t!gyacinusepithel sejtjein keresztül. Az újszülött állat vékonybelében az immunglobulinok felvétele nem-specifikus folyamat, de kés!bb ezt egy IgG1 specifikus transzport követi, amely a felvett IgG1- et visszajuttatja a crypta sejteken keresztül az újszülött állat vékonybél lumenébe, ahol az a fert!zések elleni védelemben játszik szerepet. A t!gy és a vékonybél mellett más szervek (például a tüd!) és szövetek nyálkahártyával borított felszínein isjelent!s mennyiség"IgG1 található a szekrétumban. Kér!dz!kben, a nyálkahártyák váladékában az IgA mellett az IgG1 a legjelent!sebb immunglobulin, amit az is alátámaszt, hogy az IgA-hoz hasonlóan jobban ellenáll a proteolízisnek, mint az IgG2.Referált angol nyelv" folyóiratokban megjelent közlemények: Mayer, B., A. Zolnai, L. V. Frenyo, V. Jancsik, Z. Szentirmay, L. Hammarstrom and I. Kacskovics. 2002. Localization of the sheep FcRn inthe mammary gland.VetImmunol Immunopathol 87, 327-330. Mayer, B., A. Zolnai, L. V. Frenyo, V. Jancsik, Z. Szentirmay, L. Hammarstrom and I. Kacskovics. 2002. Redistribution of the sheep neonatal Fc receptor in the mammary gland around the time of parturition in ewes and its localization in the small intestine of neonatal lambs. Immunology 107, 288-296. Mayer, B., Z. Kis, G. Kajan, L. V. Frenyo, L. Hammarstrom and I. Kacskovics. 2004. The neonatal Fc receptor (FcRn) is expressed in the bovine lung. Vet Immunol Immunopathol 98, 85-89.Bár az IgA epithel sejten keresztül történ! transzportját márjellemezték,ésa közrem"köd!polimerIgreceptort azonosították, az a mechanizmus, amelynek segítségével az IgG az epitheliális barrieren keresztül halad, nem ismert. Mayer, B., L. V. Frenyó, J. Bartyik, B. Bender, Z. B!sze and I. Kacskovics. Expression of neonatal Fc receptor (FcRn) in the 4 13
A bovin FcRn jelenléte a kapilláris endothel sejtekben arra utal, hogy a receptornak az egér és a humán receptor funkciójával megegyez!en a szarvasmarhában is szerepe van az IgGhomeosztázisának biztosításában.Aveseproximális tubulus epithel sejtjeibenexpresszálódó FcRn feladata feltehet!en – a humán vesében kifejez!d! FcRn-hez hasonlóan – a sz"rletbe került kis mennyiség" IgG molekula megkötése, és visszajuttatása a vérkeringésbe.
Az IgGtranszportjában újszülött egerek, patkányok vékonybelében ésazemberiplacentában a neonatalisFc receptor(FcRn)veszrészt. Az FcRn egy MHC(major histocompatibility complex) I típusú glikozilált!-láncból és "2-mikroglobulinból áll. Az FcRn az IgG molekulát pH-függ! módon köti (pH 6.0 -kötés, pH 7.5 -disszociáció). Az epithel sejtekenkívül endothelsejtekben isleírták a receptor expresszióját. Az endothel sejtekben kifejez!d! FcRn az IgG homeosztázisának fenntartásában játszik szerepet, megköti az IgGmolekulákat, ésmegvédiazokata lizoszómális degradációtól.
Az FcRn expressziószintjénekváltozásárólvagyaz expressziószabályozásáról kevés ismeretanyag áll rendelkezésre.Areceptor!-lánc promoterszakaszának elemzését több kutatócsoport, köztük a mi munkacsoportunk is megkezdte, mivel a génexpresszió szabályozásának pontosabb ismerete ésbefolyásolása azalapkutatás szempontjából is érdekes, és a klinikum számára is sokféle lehet!séget adhat. A jöv!belikutatások eredményeképpen, a kér!dz!FcRn génexpressziójánakésezenkeresztül azIgtranszportnak a befolyásolása révén elképzelhet!nagymennyiség"állati eredet"Igvagytranszgénikus állatbantermelt humánIg el!állítása állatorvoslási, illetve emberi gyógyászati célokra.
Kacskovics és munkatársai (2000) korábban klónozták és karakterizálták a szarvasmarhaFcRn-t, ésexpresszióját Northern blottal kimutatták számos szövetb!l, köztük a t!gyb!l ésa vékonybélb!l is. Disszertációma kér!dz!k FcRn expressziójának szöveti lokalizációját elemzi. Vizsgálataink során arra kerestük a választ, hogy a receptor epithel vagy endothel sejtekben expresszálódik-e a t!gyben, vékonybélben, tüd!ben,valamint a vesében;éshogyanváltozikaz expressziója a t!gyben az IgG transzport idején, illetve mi lehet a szerepe az IgG szekréciójában. 12 5
C él ki t " zé se k
ezaza receptor, amely azepithelialisIgG1 szekrécióban szerepetjátszik.Azonbanfeltevésünktovábbi vizsgálatot igényel, amely arrairányul, hogyazIgG1 ésIgG2 FcRn receptorhoz való kötésének affinitását elemezze.#A juh FcRn !-lánc cDNS klónozása és jellemzése #Az FcRn !-lánc mRNS detektálására alkalmasin situ hibridizációs módszer kidolgozása transzfektált sejteken és szöveti metszetekenAmi a második feltételt illeti, mind a szarvasmarha, mind a juh FcRn !-lánca az eddig ismert szekvenciáknál rövidebb. Mesterségesen csonkolt patkány FcRn-nel végzett transzport kísérletek alapján feltételezhet!, hogy a kér!dz!knél a mintegy 10aminosavmaradékkal rövidebbcitoplazmikusfarokrész okozzaa sejtenbelüliIgGtranszportbazolaterális-apikális irányultságát, deezt a feltevést kísérletekkel mégnem támasztották alá.Ezenkívüla kér!dz!kbena citoplazmikus farokrész triptofán motívuma a patkány triptofán motívumtól eltér!. A szekvenciális különböz!ségek IgG transzportra vagy endocitózisra valóhatásának elemzéséhez további kísérletes eredmények szükségeltetnek.
#Az FcRn !-lánc mRNS lokalizációja szarvasmarha és juh t!gy, valamint szarvasmarha tüd! metszeteken #FcRn !-lánc specifikus ellenanyag el!állítása #Az FcRn !-lánc lokalizációjára alkalmas immunhisztokémai metodika létrehozása #FcRn fehérje kimutatása szarvasmarhaésjuh t!gy, szarvasmarha és újszülött bárány vékonybél valamint szarvasmarha tüd! és vese metszeteken #Az FcRn gén t!gyszöveti expressziójának lokalizációja és a lokalizáció változásainak jellemzése az ellés körüli id!ben Az FcRn kifejez!dése a t!gy és vékonybél mellett egyéb szövetek epithel sejtjeiben, mint az általunk vizsgált légutak hámja, felveti egy mostanáig nagyrészt figyelmen kívül hagyott IgG1 ellenanyagokat szekretáló rendszer létét a kér!dz!kben, amely a nyálkahártyák felszínének fert!zés elleni védelméhez járul hozzá.
#Az acinus sejtek pH-függ! IgG kötésének detektálása t!gy szöveti metszeten 6 11
A ny ag é s m ód sz er
9.Immunhisztokémiai módszerrel kimutattuk a szarvasmarhavékonybél lamina propria kapilláris endothel sejtjeiben és a vese proximális tubulus epithel sejtjeiben az FcRn #-lánc expresszióját.Ajuh FcRn cDNS-ta márismert szarvasmarha szekvenciára tervezett primerek segítségével, illetve 3’ RACE (rapid amplification of cDNA ends) technikával klónoztuk. A bovin és ovin FcRn !-lánc mRNS kimutatására PCR módszerrel el!állított, egyszálú, digoxigeninneljelöltcDNS próbákat használtunk. A transzfektált sejtekben és a szöveti metszeten az mRNS-hezin situ hibridizációval köt!d! próbát alkalikus foszfatázzal kapcsolt anti-digoxigenin ellenanyaggal detektáltuk. Az anti-digoxigenin ellenanyaghoz kapcsolt alkalikus foszfatázenzimetNBT/BCIPszubsztrátoldat hozzáadásával mutattuk ki.
K öv et ke zt et és ek
A kér!dz!k szérum-kolosztrum irányú IgG transzportban résztvev!receptoránakkét feltételnek kellmegfelelnie. 1.) szelektíven köti és/vagy transzportálja az IgG1 molekulát, 2.) bazolaterális-apikális irányú transzportot közvetít. Az els! feltételhez közvetett bizonyítékkal szolgál az a megállapítás, hogy az FcRn-t olyan epithel sejtekb!l mutattuk ki, amelyekben immunhisztokémiai módszerrel szintén detektálták azIgG1-et. Areceptor!-láncának mRNS expressziója megfigyelésünk szerint nem változik lényegesen azacinusepithel sejtekben azellés környékén, ami összhangban van azzal az irodalmi adattal, amely a t!gyben az !-lánc expressziójának konstansszintje melletta "2- mikroglobulinmRNSszint növekedését állapítja mega maternalis IgGtranszfer idején. Areceptorfehérje acinus sejteken belüli lokalizációjának szembet"n! változása és az újszülött bárányésfeln!ttszarvasmarhavékonybél crypta sejtjeiben detektált FcRn apikális elhelyez!dése arra utal, hogy Az FcRn specifikus ellenanyag el!állítására az FcRn !- lánc egy szakaszának (melynek aminosavsorrendje juhnál és szarvasmarhánál megegyezik)megfelel!, szintetizált oligopeptiddel nyulakat immunizáltunk. Az anti-szérumot Sulfolink gél tartalmú affinitásoszlopon tisztítottuk, és Western blottal teszteltük. Az immunhisztokémiai módszernél az affinitás-tisztított szérumot, biotinnal jelölt anti-nyúl antitestet ésavidin-biotinperoxidáz komplexkitet használtunk. Színszubsztrátként 3,3’-diaminobenzidint alkalmaztunk. Az in situ hibridizációhoz és az immunhisztokémiához a szövetmintákat vágóhídrólszereztük be, vagyautomata 10 7biopsziás készülékkel vettük azokatellés körüliid!ben.A mintákat paraformaldehidben fixáltuk, és paraffinba ágyaztuk, majd a paraffin blokkokból szövettani metszeteket készítettünk. A receptor pH-függ! IgG kötését a metszetek felületén citrátos antigén feltárás után, cianin 2 (Cy2)-vel jelölt bovin IgGhozzáadásával vizsgáltuk. AjelöltIgGköt!dését fluoreszcens mikroszkóppal értékeltük.
