Általános Genetika
Mutációk
A genetikai változatosság okai: rekombináció és mutáció Mutációk = öröklődő változások
vad típus mutáns
mutáns allél, mutáns fehérje, mutáns sejt, mutáns egyed
A mutációk jelentősége
A legtöbb allél génmutációval keletkezik, és a természetes populációk genetikai változatosságának forrása.
Az új allélek adják azt a nyersanyagot, amelyből az evolúció a szelekció útján kiválogatja a legalkalmasabbakat.
A modern genetikában a mutációkat a gén szerepének tisztázására
használjuk. Minden genetikai boncolás mutánsok gyűjtésével vagy előállításával kezdődik.
A mutáns allélek mint markerek magának a mutációs eseménynek a
tanulmányozására is felhasználhatók.
Pontmutációk: nem lehet kimutatni hagyományos citogenetikai eszközökkel. Ezek általában egy gént érintenek (génmutáció)
Kromoszóma-mutációk: több gént, akár teljes kromoszómákat érintenek.
Legtöbbször a kromoszómák szintjén kimutathatók.
A mutációk csoportosítása az érintett DNS-régió
nagysága szerint
Előremutató (forward) mutáció, ekkor az eredetitől (vad típustól) eltérő változat keletkezik.
Visszamutató (reverse vagy back) mutáció, ez az eredeti (vad) genotípus vagy fenotípus visszaállását eredményezi.
A visszaállás többféle módon történhet:
pontos reverzióval, amikor az eredeti nukleotidsorrend helyreáll,
egyenértékű reverzióval, amikor az új nukleotid az eredetitől különbözik, de hatására az eredeti funkció helyreáll,
génen belüli szupresszor mutációval, amikor ugyanabban a génben egy második mutáció kompenzálja az első mutáció hatását,
génen kívüli szupresszor mutációval, amikor egy másik génben megjelenő új mutáció kompenzálja az első mutáció hatását.
A mutációk csoportosítása a változás iránya
szerint
Génen belüli szuppresszió
bázikus semleges
aromás bázikus
Egy bizonyos fehérje biológiai
aktivitásához szükséges konformációt egy Glu-Arg aminosav kölcsönhatás tartja
fenn.
Ha egy mutáció az Arg aminosav cseréjét eredményezi (pl. glutaminra), az a fehérje funkció elvesztéséhez, és ezért fenotípus változáshoz vezet.
Ha az eredeti Arg aminosav közelében egy újabb mutáció bázikus aminosavat (pl. Lys) hoz létre, az képes lehet a
fehérje biológiai aktivitását helyreállítani.
Ez fenotípus reverzióhoz vezet.
Eredeti vad típus
Amber (Stop) mutáció
Amber
AUG AUC
Génen kívüli szuppresszió
tRNS mRNS
A mutációk szövettípus szerinti csoportosítása
Szövetes szerveződésű élőlényekben
Szomatikus vagy testi sejtekben keletkező mutáció Mutáns sejtklón, szektor
(száma - hányszor, mérete – mikor) Mozaikos egyed
Csíravonalban keletkező mutáció
Ee × ee
fekete szülő x sárga szülő utódok: Ee feketék
ee sárgák
és foltos: e > E szomatikus back mutáció
A szomatikus mutációk mozaikos fenotípust okoznak
A mutációt szenvedett testi sejtek utódai klónt alkotnak, és gyakran a többi sejttől elkülöníthető mutáns szektorként jelennek meg. A
mutáns szektor mérete fordítva arányos a mutáció bekövetkezésének idejével.
A szomatikus és csíravonal sejtek mutációi
A természetben megfigyelhető változatosságot a csíravonal mutációk hozzák létre.
10
A mutációk fenotípus szerinti csoportosítása
Morfológiai (alaktani) mutációk
minden olyan mutáció, amely az egyed morfológiáját (kinézetét) befolyásolja Letális (halálos) mutációk
a leggyakrabban homozigóta formában vezetnek letalitáshoz Anyagcsere-mutációk
Auxotróf mikrobák
Ember veleszületett anyagcsere rendellenességei (például fenilketonúria, galaktozémia) Viselkedési mutációk
Az állatok (és az ember) viselkedése jelentős részben genetikailag meghatározott, ezért azt mutációk megváltoztathatják
Pl. a muslica udvarlási viselkedése megváltozhat akár a szárnyizmokat, akár azok beidegzését, akár az idegközpont szerkezetét befolyásoló mutációkkal.
Kondicionális (feltételes) mutációk
A kondicionális mutáció csak bizonyos környezeti feltételek, restriktív, azaz korlátozó
A mutációk csoportosítása a génműködés megváltozása szerint
Funkcióvesztéses mutációk (loss of function, LoF)
A DNS véletlenszerű változásának leggyakoribb következménye a génműködés sérülése. Ekkor a kódolt fehérje eredeti működése gátlódik vagy elvész.
- ha génműködés teljesen kiesik, „nulla allél” jön létre
- ha a vad típusú funkcióból valamennyi megmarad, azt homozigóta formában leaky (sánta) fenotípus jelzi
A funkcióvesztéses mutációk általában recesszívek (a gén egyetlen sértetlen példánya a vad fenotípus kialakításához elegendő terméket termel).
Domináns is lehet, ha:
- egyetlen ép génpéldány nem elegendő a vad fenotípus kialakításához (haplo- elégtelenség, haplo insufficiency)
- domináns negatív mutációk (a vad alléllal szemben mutatott dominancia oka az, hogy a funkció-vesztett géntermék gátolja az ép géntermék működését)
Funkciónyeréses mutációk (gain of function, GoF) Megváltozott működés (új funkció vagy fokozott aktivitás)
Általában domináns a vad alléllal szemben 12
Mi mozgatja az örökítő anyag természetes megváltozását?
Erre a kérdésre 1943-ig két egyenértékű magyarázat létezett.
1. A környezet változása kiválthatja a hozzá alkalmazkodó formák (változatok) megjelenését.
2. Az öröklődő változatok véletlenszerűen a környezettől függetlenül jelenhetnek meg.
Salvadore Luria és Max Delbrück 1943-ban végzett „fluktuációs teszt”
kísérlete azt igazolta, hogy a második magyarázat a helyes.
A fluktuációs teszt
Az Escherichia coli egyik fágja a T1 fág.
Ha egy baktérium táptalajt tartalmazó lemezre sok (10
9) baktérium és T1 fág keverékét szélesztjük, a fágok az összes baktériumot elpusztítják. Ilyen körülmények között nem tapasztalunk baktérium növekedést. Ritkán
azonban egy-egy fágnak ellenálló (rezisztens) telep nő ki. A rezisztens telep sejtjei egyetlen rezisztens sejt leszármazottai, tehát a rezisztencia öröklődik.
A két lehetséges magyarázat:
1. A rezisztenciát a fág jelenléte váltja ki kis gyakorisággal valamilyen élettani változáson keresztül.
2. A rezisztencia a fágoktól független mutációval jön létre.
A fluktuációs teszt kísérlet
Ha a rezisztenciát a fágok váltják ki, akkor minden baktérium csekély, de azonos valószínűséggel rezisztenssé válhat a fág hatására, ez azonban csak a szélesztés után történhet. Ekkor a rezisztens sejtek száma csakis a baktériumok és a fágok számától függ.
Így azonos baktérium és fágszám mellett minden tenyészetben hasonló
1. Adaptáció, a rezisztenciát a fág jelenléte váltja ki
Amennyiben a rezisztencia a fágoktól független véletlen mutációk eredménye, akkor annak megjelenése a fággal való találkozás előtt, a kémcsőben rázatás során
következik be, és a növekedés korai és késői stádiumában egyaránt bekövetkezhet.
Ha korán következik be, akkor a tenyésztés végére sok, ha későn következik be, akkor kevés rezisztens utód sejt lesz a tenyészetben. Más szóval a rezisztensek száma azonos baktérium és fágszám mellett is tenyészetenként változik, „fluktuál”.
2. A rezisztencia a fágoktól független véletlenszerű
mutációval jön létre
A fluktuációs teszt eredménye
A nagy kultúrából szélesztett
baktériumok között a rezisztensek száma minden petricsészében
közel azonos.
A külön-külön növesztett
baktériumkultúrák a rezisztens telepek számában jelentős
eltéréseket mutatnak.
A rezisztencia létrejötte tehát a
fágoktól független véletlen
mutációk következménye.
Joshua és Esther Lederberg által kifejlesztett „replica plating” technika
A rezisztens sejtek fágszelekció előtti jelenléte
közvetlenül is kimutatható
Mutációs ráta (mutációs sebesség)
Azonos időegység alatt bekövetkező mutációk száma.
Biológiai időegységként általában egy élőlény generációs idejét
használjuk, vagy sejtosztódásokra normalizáljuk az újonnan létrejött mutációk számát.
Pl. az ábra példáján a mutációs ráta 1/7 sejtosztódás.
1
2 3
4 5 6 7
Mutációs gyakoriság
A mutációs gyakoriság az az arány, amivel egy bizonyos mutáció a sejtek vagy egyedek egy
vizsgált populációjában előfordul.
Pl. az ábra példáján a mutációs gyakoriság az utolsó sejt generációban 2/8 = 0,25
A nagyobb mutációs ráta nagyobb
mutációs gyakoriságot eredményez.
A mutáns allélok keletkezésének
molekuláris alapjai
1. Kromoszóma szintű mutációk számbeli
szerkezetbeli
2. Pontmutációk
egy vagy néhány bázis:
- cseréje - kiesése
- beékelődése
A pontmutáció érintheti egy gén kódoló szakaszát vagy szabályozó régióját
A báziscsere típusai
Tranzíció
purin csere purinra AG, GA
pirimidin csere pirimidinre TC, CT
Transzverzió
purin csere pirimidinre AT AC GT GC vagy pirimidin csere purinra CG CA
a változás a következő replikáció során rögzül
A mutációk keletkezhetnek az élőlény tekintetében belső és külső okokból A belső okokból származó mutációkat tekintjük spontán,
a külső okokból származókat indukált mutációknak.
A mutáció ritka jelenség.
Gyakran nem állapítható meg, hogy a mutációt belső, vagy külső tényező hozta létre. Ilyenkor általában a mutációt spontán mutációnak tekintjük.
A mutációk kialakulásának okai
okai :
- a bázisok alternatív formái (keto/enol, amino/imino tautomerizáció) >
megváltoztatja a bázisok párosodási sajátságait
- a replikáció során a szálak elcsúszása következtében kisméretű inszerciók és deléciók keletkezése
- a DNS szerkezeti változásai (pl. deamináció, amely a bázisok párosodási tulajdonságait változtatják meg)
Spontán mutációk
Normál bázispárosodás (keto és amino formák)
A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására.
A guanin enol formája timinnel,
az adenin imino formája citozinnal, képes H-híd kialakítására.
A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és
állandósul
Tautomerizáció
Inszerció és deléció keletkezése a replikáció során
A következő replikáció során az inszerció/deléció fixálódik.
új szál régi szál
A lacI gén 140 spontán mutácójának megoszlása (J.Miller)
A mutációs „forró pontok” sokszor ismétlődő szekvenciát tartalmaznak vad típus
5’ - GT CTGG CTGG CTGG C - 3’
inszerció - GT CTGG CTGG CTGG CTGG C - deléció - GT CTGG CTGG C -
Mutációs forró pontok
Nukleotidhármas ismétlődések és kiterjedésük (triplet expanzió)
A törékeny X kromoszóma szindróma (név: in vitro cytológiai kép – az X kr. adott ponton gyakran törik)
a leggyakoribb öröklődő szellemi visszamaradottság
(1/1500 férfi, 1/2500 nő)
FMR-1 fehérje a szinaptikus plaszticitás folyamatában fontos – tanulás, memória
Normális: FMR-1 (=fragile X mental retardation 1) génjében 60-nál kevesebb egymást követő CGG ismétlődés van az 5’ UTR-ben
50-200-szoros ismétlődés legtöbbször nem okoz súlyos tüneteket (az esetek csak 20%-a súlyos)
Beteg: FMR-1 génben CGG nukleotidhármas számfeletti ismétlődése alakul ki (az ismétlődések száma a betegekben több ezer is lehet)
Következmény: - magasabb metiláltság, kromatin (?) > silencing
Több öröklődő betegség molekuláris hátterében áll a három nukleotid ismétlődés kiterjedése.
A törékeny X betegségen kívül ismétlődés kiterjedése figyelhető meg a Huntington betegségben is (CAG ismétlődik a Huntingtin gén kódoló régiójában > poliglutamin)
Különböző betegségekben az ismétlődés érinthet kódoló és nem kódoló szakaszokat egyaránt.
A nagyszámú ismétlődés a DNS szakasz fokozott metiláltságát eredményezi, ami az érintett gént inaktiválja.
Spontán léziók I.: depurinálódás, a glikozid kötés hasadása
A guanin (vagy adenin) lehasadásával apurinált hely marad, mely
replikációkor nem határoz meg komplementert, így komoly genetikai veszélyt jelent.
Hibajavító (repair) mechanizmus egy bázis beépítésével megszünteti az ilyen helyeket.
Ez a véletlenszerű beépítés mutációt
okozhat.
Spontán léziók II.: deaminálódás
A citozin uracillá alakulhat, mely replikációkor adeninnel párosodik, G- CA-T tranziciót okozva.
Az uracil-DNS-glikoziláz repair enzim felismeri az uracilt és javítja a hibát.
Az 5-metilcitozin deaminálása timint (5- metiluracilt) eredményez, melyet az uracil-DNS-glikoziláz nem ismer fel. Ez C-GT-A tranzicióhoz vezet .
Az 5-metilcitozinoknál ezért mutációs forrópont alakul ki
Indukált mutációk
külső okokból származó mutációk A természetes (spontán) mutációs ráta igen alacsony
A mutációs ráta mesterséges módon jelentősen megemelhető. Ez mutációt okozó vegyszerekkel (mutagén anyagokkal), ionizáló sugárzással történhet
Vegyszerek számos módon okozhatnak mutációkat:
- bázis analógok a DNS-be beépülnek, de nem a megfelelő bázissal párosodnak - alkiláló, deamináló szerek, oxidáló anyagok
a DNS bázisok szerkezetét és párosodási tulajdonságait megváltoztatják - interkaláló szerek
a bázisok közé ékelődnek és nukleotid inszerciót vagy deléciót okoznak
Az ionizáló sugárzások mutagén hatása
Az ionizáló sugárzások hatására a molekulák ionizált és gerjesztett állapotba kerülnek, melyek reagálhatnak a sejt komponenseivel, így a DNS-sel is.
Az ionizáló sugárzás felbonthatja az N-glikozid kötést, mely apurinált/apirimidinált helyet eredményez, de kétszálú törések is történhetnek.
Mindkét jelenség mutációk kialakulását indukálja, pontmutációkhoz, kromoszóma átrendeződésekhez vezethet.
pl.
5-brómuracil (5BU) timin analóg
adeninnel és guaninnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz
T-A>5BU-A>5BU-G>C-G C-G>5BU-G>5BU-A>T-A
2-aminopurin (2AP) adenin analóg
a timinen kívül citozinnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz
T-A>T-2AP>C-2AP>C-G C-G>C-2AP>T-2AP>T-A
Bázis analógok
a természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz a kettős spirálba beépíti
pl.
etil-metánszulfonát (EMS)
főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A
tranzíciót eredményez
a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre
Bázismódosítók: Alkiláló szerek
alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják
pl.
salétromossav
a citozint, az adenint és a guanint támadja citozin uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranziciót okoz
adenin hipoxantin, ami citozinnal párosodva T-A > C-G tranziciót eredményez
Bázismódosítók: Deamináló szerek
a spontán deamináción kívül különböző vegyszerek is képesek a bázisok amin csoportjait támadni
Bázismódosítók: Hidroxilálószerek
A hidroxilamin (HA,= NH2OH) hidroxilálja a citozin C-4 pozícióban levő amino-nitrogénjét, mely így adeninnel fog párosodni. Ezzel C:GT:A tranziciót indukál.
- általában gyűrűs vegyületek, melyek térkitöltése a bázispárokhoz hasonlít - a DNS kettős spirálban egymás melletti bázispár közé képesek beépülni
- a beépülés a kettős spirál alakját torzítja, ami azután a replikáció során egy nukleotid kiesését vagy beépülést okozza > frame-shift mutációt okoznak
-ha keresztkötik a DNS két szálát, az többé nem tud replikálódni.
pl.
proflavin akridin sárga etidium-bromid Aktinomicin-D
dioxin-származékok
Interkaláló vegyületek
Aflatoxin
mikotoxin (gombaméreg), amelyet penészgombák termelnek (Aspergillus fajok)
Erős mutagén, a guanin N-7-hez való kapcsolódás után apurinált hely
keletkezik.
Afrika és Kelet-Ázsia területén előforduló májrák leggyakoribb okozója.
Azokat a vegyszereket, amelyeknek az akut toxicitása vagy sterilizáló hatása elhanyagolható, de hatékony mutagének,
szupermutagéneknek nevezzük.
Mutagén kezeléssel a különböző tulajdonságú genetikai variánsok száma megsokszorozható.
Ezek között kedvező tulajdonságúak is lehetnek.
A mezőgazdasági nemesítés ezért a mutagén kezelést is felhasználja új tulajdonságú fajták előállítására.
Mind a pollen, mind a mag kezelhető mutagénekkel.
Mutációs nemesítés
Mutánsok izolálása állati és növényi sejttenyészetekből
Növények vagy állatok sejtjei a mikrobákhoz hasonlóan tenyészthetők és szelektálhatók tápfolyadékban. Mivel ilyenkor egy sejt egy egyednek tekinthető, íly módon nagy egyedszám szelekciójával kis gyakoriságú biokémiai mutációs események is kimutathatók.
A szelektált növényi sejtekből kallusz tenyészthető, majd hormon
kezeléssel növény nevelhető a kalluszból. A növény hordozza a
szelektált tulajdonságot.
Mutációs nemesítéssel előállított dísznövény változatok
Mutációk hatása a géntermékre
A
csendes (silent, szinoním) mutáció: A triplet utolsó bázisa változik, de ugyanazt
kódolja AGT (Ser) AGC (Ser)
semleges (neutrális, konzervatív) mutáció: A kódolt aminosav hasonló jellegűre változik, ezért a fehérje szerkezetét és funkcióját nem feltétlenül érinti
AAA (Lys bázikus) AGA (Arg bázikus)
misszensz („megváltozott értelmű”) mutáció: Egy báziscsere miatt másik, nem funkcióképes aminosav kódja keletkezik
GAG (Glu savas) GTG (Val semleges) Nonszensz („értelmetlen”) mutáció: Egy báziscsere miatt STOP kodon keletkezik
TAC (Tyr) TAG (Stop)
Kereteltolódási (frame shift) mutáció: Egy vagy két bázis kiesése vagy hozzáadódása miatt elcsúszik a leolvasási keret
Pontmutáció érinthet splicing helyet
- módosul a fehérje hossza
- in frame STOP-kodon is lehet a ki nem vágódó intronban
DNS hibák javító mechanizmusai, REPAIR mechanizmusok
A DNS hibái többféle mechanizmussal javítódnak.
A javítás a DNS kettős spirál szerkezetén alapszik.
A javítási mechanizmusok redundánsak, azaz egy hibát több mechanizmus képes
kijavítani. Ez többszörös biztonságot jelent.
A DNS javító mechanizmusok csoportosítása
- A párosodási hibák javítása (Mismatch repair) - Közvetlen javítás
- Bázist kivágó javítás
- Nukleotid eltávolító javítás - Rekombinációs javítás
- …
Mutátorok és az ember repair betegségei
Ha a hibajavító fehérjéket kódoló génekben mutáció következik be, a DNS hibák javítása szenved kárt, így több hiba halmozódik fel a DNS-ben. Ennek következménye egysejtűekben nagyságrendekkel magasabb mutációs ráta, többsejtűekben rák betegség kialakulása.
Ezért ezeket a géneket mutátor géneknek is nevezik.
- a halálozások oka a civilizált világban 40%-ban rákos daganat
- a rákos megbetegedések közel 90%-át a környezetünket szennyező mutagének okozzák
- a mutagén vegyületek rákkeltők (karcinogén) is
- évente néhány ezer olyan vegyületet állítanak elő, amelyek korábban nem léteztek a Földön (gyógyszer alapanyagok, növény- vagy faanyagvédő szerek, élelmiszer- adalék, kozmetikum, háztartási vegyszer stb.)
A mutagének és a karcinogének közötti szoros kapcsolat szükségessé teszi a környezetünkben lévő mutagén vegyületek kimutatását
Mutagén – Karcinogén
többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer:
• bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium, Esherichia coli)
• mikroszkópikus gombák (pl. Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans)
• rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster)
• növények (lóbab, árpa, vöröshagyma)
• gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlős sejtvonalak)
• in vivo emlős (egér, hörcsög, patkány)
A genotoxicitás mérése
A mutációt okozó anyagok kimutatására olyan tesztrendszer szükséges, amely hatékonyan láthatóvá tesz sok különböző lókuszban bekövetkező új funkció vesztéses recesszív mutációt is.
Soksejtű eukariótákban ez nehezebb, az első ilyen rendszert mégis muslicában dolgozta ki Herman J. Müller 1928-ban (Drosophila ClB teszt).
Bakteriális reverz mutagenitási teszt
Kidolgozója, Bruce Ames után AMES teszt Validált (OECD Guideline 471)
Pontmutációk észlelésére alkalmas
Salmonella typhimurium
apatogén, mutáns törzseinek használatán alapul
nagy populációban bekövetkező ritka mutációs esemény detektálása
Számoljunk!
Spontán mutációs gyakoriság: 10 000 000 baktériumból néhány tucat mutáns
Indukált (mutagén ágens hatására): 10 000 000 baktériumból néhány száz mutáns
Cél: teremtsünk olyan kísérleti körülményeket, ahol a 10 000 000 baktérium NEM, míg a 10-1000 közötti számban előforduló mutáns életképes (telepet képez)
mutagénnel kezelt
spontán 10 000
telep 9 900
telep
his-
hisztidin bioszintézisére képtelen
(hisztidint NEM tartalmazó tápközegben életképtelen)
his+
hisztidint szintetizál
(hisztidint NEM tartalmazó tápközegben életképes) Reverzió = back mutáció
his- mutánsainak reverzióját méri a tesztelendő vegyületek hatására
mutagénnel kezelt
spontán
A Salmonella reverz mutagenitási teszt alapja
MUTAGÉN TESZTTÖRZS
hisztidin-mentes táptalajon
phosphoribosyl pyrophosphate
Hisztidin bioszintézis
A teszttörzsek jellegzetességei
Különböző típusú his mutációkat tartalmaznak, ezért a mutáció reverziója történhet:
• bázispár szubsztitúcióval
• frame-shift segítségével
különböző hatásmechanizmusú mutagén vegyületek mutathatók ki, azaz információt nyújt a genotoxikus anyagok által előidézett mutációk típusáról
A tesztelő törzsek hibásak az:
LPS kialakításában rfa
(lipopoliszacharid bioszintézis, sejtfelszín), a vizsgálandó anyag könnyebben jut be a sejtbe a sejtfalon át
A kísérlet kivitelezése I.
S9 – patkány májából készült kivonat
(mikroszomális frakció – ER – drogmetabolizmus enzimei
S9-et adagolva modellezni lehet az emlősökben lezajló enzimatikus reakciókat, így a bakteriális géntoxikológiai tesztekből következtethetünk a szennyezőanyagok magasabb rendű szervezetekre 64
A kísérlet kivitelezése II.
Egy vegyületre akkor mondjuk, hogy Ames-tesztben nem mutagén, amennyiben legalább 4 törzsön – TA98, TA100, TA1535, TA97 és/vagy TA1537 – bizonyította önmagában vagy S-9-es aktiválás utáni
hatástalanságát.
Egyetlen törzsön mért pozitív teszt esetén is mutagén a minősítés.
Az eredmények értékelése
Az aflatoxin Ames tesztje
Továbbfejlesztett Ames teszt
96 lukú mikrotitráló lemezen
6 törzzsel (TAMix) végezhető egyszerre
pH indikátor festék a tápközegben (brómkrezol lila) A hisztidinmentes tápközegben szaporodó (revertált)
baktériumok savasítják a tápközeget
Herman J. Müller dolgozta ki 1928-ban
A teszt vad fenotípusú hímek hordozta X kromoszómán vizsgálja letális mutációk keletkezését.
A kimutatási rendszerhez egy speciális X kromoszómát szerkesztett.
Ez a ClB kromoszóma.
A C a crossing-overt gátló inverziót jelöli.
„l” egy recesszív letális allél.
„B” a Bar, azaz a rés-szem domináns allélja.
A Müller féle ClB mutagén teszt
X
+
Y ClB
+
(mutagén Röntgen sugárzás)
A Müller féle ClB mutagén teszt P
F1 Bar szemű nőstények > egyik X kromoszómájuk a ClB
X
+
Y ClB
+
(mutagén Röntgen sugárzás)
X ClB X
+
ClB+ +
Y
+
Y
A Müller féle ClB mutagén teszt P
F1
X
+
Y ClB
+
(mutagén Röntgen sugárzás)
X ClB X
+
ClB+ +
Y
+
Y
A Müller féle ClB mutagén teszt
ClB Y
+
Y
ClB
+ +
+
letális
ClB Y
+
Y
ClB
+ +
+
letális letális
Az F1 keresztezések egyetlen nőstényt tartalmaznak. Amennyiben az F1 nőstény X
P
F1
életképes
F2
A kapcsolt-X (attached-X) kromoszómás teszt
X
+
Y
(mutagén EMS)
X X Y
P
A kapcsolt-X (attached-X) kromoszómás teszt.
X
+
Y
(mutagén EMS)
X X Y
Y
Y X X
Y X X
+
+
Y
letális letális életképes életképes
P
F1
A ClB módszernél egyszerűbben kivitelezhető, egy generációs teszt a mutagének minősítéséhez. Az F1 nemzedék hím és nőstényeinek aránya kezelés nélkül 1 : 1. Az X kromoszómát ért letális mutációk az F1 hímek arányát csökkentik. Az F1 hímek és nőstények arányából kiszámítható a mutációs gyakoriság.
A kapcsolt-X (attached-X) kromoszómás teszt.
X
+
Y
(mutagén EMS)
X X Y
Y
Y X X
Y X X
+
+
Y letális letális
+
Y letális életképes
életképes
vagy