INHALTSVERZEICHNIS: 1 ZUSAMMENFASSUNG 1 2 EINLEITUNG 2 2.1 Die Ca

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INHALTSVERZEICHNIS:

1 ZUSAMMENFASSUNG 1

2 EINLEITUNG 2

2.1 Die Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums 2

2.1.1 Die Ca2+-ATPase 2

2.1.2 Reaktionszyklus und Reaktionsmechanismus 3

2.1.3 Struktur der Ca2+-ATPase 4

2.1.4 Die hochaffine Kationen-Bindungsstelle 6

2.1.5 Magnesiumbindung 8

2.1.6 Umkehrung des Reaktionszyklusses - Phosphorylierung durch Phosphat

und Magnesium 10 2.1.7 Thapsigargin 11 2.2 Caged Verbindungen 11 2.2.1 Caged Phosphat 12 2.2.2 DM-Nitrophen 13 2.3 Infrarotspektroskopie 15 2.3.1 Das Michelson-Interferometer 16 2.3.2 FT-IR Differenzspektroskopie mit der Rapid Scan Technik 18 2.4 Fluoreszenzspektroskopie 21

2.4.1 Theorie 21

2.4.2 Fluoreszenzmessungen an der Ca2+-ATPase 22

2.5 Zielsetzung 23

3 EXPERIMENTELLER TEIL 24

3.1 Materialien und Chemikalien 24

3.1.1 Chemikalien 24

3.1.2 Enzyme 25

3.1.3 Spezielle Materialien 26

3.1.4 Geräte 26

3.2 Chemische Synthesen 28

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3.2.2 Synthese von Caged Phosphat [18O]4P 32

3.2.3 HPLC-Analyse von Caged Phosphat 33 3.2.4 Nachweis von anorganischem Phosphat 33 3.3 Präparation des Sarkoplasmatischen Retikulums 34

3.3.1 Präparation der Vesikel 34

3.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 35 3.3.3 Bestimmung der spezifischen Proteinaktivität 35

3.4 Fluoreszenzmessungen an der Ca2+-ATPase 36 3.4.1 Fluoreszenzmessung zur Bestimmung des Calciumgehalts der

Präparationsmethode 36 3.4.2 Intrinsische Proteinfluoreszenzmessungen 38

3.5 FT-IR Spektroskopie 39

3.5.1 Messanordnung 39

3.5.2 Messparameter 40

3.5.3 Präparation des Proteins für die FT-IR Messungen 42 3.5.4 Präparation der FT-IR Proben 43 3.5.5 Zusammensetzung der FT-IR Proben 44 3.6 Datenauswertung und Datenbearbeitung 47 3.6.1 Berechnung der Differenzspektren aus den Interferogrammen 47 3.6.2 Berechnung der Differenzspektren mit interner Referenz 47 3.6.3 Berechnung der Proteinspektren 48

3.6.4 Kinetische Auswertung 49

4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 50 4.1 FT-IR spektroskopische Untersuchungen an DM-Nitrophen 50

4.1.1 Photolyse 50

4.1.2 Postphotolytische Reaktionen von DM-Nitrophen 53 4.2 FT-IR spektroskopische Untersuchungen der hochaffinen

Kationen-Bindungsstelle der Ca2+-ATPase 56

4.2.1 Modellspektren: EDTA in H2O und D2O 56

4.2.2 Calciumbindung an die Ca2+-ATPase in H

2O und in D2O 59

4.2.3 Strontiumbindung an die Ca2+-ATPase in H2O und D2O 63

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4.3 Magnesiumbindung an die Ca2+-ATPase 75 4.3.1 FT-IR Spektroskopische Untersuchung der Magnesiumbindung 75 4.3.2 Diskussion der Magnesiumbindung 78 4.4 FT-IR spektroskopische Untersuchungen an Caged Phosphat 81

4.4.1 Photolyse 81

4.4.2 Zuordnung durch Isotopenmarkierung 82

4.4.3 Einfluss von Magnesium 86

4.4.4 Photolysespektren mit DTT 87 4.4.5 Diskussion zur Bandenzuordnung der Photolysebanden 88 4.5 Phosphorylierung der Ca2+-ATPase mit Phosphat und Magnesium 91

4.5.1 Random Mechanismus der Phosphorylierung mit Phosphat und

Magnesium 91

4.5.2 FT-IR Untersuchungen der Phosphorylierung über den Random

Mechanismus 94

4.5.3 Phosphorylierung durch Magnesiumfreisetzung aus

DM-Nitrophen-Magnesium 94 4.5.4 Phosphorylierung durch Freisetzung von Phosphat aus Caged Phosphat 96

4.5.5 Diskussion der Phosphorylierung 106

Abbildung

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