Válasz Dr. Nagy Béla bírálatára
1/3
EÖTVÖS LORÁND
TUDOMÁNYEGYETEM Immunológiai Tanszék 1117 Budapest, Pázmány P. s.1/C
Telefon: 36-1-3812175 Fax: 36-1-3812176
EÖTVÖS LORÁND UNIVERSITY Department of Immunology Pázmány P. s. 1/C, Budapest H-
1117, HUNGARY Phone: 36-1-3812175
Fax: 36-1-3812176
Válasz Dr. Nagy Béla akadémikus bírálatára
Köszönöm Dr. Nagy Béla akadémikus úrnak, hogy elbírálta értekezésemet. Nagyon örülök, hogy bírálatában elismerően nyilatkozott a munkámról és külön köszönöm, hogy kérdéseivel állatorvosi témaköröket érint, amely lehetőséget ad számomra, hogy felidézzek néhány izgalmas állatorvosi‐, állat‐
biotechnológiai összefüggést. Köszönöm a dolgozat nyelvezetével kapcsolatos néhány kritikai észrevételét is, ezeket a jövőben igyekszem hasznosítani. Sajnálom, hogy a módszerek leírásának tömörítése a bírálatot megnehezítette.
Az értekezéssel kapcsolatos megjegyzéseire és kérdéseire adott válaszaim a következők:
1. 1995‐től kezdve kutatásaim alapját jelentette a kérődzők tejmirigyében zajló IgG szekréciós folyamatok elemzése, különösen az ellés körüli időszakban. A témával kapcsolatos korábbi, főként immunkémiai kutatások kimutatták az IgG‐t a tejmirigy epithel sejtjeiben, de nem tudták azonosítani az IgG kötő receptort, ill. az IgG szekrécióban részt vevő mechanizmust. Saját kutatásaink során molekuláris biológiai módszerekkel izoláltuk és karakterizáltuk a kérődzők (juh, szarvasmarha és teve) FcRn molekuláit, amelyet az idő tájt még csak rágcsálókban és emberben azonosítottak, és írtak le úgy, mint amely képes epithel sejteken keresztül intakt IgG‐t transzportálni. Minthogy az FcRn‐t ezen állatok tőgyszöveteiben is kimutattuk, sokáig valóban úgy tűnt, hogy sikerült azonosítani a régóta keresett molekulát és ahhoz kapcsolódó mechanizmust is. Későbbi in vitro, és genetikailag módosított egerekben végzett in vivo eredményeink azonban arra utaltak, hogy az FcRn elsődlegesen az IgG tejmirigyből vérbe történő visszajuttatásában, nem pedig a lumen irányába történő szekréciójában vesz részt. Ezzel elsőként tudtuk a patás emlősök sajátos maternális IgG transzportjában kiemelt fontosságú tejmirigyben IgG kötő receptort molekuláris szinten azonosítanunk és jellemeznünk, bár eredeti kérdésünkre ‐ azaz milyen mechanizmus biztosítja a tőgyhámsejtek IgG1 szekrécióját? ‐ nem kaptunk választ. A kérdés további vizsgálata tehát indokolt, de mivel azóta sem azonosítottak más, emlős epithel sejtben kifejeződő IgG transzporter molekulát (amelynek révén pl. szekvencia homológia alapon folyó klónozás segítségével vizsgálódhatnánk), kérdéses, hogy milyen irányban lehetne a kutatásokat tovább folytatni (erre utaló, újabb irodalmi adatot e válasz készítése kapcsán sem találtam, ill. az Értekezés beadását követően felkért szerzőként részt vehettem a Mucosal Immunology c. könyv ezzel kapcsolatos fejezetének
Válasz Dr. Nagy Béla bírálatára
2/3
összeállításában, amelyben szintén a fentieket fogalmaztam meg [1]). Szeretném hangsúlyozni, hogy következtetésünket sokszor közvetett bizonyítékokra alapozva kellett meghoznunk. A végső álláspont kialakításához feltétlenül szükség lenne olyan kérődzőkben elvégzett kísérletekre, amelyek tejmirigyében az FcRn kifejeződés fokozott mértékű, vagy éppen hiányzik és az egyes IgG izotípusok (IgG1, IgG2) transzportja ‐ reciklizáció vagy szekréció ‐ kísérletesen tanulmányozható. Ilyen állatok előállítására nem vállalkozhattunk, bár kutatásaink egyik fontos célkitűzése volt, hogy ‐ akár genetikailag módosított szarvasmarha előállításával ‐ fokozzuk a szarvasmarha tejmirigyébe irányuló IgG1 szekréciót. Eredeti elképzelésünk szerint az ilyen állatok immunizálásával nagy IgG1 koncentrációjú tejet tudnánk termeltetni, amely emberi bélfertőzések kezelésére használható [2,3].
A szarvasmarha FcRn karakterizálása és tőgy hámsejtekben történő kimutatása alapján kutatótársammal, Lennart Hammarström professzorral (Karolinska Intézet, Stockholm) 2000‐ben szabadalmi bejelentést tettünk, amelynek lényege, hogy az FcRn tőgyhámsejtekbeli kifejeződésének fokozódásávál emeljük a tej IgG koncentrációját [4]. Ezt a bejelentést azonban egyfelől pénzügyi okokból, illetve a későbbi megerősítő eredmények hiánya miatt nem tudtuk fenntartani. Érdemes megemlíteni, hogy 2012‐ben egy olyan szabadalmat ítéltek meg a GTC Biotherapeutics, Inc (USA) részére, amely a mi eredményeinket alátámasztó adatokról számolt be humán FcRn‐t csak a tejmirigyben kifejező, génmódosított egerek kapcsán, azaz az egerek a szervezetükben termelt CTLA‐
4‐IgG4 fúziós, rekombináns fehérjéből kevesebbet szekretáltak a tejbe, mint azok, amelyek nem fejeztek ki humán FcRn‐t [5].
2. A szarvasmarha tejmirigy epithel sejtjeiben az FcRn elléskor észlelt lokalizáció változásának (apicalis oldali koncentrálódásának) okát sajnos nem sikerült kiderítenünk, bár a jelenséget a szarvasmarha és a juh tőgyben is kimutattuk nyúlban termelt bovin FcRn specifikus poliklonális ellenanyaggal, ami affinitás tisztított, Western blotban és immunhisztokémiai elemzéssel is többszörösen igazolt specifikus ellenanyag volt [6‐8]. Munkatársam az elmúlt évben olyan nagy affinitású, bovin FcRn specifikus monoklonális ellenanyagot fejlesztett ki, amelyet eredményesen tudunk használni jelenlegi citofluoriméteres és konfokális mikroszkópos elemzéseink során arra, hogy a bovin FcRn Tg egerekben elemezzük az immunválaszt. Nem kétséges, hogy ez az ellenanyag hatékonyabb elemzést tenne lehetővé a szarvasmarha tőgyben kifejeződő, FcRn közvetített folyamatok vonatkozásában is (megerősítő és pontosabb lokalizáció, IgG1 vagy IgG2 molekulákkal kolokalizió). A kérdés további vizsgálata feltétlenül indokolt lenne.
3. Korábbi elemzéseink valóban nem mutattak ki FcRn kifejeződést az újszülött borjak vékonybél felszívó hámsejtjeiben, csupán azokban a vékonybél crypta sejtekben, amelyekben korábban leírták, hogy részt vesznek az IgG1 béllumen irányú szekrécióban [9‐11]. Professzor úr felvetésével egyetértek, érzékenyebb módszerrel érdemes lenne ezt a kérdést újból megvizsgálni. Ennek kapcsán, és a mai technikai lehetőségeinket ismerve, ismét az immunhisztokémiai eljárást választanám, de a
Válasz Dr. Nagy Béla bírálatára
3/3
korábbi nyúlban termelt bovin FcRn poliklonális ellenanyag helyett, a már említett monoklonális ellenanyaggal próbálnám a kimutatást elvégezni (az ellenanyag alapú kimutatás előnyét abban látom, hogy a sejtekben kifejeződött fehérje szubcelluláris lokalizációját is vizsgálhatóvá teszi, míg az in situ hibridizáció a fehérje valódi lokalizációjától függetlenül csak a gén‐specifikus mRNS‐t detektálja). A receptor pontos lokalizációját nagy felbontású mikroszkóppal, IgG1 vagy IgG2 molekulákkal együttes kifejeződését konfokális mikroszkóp technikával lehetne azonosítani.
Végül még egyszer szeretném megköszönni a Professzor Úrnak, hogy elbírálta az értekezésemet és kérem fogadja el a kérdéseire adott válaszaimat.
Budapest, 2013. május 20.
Dr. Kacskovics Imre
Hivatkozások:
1. Butler JE, Salmon H, Rainard P, Lippolis J, Kacskovics I (2013) Immunoglobulins and Immunocytes in the Mammary Gland and its Secretions In: Mestecky J, Lamm ME, McGhee JR, Bienenstock J, Mayer L et al., editors. Mucosal Immunology. Fourth Edition ed. in press: Academic Press.
2. Kacskovics I (2003) A tehéntej immunglobulinja ‐ a jövő precíziós fegyvere a bélfertőzések ellen.
Magyar Tudomány 4: 461‐469.
3. Hammarstrom L, Weiner CK (2008) Targeted antibodies in dairy‐based products. Adv Exp Med Biol 606: 321‐343.
4. Hammarstrom L, Kacskovics I (2001) Ruminant MHC class I‐like Fc receptors (PCT/SE01/00202) 5. Meade HM, Pollock D (2012) Non‐human transgenic mammal expressing gland cells and expressing a
transgenic protein‐human Fc‐domain fusion (US0081738B2). In: Patent US, USA: GTC Biotherapeutics, Inc. USA.
6. Mayer B, Zolnai A, Frenyo LV, Jancsik V, Szentirmay Z, et al. (2002) Redistribution of the sheep neonatal Fc receptor in the mammary gland around the time of parturition in ewes and its localization in the small intestine of neonatal lambs. Immunology 107: 288‐296.
7. Mayer B, Zolnai A, Frenyo LV, Jancsik V, Szentirmay Z, et al. (2002) Localization of the sheep FcRn in the mammary gland. Vet Immunol Immunopathol 87: 327‐330.
8. Mayer B, Doleschall M, Bender B, Bartyik J, Bosze Z, et al. (2005) Expression of the neonatal Fc receptor (FcRn) in the bovine mammary gland. J Dairy Res 72 Spec No: 107‐112.
9. Newby TJ, Bourne FJ (1976) The nature of the local immune system of the bovine small intestine.
Immunology 31: 475‐480.
10. Besser TE, Gay CC, McGuire TC, Evermann JF (1988) Passive immunity to bovine rotavirus infection associated with transfer of serum antibody into the intestinal lumen. J Virol 62: 2238‐2242.
11. Besser TE, McGuire TC, Gay CC, Pritchett LC (1988) Transfer of functional immunoglobulin G (IgG) antibody into the gastrointestinal tract accounts for IgG clearance in calves. J Virol 62: 2234‐
2237.
