BIOREAKTOROK és a MÉRNÖKI GYAKORLAT
Aláírásért:
• 2018.03.06. röpZH (BSc-ből)
• hallgatói ea (esettanulmány, cikk) (benne javasolt vizsgakérdés!)
• Szúrópróba katalógus
Labor: 1 hetes: 3 szimuláció 1 félüzemi ferm. 1 gyárlát.
Hétfő
Oktatási
hét Tárgy Témavezető Gyakorlat
2018.02.05 1 2018.02.12 2
2018.02.19 3 Ipari Mikrobi NÁ BacTrc kalibráció 2-esével+ ismeretleen analízis
2018.02.26 4 Bioreaktorok 1 KB+VA+NB+NÁ H:K:Sz:Cs:P=StrukturModel1:StrukturMOdel2:BiorModel:KomplexFerm:Élesztőmodel+RG 2018.03.05 5 Bioreaktorok 2 KB+VA+NB+NÁ H:K:Sz:Cs:P=StrukturModel1:StrukturMOdel2:BiorModel:KomplexFerm:Élesztőmodel+RG
2018.03.12 6 03.15-18 4napos szünet
2018.03.19 7 Bioreaktorok 3 KB+VA+NB+NÁ H:K:Sz:Cs:P=StrukturModel1:StrukturMOdel2:BiorModel:KomplexFerm:Élesztőmodel+RG
2017.03.26 8 FIBOK2018+Nagypéntek
2017.04.02 TAVASZI SZÜNET Húsvét H
2017.04.09 9 Kolozsváriak
2017.04.16 10 Ipari Mikrobi VA Kolozsváriak+Vegyésznapok
2017.04.23 11 MÜKKI
2017.04.30 12 Bioreaktorok 4 KB+VA+NB+NÁ H:K:Sz:Cs:P=StrukturModel1:StrukturMOdel2:BiorModel:KomplexFerm:Élesztőmodel+RG 2017.05.07 13 Bioreaktorok 5 KB+VA+NB+NÁ H:K:Sz:Cs:P=StrukturModel1:StrukturMOdel2:BiorModel:KomplexFerm:Élesztőmodel+RG 2017.05.14 14
2018.05.21 Póthét H:Pünkösd, péntek:vizsga
Záróvizsga + Előadás témák
No hét Téma
1 6 Biosafety, containment
2 6 CIP, SÍP
3 7 Gyógyszeripari víztisztítás 4 7 Közművek (gőz, víz levegő)
5 8 Fűtés, hűtés HVAC
6 8 Szűrőelemek a biotechnológiában 7 9 Raceway pondok/nyitott medencék
8 9 Aerob keverős reaktorok vs szilárd fázisú reaktorok 9 10 Air lift reaktorok
10 10 Enzimes reaktorok
11 11 Biofolyamatok mérése és szabályozása
12 11 Bioszenzorok
13 12 Bioreaktor tervezés, méretezés 14 12 Mikrobioreaktorok és mérésük
15 13 Léptknövelés
16 13 Cső Tartály Szelep 17 14 Biotech hulladékkezelés 18 14 GMP validálás
19 14 Eldobható reaktorok
MSc
ENZIMES ÖSSZEFOGLALÓ 2012
Egy egység az az enzim mennyiség, amely 1 mol szubsztrátot alakít át vagy 1 mol terméket képez 1 perc alatt adott reakció
körülmények között.
E + S P + E mol/dm3!!!!
E/tf E/mg fajlagos aktivitás
MIÉRT NEM MÉRHETŐ?
Michaelis és Menten SI rendszerben: 1 Katal: 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt.
hatalmas enzim mennyiség nKat = 10-9 Kat
1 Kat = 6*107 U, 1U =1.6*10-8 Kat, 1U= 1/60 Kat
Michaelis-Menten kinetika
E + S ES E + P k1
k-1
k2 k-2
(ES) S.E k
K k
1 1
s
feltételezések: *k-2 =0
*első lépés gyorsan egyensúlyra jut= RAPID EKVILIBRIUM
*stabil ES komplex, EP komplex elhanyagolható
*egy aktiv centrum, egy szubsztrát aktivitás helyett cc használható
S E0 vagyis E0 / S < <1
k1SE = k-1 (ES)
az (ES) disszociációs állandója
V dP
dt k (ES)2
E (ES) E
oa „minket érdeklő” reakciósebesség:
anyagmérleg osszuk el ezt a kettőt egymással
Michaelis-Menten kinetika
(ES) S.E k
K k
1 1
s
V E
k (ES) E (ES)
o
2
V E
k S
K E
E S
K E
o
2 s
s
S K
S K
1 S K
S E
k V
s s
s o
2
Vmax k E2 o
V dP
dt k (ES)2
Rendezzük át!
BRIGGS-HALDANE KINETIKA
ESdt k dP
ES k
ES k
ES dt k
ES d
ES k
ES dt k
dS
2
2 1
1
1 1
S Eo
pre-st.st.
S
P
(ES)
E S0
E0
0 idõ
kvázi st.st.
d(ES)/dt =0 steady state
E + S ES E + P
k1 k-1
k2 k-2
NAGYON RÖVID IDŐ HOSSZÚ IDŐ
PRE-STEADY STATE
BRIGGS-HALDANE KINETIKA
k ES k
ES k
ES 0dt ES d
2 1
1
Km=(k-1 + k2) / k1
E (ES) Eo
11 2
2 1
1
k k
ES ES k
ES k
k ES
k
Michaelis állandó
S K
V S S
K
S E V k
m max
m o 2
Km .S (ES) E
2 (ES) /
E
(ES) k
E
V
2o
k
DISZKUSSZIÓ
Michaelis -Menten Briggs-Haldane
V V S
K S
max s
V V
S
K S
max
m
K k k
k
k k
k
k K k
m k
1 2
1
1 1
2 1
s
2 1
ha num(k1)> >num(k2) a két konst. azonos!
V=(Vmax/KS)*S
1.rendû tartomány
0.
rendű
tartomány Vmax= k2EO
V
Km ; KS S
DISZKUSSZIÓ
V=(Vmax/KS)*S
1.rendû tartomány
0.
rendû
tartomány Vmax= k2EO
V
Km ; KS S
S Ks
Ha S Ks derékszögű hiperbola
látszólagos elsőrendű sebességi állandó
S E k S K E
V k 0 0
S
2
katalitikus effektivitás= specfi(ci)tás állandó
V V S
K S
max
s
Km/Vmax= specfi(ci)tás idő
L-B, H-L, E-H ábrázolások
-1/K
m1/S
tga=Km/Vmax
1/V
1/Vmax
1 1 1
V V Km
V S
max max
*
tga=1/Vmax
S/V
S K
m/V
maxK
mS V
Km
V V S
max max 1 *
V
V/S Vmax
tga=-Km
Vmax/Km
S m V max K
V
V
V
0értelmezése
V0=
( dS/dt )
t=0S
t
P
t
V0=
( dP/dt )
t=0A M-M és B-H egyenletekben
V kezdeti reakciósebességet jelent!!!
A k
2meghatározása és V
maxE
0-függése
Vmax3=k2EO3
Vmax2=k2EO2
Vmax1=k2EO1
Km S EO1 EO2 EO3 EO
V
tg a= k
2A kinetikai paraméterek értelmezése 1 Vmax IUBMB:nem max, hanem limit!!! HATÁRSEBESSÉG
kcat: [ s-1 ]
Egy enzimmolekula átalakítási frekvenciája S-telítés esetén
NEM ENZIMTULAJDONSÁG Vmax= k2 . E0 = AKTIVITÁS k2 [s-1]
ENZIMTULAJDONSÁG = turnover number, váltásszám
Vmax= kcat . E0
Kiterjesztés minden enzimre és minden kinetikára
Km , KS
-Közelítőleg az S az élő sejtben - az enzim affinitása
-A = B ???
-Változott a KS Inhibitor?Aktivátor?
-Enzimanalitika S>>KS
Túl érzékeny
érzéketlen
A kinetikai paraméterek értelmezése 2
k1 107-1010 dm3mol-1min-1
max. érték(1011) kis molekulák diffúzió-sebessége k-1 102-106 min-1
k2 50-107 min-1
Km 10-6 - 10-2 mol/dm3
katalitikus effektivitás= specfi(ci)tás állandó
M 10
1s 1M
s M 10
s K 10
k
7 1 1
7 1
1 7 m
cat
Legtöbb enzim e két szélső eset között
kcat alsó határa metabolikus enzimeknél
Természetes enzimeknél: >105
Mesterséges e-nél (DNA-zyme, abzyme:<103
<108-109 M-1s-1
diffúziókontrollált bimolekuláris reakció
ENZIM MODULÁCIÓ
INHIBÍCIÓ
Vmax
EO KO
NT ROL
L
+REVERZIBILIS INHIBITOR
+IRREV
ERZIBILIS INHIBITOR
REVERZIBILIS IRREVERZIBILIS
E + S ES E + P +
I E I
DINAMIKUS EI KOMPLEX
LINEÁRIS INHIBÍCIÓ komplett kP
NEMLINEÁRIS INHIBÍCIÓ (HIPERBOLIKUS) részleges βkP „csökkent, maradék aktivitás”
1/V - I ábrázolás
DIXON ábrázolás
KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ
VERSENGÉS S ÉS I KÖZÖTT AZ E AKTÍV HELYÉÉRT, VAGY...
KÖLCSÖNÖS KIZÁRÁS I szubsztrát analóg alternatív szubsztrát termék
MODELLEK
1. MODELL: Klasszikus kompetitív inhibíció
Az I verseng S-sel ugyanazon aktív hely elfoglalásáért 2.-3 MODELL: sztérikus GÁTLÁS
4. MODELL: átlapoló helyek esete :1 és 3 kötő hely képes az i, a 2 és 4 kötő hely pedig az S megkötésére, de egymást kölcsönösen
kizárják
5. MODELL: I kötõdése az enzimhez konformáció változást okoz az enzimen és ez megakadályozza S-nek az aktív centrumhoz kötődését. Ilyen a végtermék gátlás (feed back inhibíció) is.
1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 5.
1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 6.
S 1 K 1 I V
K V
1 V
1
I max
S
max
K S 1 I
K V S
V
i s
max
K S 1 P
K V S
V
P s
max
2 1 S 1 2
S
1 1max
1
K S 1 S
K V S
V
kompetitiv inhibició
k. termék inhibició
alternativ v. versengő szubsztrátok
1 2 S 2 1
S
2 2max
2
K S 1 S
K V S
V
ANALÓGIÁK
NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ
Ks
kp
E + S ES E + P
+ +
I I
Ki Ks
EI + S ESI
Ki
KS
KS KI
KI
V V
ES
E ES EI ESI
max
2. NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ
V V
S K
1 S
K
I K
S.I K K vagy
V V
S
K 1 I
K S 1 I
K illetve
V = V 1
1 I
K
S
K S
max
s
s i s i
max
s
i i
max
i
s
Az inhibitor a látszólagos Vmax értéket változtatja meg, Ks (illetve Km) értékét nem befolyásolja.
V 1/V
0 1/S
1
Vmax 1
Vmaxi 1 I
Ki Vmax
K
V 1 I K
m
max i
K V
m max
I
Vmax Vmaxi
I
Km S
3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 1
Ks kp
E + S ES
Ks kp
E + P +
I
ESI
I csak az ES-hez kötődik
I kötő hely
„nem kész”
I kötő hely
„ kész”
S kötő hely eltorzult
3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 2
V V
S K 1 S
K
SI K K
max
s
s s i
V V S
K S 1 I K
max
s
i
mi változott?
S K
1 I K
S K
1 I V 1 V
i S i
max
l.nemkomp.inh.
a komp forditottja, KS csökken
Egy unkompetitiv
I
KS és Vmax értékét ugyanolyan mértékben csökkenti3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 3
1 V
K V
1 S
1
V 1 I
K
m
max max i
V V 1
1 I K
S K 1 I
K
S
max
i
m
i
Vmax/2 Vmaxi/2
Vmax Vmaxi
I
V V
1 I K
maxi
max
i
K K
1 I K
mi
m
i
Km V
S
I
nem inhibeált
1/S 1/V
I
I=0
Km/Vmax
1/Vmax
1 1
V
I K
i V
i
max max
1 I
K K
i m
1/Km
LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ
K 1
K K
1 K K
eq
s i i s
a a
I JELENLÉTE MÓDOSITJA S-NEK ES-RŐL TÖRTÉNŐ DISSZOCIÁCIÓJÁT
l. nemkomp!!!
DE
E + S ES E + P + +
I I
EI + S ESI KS
aKS
KI aKI
kP
ahol KS=E.S/ES, aKS=EI.S/ESI
KI=E.I/EI
aKI=ES.I/ESI
E ES ESI E EI ESI
LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ 2
V V
S K 1 S
K
I K
S. I K K
vagy kissé átalakítva
V V S
K 1 I
K S 1 I
K
vagy
V = V 1
1 I
K
S
K
1 I K
1 I
K
S
max
s
s i s i
max s
i i
max
I
s
I
I
a
a
a
a
L. NEMKOMP!!!
nemkomp
unkomp komp
LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ 3
Vmax/2 Vmaxi/2
Vmax Vmaxi
I
V V
1 I K
maxi max i
a Kmi
V
S
I
nem inhibeált
1/S 1/V
I
I=0
1 1
V
I K
i V
i
max max
1
1 I K
K I
K
i m
i
a
-1/Km
Km -1/aK
m
K V
I K
m
i max
1
1 1
Vmax a
a
1 I K V
a i max
INHIBICIÓK ÖSSZEFOGLALÁSA
S és I kölcsönösen kizárják egymást az enzimről KOMPETITIV
S és I egymástól függetlenül kötődnek az enzimre NEMKOMPETITIV
mint előző, de az I megváltoztatja az enzim affinitását KEVERT TIPUSÚ I csak a S után kötődik UNKOMPETITIV
SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ
• -- A szubsztrátnak ahhoz, hogy termékképző átmeneti komplex jöjjön létre, két vagy több helyen kell, hogy az enzimhez kötődjék.
Sok S molekula → egy S molekula az egyik,
másik S molekula pedig egy másik kötőhelyhez kapcsolódik s így inaktív komplexek jönnek
létre (ez is reverzibilis inhibíció).
E
-OOC
CH2 CH2
-OOC
E
-OOC
CH CH
-OOC
Succinate Malonate
E
-OOCCH2CH2COO-
-OOCCH2CH2COO-
Normal S inhibition
■-- Nagy S koncentrációnál egy S molekula olyan kötőhelyhez is kapcsolódhat az enzimen, amely nem az aktív centrum része, az ilyen kötődés mintegy
NEMKOMPETITIV (v. unkompetitiv) módon megakadályozza a normális S kötődést.
■--Az enzim működéshez szükség lehet egy aktivátor molekulára. Ha ez kapcsolódni képes a szubsztráttal, sok S molekula "elvonja" az enzimtől az aktivátort, így
csökkentve annak tényleges aktivitását.
■--Két (vagy több) szubsztrátos reakciók esetén az egyik szubsztrát feleslege lekötheti a másik szubsztrát kötő helyeit, megakadályozva a szükséges második szubsztrát
kapcsolódását, így megintcsak inaktív komplexek jönnek létre.
■-- Nagy S koncentráció aspecifikus módon is gátolhatja a reakciót, például az ionerősség megnövekedése miatt.
SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ
K a
S S
1 K V 1
= V
s s
max
SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ
V
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
0 50 100 150 200 250 300
Vmax=0.9,Ks=50,Ki=10 Vmax=0.9,Ks=50,Ki=50
Vmax=0.9,Ks=50,Ki=100
Szubsztrát koncentráció (mg/L)
A.)Termékképzéshez egyszerre több különbözõ szubsztrát kell, hexokináz
glükóz + (Mg)ATP Glükóz-6-foszfát + (Mg)ADP foszforilezés
két termék
B.) A másik esetben a reakció keverékben egy enzim és több különböző, lényegében alternatív szubsztrát.
példák: a legtöbb biopolimer hidrolizáló enzim amiláz, amilo-glikozidázok, cellulázok
proteinázok.
Függetlenül attól, hogy ezekben az esetekben exo- vagy endo-enzimekről van-e szó, a reakció-keverékben egyidejűleg több, különböző polimerizációs fokú szubsztrát van (lesz) jelen.
TÖBB SZUBSZTRÁTOS REAKCIÓK
MSc 2009
Két tipus
EGYÉB HATÁSOK AZ ENZIMAKTIVITÁSRA Ionerősség
pH
Hőmérséklet Nyírás
Nyomás (hidrosztatikai) Felületi feszültség
Kémiai szerek (alkohol, urea, H2O2...) Fény, hang, ionizáló sugárzások
REVERZIBILIS
VÁLTOZÁSOK IRREVERZIBILIS
Yi
pH 1
Y
Y-
Y2-
Y 1
1 H / K1 K / H2
Y= Y2-= pH hatása 2
op timum
1 2
2 1 op timum
pK 2 pK
pH 1
K K H
!
1 H /K K /H
E 1 k Y
E k V
2 1
0 2 0
2 max
pH hatása 2
Hőmérséklet hatása
R
exp S RT
exp H RT
exp G E K
E d d d
d a
i
E E
1 K é s V k T E ahol
k T k T
h e e
a
0 d
max 2 a
B S / R* E/ RT
2
Kettős hatás Reakciósebesség nő
Csökken: denaturálódás
irreverzibilis reverzibilis
Ea Ei Kd
Mivel E0 = Ea + Ei
V Te
1 e e
max
E/ RT
S / R* H / RTd
a
a = kombináció (β,kB,h,E0,S*) Km is függ T-től!
1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6
2,9 3,1 3,3 3,5 3,7 V
Oxigén képzõdési sebesség
cm3/min
1/T*103
Hőmérséklet hatása
a
a
kE
dt
dE
Időtől is függ!
a0 kt
a t E e
E
a0 kta
t E e
E
β
R E tg Hd
a
R tg E
a
REVERZIBILIS REAKCIÓK 1
Sok enzim katalizálta reakció - főként a biopolimer hidrolízisek - nagymértékben a jobboldali irányba eltolt egyensúllyal rendelkeznek,
→
gyakorlatilag k-2 valóban elhanyagolható.De például a glükóz fruktóz (glükóz izomeráz)gyakorlatban is egyensúlyi reakcióként viselkedik
E + S ES E + P k1
k-1
k2 k-2
K k k
k
K k k
k
ms
2 1
1
mp
2 1
2
V k E V k E
maxs 2 o
maxp 1 o
2 1
2 1 2
1 um)
eq(uilibri
2 2 2
1 1 1
k k
k K k
K K
k K k
k
K k
1/KS KP
REVERZIBILIS REAKCIÓK 2
Végezzük el a következő osztásokat:
V K
k k E
k k és V K
k k E
k k
maxs ms
1 2 o
2 1
maxp mp
2 1 o
2 1
V K V
K
V K
V K
k k
k k K
maxs ms maxp
mp
maxs mp maxp ms
1 2
1 2
eq
HALDANE összefüggés
REVERZIBILIS REAKCIÓK 3
E
MI TÖRTÉNIK?
S → P vagy P → S
?
S
P MITŐL FÜGG? K
eq, S , P értéke
V
V S P
K
K 1 P
K S
V S
K V P
K 1 S
K
P K
netto
maxs
eq
ms
mp
maxs
ms
maxP
mP
ms mP
V
netto= V
előre- V
vissza= k
2(ES) - k
-2(EP)
mP mS
0 P 0
s
K P K
1 S
P E k
S E k
Ahol:
a
2 1
2 1 P
2 1
2 1 S
k
k k
k k k
k és k
k k k
mP mS
0 P 0
A
K p K
1 a
p E k
a E k
MCA