Optisch schaltbare Spinmarker für Abstandsmessungen im Nanometerbereich

Volltext

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SPINMARKER FÜR

AB-STANDSMESSUNGEN

IM NANOMETERBEREICH

Dissertation zur Erlangung des

akademischen Grades eines Doktors

der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

vorgelegt von Christian Hintze

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Optisch schaltbare

Spinmarker für

Abstandsmessungen im

Nanometerbereich

Christian Hintze

27. August 2018

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dritter, die bereits ihrerseits lizensiert wurden, 27. August 2018.

Diese Arbeit wurde an der Universität Konstanz in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Malte Drescher im Zeitraum von Januar 2012 bis Mai 2017 erstellt.

1. Referent: Prof. Dr. Malte Drescher 2. Referent: Prof. Dr. Andreas Zumbusch 3. Referent: Prof. Dr. Christine Peter

Datum der mündlichen Prüfung: 15.09.2017

Mit Hilfe freier und offener Software hergestellt. Der Text wurde mit Emacs in LATEX2e und dem KOMA-Script geschrieben und mit X E LATEX von X E TEX in

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In der gepulsten, dipolaren ESR-Spektroskopie nutzt man die magnetische Di-polwechselwirkung zwischen Elektronenspins aus, um Abstandsmessungen im Nanometerbereich für Strukturuntersuchungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird hierfür eine neue Technik eingeführt: die LaserIMD-Spektroskopie. Diese ist mit der gepulsten Elektronendoppelresonanz verwandt und basiert auf dem Anschalten eines Spinmarkers über einen Lichtblitz, wodurch die Dipolwechsel-wirkung zwischen einem Dublett- und einem Triplettspin für die Abstandsmes-sung verwendet wird.

Zunächst werden die für LaserIMD wichtigen Prinzipien und Eigenschaften der gepulsten Elektronendoppelresonanz vorgestellt. Ihre Beziehung zu anderen Methoden zur Strukturuntersuchung im Nanometerbereich und aktuelle Ent-wicklungen werden dargestellt. Aus den wichtigen Konzepten gepulster Elek-tronendoppelresonanz wird abgeleitet, dass LaserIMD das Potential besitzt, den zugänglichen Abstandsbereich zu erweitern oder Messzeiten zu verkürzen.

Zur Etablierung dieser neuen experimentellen Technik ist es zielführend, sich zunächst den Stand der Technik der gepulsten Elektronendoppelresonanz an-zueignen. Hierfür werden Abstandsmessungen zur Verfolgung enzymatischer Hydrolyse von ATP und zur Aufklärung der Kettenkonformation konjugierter, linearer Oligomere in Nanopartikeln derselben verwendet.

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Ich bedanke mich bei Prof. Dr. Malte Drescher für die vielseitigen Freiheiten und Möglichkeiten bei der Ausgestaltung des Promotionsprojektes und die großarti-ge Unterstützung durch das Ermöglichen einer Vielzahl von Konferenzbesuchen oder das Vorschlagen bei der Fachgruppe Magnetresonanz der GDCh für den Ernst-Preis.

Prof. Dr. Andreas Zumbusch gilt mein Dank nicht nur für die Bereitschaft zur Übernahme des zweiten Gutachtens, sondern auch für die Hilfe und Ratschläge als zweiter Betreuer dieser Arbeit.

Sämtliche Teilprojekte dieser Arbeit wurden nicht isoliert innerhalb der Ar-beitsgruppe realisiert, sondern erst durch Kooperationspartner ermöglicht. Hier möchte ich mich insbesondere bei Prof. Dr. Gunnar Jeschke bedanken, der sich in ausführlichen E-Mails die Mühe gemacht hat, mir Details der dipolaren ESR-Spektroskopie begreifbar zu machen. In ganz ähnlicher Art und Weise hat Prof. Dr. Ulrich E. Steiner meine vielen Fragen zu Triplettzuständen mit viel Geduld und Zeit geklärt. Bei Dr. Friederike Schütze bedanke ich mich ganz besonders für gewinnbringende Erörterungen zu Nanopartikeln. Weiterhin ist es mir ei-ne große Freude, mit Prof. Dr. Andreas Marx, Prof. Dr. Stefan Mecking und Dr. Stephan Hacker zusammengearbeitet zu haben und bedanke mich sehr.

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Bei ihren Besuchen in der Arbeitsgruppe haben Prof. Dr. Edgar J. J. Groenen, Prof. Dr. Thomas Prisner, Prof. Dr. Vinod Subramaniam, Dr. Maxim Yulikov sowie Dr. Guinevere Mathies ihre Perspektive von außen mitgebracht und mir dabei Denkanstöße zum Promotionsthema, aber auch darüber hinaus, gegeben. Hierfür bin ich dankbar.

Im Labor ist natürlich alles stets perfekt voraus geplant, aber wenn es den-noch einmal klemmte, dann konnte ich bei Geräten und Chemikalien auf Dr. Tilo Sperling aus der AG Maret (Physik) und auf Dr. Žarko Kulić aus der AG Möller zählen. Darüber hinaus hat mir Dr. Ellen Batroff aus der AG Wittmann wie selbstverständlich bei der Peptidaufreinigung geholfen. Die vielen Gelegen-heiten, bei denen man sich auf die Hilfsbereitschaft der gesamten AG Drescher verlassen konnte, kann ich hier gar nicht aufzählen, es sind zu viele. Dankeschön.

Insgesamt funktionieren Gerät und Experiment nur, wenn die Infrastruktur stimmt. Hierfür sorgten Axel Wolff und sein Team vom Facilitymanagement, Ralf Sieber und Hartmut Görig von der Heliumabteilung, Wolfgang Hellstern von der Arbeitssicherheit, Ralf Honz in den wissenschaftlichen Werkstätten sowie Patrick Carl und Antoine Wolff von Bruker. Ihnen allen gilt mein Dank.

Für kritische Durchsicht der Arbeit und Korrekturlesen möchte ich mich bei Dennis Bücker, Silvia sowie meiner Mama und meiner Oma bedanken.

Ein wesentlicher Teil der Laborarbeit wurde mir durch Abschlussarbeiten an-derer abgenommen. Für seinen großen Einsatz als Mitarbeiterpraktikant bedan-ke ich mich bei David Siebert; für die hervorragenden Bachelorarbeiten bei Denis Runge, David Schupp, Tobias ›212(Tobi 1 + Tobi 2)‹ Morgen und Dennis Bücker;

für Masterarbeiten, die direkt in Veröffentlichungen gemündet sind, bei Patrick ›Electroman‹ Korf, Dennis Bücker sowie Frank ›Laser‹ Degen.

Ein großes Dankeschön möchte ich an die gesamte AG Drescher richten. Es kann eigentlich nie genug Kuchen, Pool-, LAN- und Büroparties geben! Viele ha-be ich schon zuvor namentlich nennen dürfen, aha-ber es fehlten Marta ›die Strenge‹ Robotta, Julia ›Kaktus‹ Cattani, Sabrina Weickert, Patrick Roser, Tobias ›212(Tobi

1 + Tobi 2)‹ Lemke, Theresa Braun und Artem ›alter, was geht‹ Fedoseev.

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Kurzzusammenfassung i Danksagung iii

1 Thematischer Zusammenhang 1 1.1 Einleitung 1

1.2 Zielsetzung und Motivation 4

1.3 Gepulste Elektronendoppelresonanz 8 1.4 LaserIMD 18

1.5 Anwendung von Abstandsmessungen im Nanometerbereich 22 1.6 Untersuchung der Triplettzustände organischer Moleküle 34 1.7 Zusammenfassung 44

2 Veröffentlichungen 47

2.1 Beobachtung enzymatischer ATP-Hydrolyse 47

2.2 Kettenkonformation konjugierter Polymere in Nanopartikeln 67 2.3 LaserIMD 97

2.4 Kinetik des lichtangeregten Triplettzustands 123 2.5 Exzitonendelokalisierung konjugierter Oligomere 137 Lizenzen 159

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1.1 Einleitung

Abstandsmessungen im Nanometerbereich sind notwendig, um Modelle von Ob-jekten zu erstellen, die sich der direkten Wahrnehmung entziehen. Die prominen-testen Beispiele für Objekte, bei denen Abstände im Nanometerbereich eine Rolle spielen, sind natürlich vorkommende Polymere, wie Proteine oder DNS, deren Struktur und Funktion den Kern der Molekularbiologie darstellen. Struktur und Funktion sind hierbei eng miteinander verknüpft und die Strukturaufklärung daher von wesentlicher Bedeutung.

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von Proteinstrukturen mit atomgenauer Auflösung aufgeklärt.

Liegen die in ihrer Struktur aufzuklärenden Moleküle nicht in kristalliner Form vor, so steht einem diese Methode nicht zur Verfügung. Hier kann die Kernmagnetresonanzspektroskopie (englisch Nuclear Magnetic Resonance, NMR) Abstände zwischen den beobachteten Kernspins in der Größenordnung von 1 nm ausmessen und zur Strukturaufklärung genutzt werden, wenngleich auch nur bis zu einer gewissen Komplexität der Umgebung oder der Größe des Moleküls.

Hängt die Struktur eines Moleküls jedoch mit seiner Funktion zusammen – ändert es also seine Form je nach Umgebung oder Wechselwirkung mit anderen Molekülen – so sind die Möglichkeiten der beiden zuvor genannten Techniken begrenzt. Hier sind andere Methoden gefragt, um gezielt die Struktur über Ab-standsmessungen aufzuklären. Dies ist konkret über den Förster-Resonanzen-ergietransfer (FRET) oder Elektronenspinresonanz (ESR) möglich. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den vielfältigen Methoden der dipolaren ESR-Spek-troskopie ein weiteres Werkzeug für Abstandsmessungen im Nanometerbereich hinzuzufügen, das ihr Einsatzgebiet erweitert.

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biologischer Systeme in nativer, zellulärer Umgebung.

Als besonders nützlich haben sich in der ESR gepulste Techniken erwiesen, die die dipolare Wechselwirkung zwischen den ungepaarten Elektronen der paar-weise angebrachten Spinmarker vermessen, indem sie die magnetische Dipol-kopplung von anderen Wechselwirkungen zwischen den Elektronenspins tren-nen. Aus dieser Dipolwechselwirkung können Abstandsverteilungen im Bereich von ungefähr 1–10 nm gewonnen werden.

In Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe wurde ein neues Experiment vorgeschla-gen, das auf einem laserinduzierten magnetischen Dipol (englisch Laser-Induced Magnetic Dipole, LaserIMD) basiert. Hierbei wird die Mikrowellenanregung des persistenten Dublettspins eines üblichen Spinmarkers durch die Lichtanregung eines Chromophormarkers in seinen Triplettzustand kombiniert. Dieses Expe-riment soll in der vorliegenden Arbeit etabliert und seine Leistungsfähigkeit im Vergleich zu bestehenden Techniken evaluiert werden.

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Größenordnung her mit den über LaserIMD zu ermittelnden Abständen über-einstimmt, spielt die Delokalisierung der Elektronen im Triplettzustand auch für Abstandsmessungen eine Rolle. Eine Untersuchung der Delokalisierung im Triplettzustand mittels Triplett-ESR soll daher durchgeführt werden.

1.2 Zielsetzung und Motivation

In den vergangenen 15 Jahren haben sich Abstandsmessungen mittels dipolarer ESR-Spektroskopie für Strukturuntersuchungen als sehr nützlich erwiesen. So werden über solche Abstandsmessungen Strukturinformationen über Makromo-leküle im Nanometerbereich gewonnen. Die untersuchten MakromoMakromo-leküle sind dabei vor allem biologischer Natur,[1–4]wobei die ESR andere Methoden wie die

XRC oder NMR in der Strukturbiologie komplementär ergänzt.[5,6]Es sind aber

auch Untersuchungen synthetischer Systeme mittels ESR zugänglich.[7–13]Vor

al-lem die gepulsten ESR-Methoden der Doppelquantenkohärenz (englisch Double Quantum Coherence, DQC)[14–16]und Doppel-Elektron-Elektron-Resonanz

(eng-lisch Double Electron-Electron Resonance, DEER)[1,4] werden für diesen Zweck

häufig verwendet.[17]DEER ist eine Technik der gepulsten Elektronendoppelre-sonanz1(englisch Pulsed Electron Double Resonance, PELDOR). Für eine frühere

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Übersicht über PELDOR, s. [13]. Weitere nennenswerte Techniken sind die re-laxationsinduzierte Verstärkung der dipolaren Modulation (englisch Relaxation Induced Dipolar Modulation Enhancement, RIDME)[24] und die Einzelfrequenz-technik zur Refokussierung (englisch Single-Frequency Technique for Refocusing, SIFTER).[25]

Die dipolare ESR-Spektroskopie ist ausschließlich auf paramagnetische Spezi-es anwendbar. Lediglich solche Makromoleküle, die Metallionen, Radikale oder Molekülreste mit einem Triplettgrundzustand enthalten, sind paramagnetisch und weisen daher ein intrinsisches ESR-Signal auf. Die meisten Makromolekü-le jedoch sind diamagnetisch und daher ESR-inaktiv. Dieser Umstand wird ge-zielt genutzt, um spezifische Abstandsinformationen zu erhalten. Mittels SDSL oder chemischer Modifikation werden Paare paramagnetischer Marker an spe-zifischen Stellen der zu untersuchenden Nanostruktur angebracht.[8–13,26–32]Als

paramagnetische Spezies werden hauptsächlich Nitroxide eingesetzt,[30–33]aber

auch andere Arten dauerhaft paramagnetischer Moleküle werden verwendet,[34,35]

darunter Metallzentren in Metalloproteinen[36]oder Metallkomplexe mit Ionen

von Gadolinium,[37–39] Kupfer[40–42] oder Mangan.[43] Es gibt aber auch neuarti-ge Marker organischer Natur, wie jene, die auf dem Gomberg-Radikal (»Trityl«) basieren.[44–46]

DEER und DQC messen die dipolare Wechselwirkung zwischen den

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tronen der Spinmarker, indem sie die magnetische Dipolkopplung von anderen Wechselwirkungen zwischen Elektronen trennen. Aus dieser Dipolwechselwir-kung können im Fall von DEER Abstandsverteilungen im Bereich von ungefähr 1,5–8 nm gewonnen werden.[47]In günstigen Fällen sind auch bis zu 16 nm

mög-lich.[48] Die ESR mit kontinuierlicher Mikrowelleneinstrahlung (englisch

Con-tinouos Wave, CW) erweitert diesen Bereich nach unten bis hin zu 0,5 nm.[47,49]

Kürzlich wurde eine Technik vorgeschlagen, um Abstände in einen Bereich hin-auf zu 20–30 nm zu ermitteln.[50]Zum Vergleich: der über NMR-Spektroskopie

zugängliche Bereich liegt zwischen 0,2 nm[51]und 1,5 nm.[52]FRET erreicht 2–

6 nm,[47,53] unter bestimmten Umständen sind auch bis 10 nm möglich.[47] Die entsprechenden zugänglichen Abstandsbereiche sind in Abbildung 1 zusammen mit den höchsten über Mikroskopie erreichbaren Auflösungen[54]illustriert.

Wei-terhin ist die höchste Auflösung gezeigt, die mit XRC erreicht werden kann (ab-gerufen unter rcsb.org im Februar 2017). Für eine vergleichende Übersicht der Vor- und Nachteile von Abstandsmessungen mittels ESR, FRET und NMR, s. [6].

Aktuelle Entwicklungen von Abstandsmessungen mittels gepulster ESR um-fassen modifizierte[55,56]und neuartige[50,57,58] Pulssequenzen, Erhöhung des ex-ternen Magnetfeldes, der verwendeten Mikrowellenfrequenz und der Mikrowel-lenleistung,[16,59–70]Breitbandanregung mittels frei wählbarer Wellenformen[71,72]

oder auch Kombinationen dieser Möglichkeiten.[73–78]Von spezieller Bedeutung

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−1 0 1 2 3 Abstand (log nm) AFM TEM SEM STORM PALM STED XRM CLSMTIRFM FRET NMR ESR XRC

Abbildung 1:Vergleich der Abstandsbereiche, die über ESR-und

NMR-Spektro-skopie sowie über Bestimmung der FRET-Effizienz zugänglich sind. Hellere Be-reiche sind nur unter günstigen Umständen erreichbar und für den schraffierten Bereich besteht eine theoretische Vorhersage (für Referenzen s. Text). Zum Ver-gleich sind die höchsten, über Mikroskopie erreichbaren Auflösungen markiert. Triplett-Dublett-DEER[79–81]hervorzuheben.2

Diese Weiterentwicklungen sollen die Sensitivität und Datenqualität erhöhen, den über ESR-Spektroskopie zugänglichen Abstandsbereich erweitern oder viel-fältigere Anwendungen ermöglichen. Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist es, eine neue Technik der gepulsten dipolaren ESR vorzustellen und zu implemen-tieren. Diese soll darüber hinaus Kompatibilität mit einigen der zuvor genannten

2Auch über Quartett-Dublett-Elektronenspinecho-Einhüllenden-Modulation (englisch

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ge-Entwicklungen erhalten: die LaserIMD-Spektroskopie.

Das Konzept der gepulsten Elektronenspinresonanz, die theoretischen und ex-perimentellen Rahmenbedingungen sind im folgenden Kapitel ausgeführt. Um eine neue Methode für Abstandsmessungen im Nanometerbereich etablieren zu können war es notwendig, sich den Stand der Technik dipolarer ESR-Spektro-skopie anzueignen. Hierfür wurde diese an aktuelle Fragestellungen anderer Dis-ziplinen der Chemie angewandt (Abschnitt 1.5). Bei der Anwendung von Chro-mophoren als schaltbare Spinmarker war weiterhin ein erweitertes Verständ-nis des lichtangeregten Triplettzustands orgaVerständ-nischer Moleküle hilfreich und ent-sprechende Untersuchungen wurden durchgeführt (Abschnitt 1.6). Schließlich wird das LaserIMD-Experiment mit seinen potentiellen Vorteilen vorgestellt (Ab-schnitt 1.4) und mit Hilfe der gewonnenen Einsichten in Abstandsmessungen und Triplett-ESR etabliert.

1.3 Gepulste Elektronendoppelresonanz

1.3.1 Die Dipolwechselwirkung vermessen

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t τ1 τ1 τ2 τ2 υobs υpump π/2 π π π V(t) t 0 λ 1

Abbildung 2:DEER-Pulssequenz. Zur Veranschaulichung ist links ein

Nitroxid-pulverspektrum pseudoperspektivisch dargestellt. Reproduziert nach Abbildung 2.6 in [85]. Oben rechts ist eine beispielhafte Darstellung typischer DEER-Mess-daten schmaler Abstandsverteilungen nach Hintergrundkorrektur eingesetzt. LaserIMD relevanten Konzepte nachzuvollziehen. Für grundlegendere Beschrei-bungen sei auf die Literatur verwiesen.[1,4,6,84]

Bei DEER (Abbildung 2) werden zumeist zwei Spinmarker mit jeweils einer Gesamtspinquantenzahl von SD = 12 mit zwei verschiedenen

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Wenn Pumppuls und primäres Echo zeitlich aufeinander liegen, ist die Intensi-tät des refokussierten Echos maximal. Symmetrisch um diesen Zeitpunkt herum ist dessen Intensität moduliert. Dieser Zeitpunkt wird zweckmäßigerweise als Zeitnullpunkt verwendet und die Messdaten werden an dieser Stelle auf eins normiert. Entsprechende beispielhafte DEER-Messdaten sind in Abbildung 2 oben rechts eingesetzt. Die Stärke der Modulation wird als Modulationstiefe λ bezeichnet. Je größer diese ist, desto besser ist die Datenqualität, die durch das Modulations-Rausch-Verhältnis quantifiziert wird. Daher werden DEER-Mes-sungen über experimentelle Parameter auf maximale Modulationstiefe einge-stellt (s. u.). Die DEER-Daten weisen im Falle schmaler Abstandsverteilungen Oszillationen auf. Die Frequenz dieser Oszillationen entspricht der Dipolwech-selwirkungsfrequenz, welche in den Spinabstand r umgerechnet werden kann:

ωDD =

D r3

(

1− 3 cos2θ). (1)

Hier ist D die Dipolkopplungskonstante (s. u.) und θ der Winkel zwischen dem Abstandsvektor zwischen beiden Spins und der externen Magnetfeldrichtung. Die Bedeutung dieses Winkels wird im Absatz über Orientierungsauswahl unten näher diskutiert.

1.3.2 Abstandsverteilungen sind zugänglich

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auswert-bar sind. Die Abstandsanalyse ist daher im vorherigen Abschnitt stark verkürzt dargestellt. Oft werden Regularisierungsverfahren (speziell Tikhonov-Regulari-sierung, s. [86]) eingesetzt, um modellfreie Abstandsverteilungen zu finden, die die experimentellen Daten gut beschreiben.

Aber auch Abstandsverteilungsmodelle, etwa wenn Spinmarker auf einer Ku-geloberfläche verteilt sind, können zur Analyse verwendet werden.[87–91] Diese

und andere Verfahren, um DEER-Daten auszuwerten, sind bereits etabliert[92]

und in benutzerfreundlichen, frei verfügbaren Softwarepaketen umgesetzt; die wichtigsten sind DeerAnalysis,[93]LongDistances3und GLADD/DD.[94]Weitere

Ansätze und Verbesserungen in der DEER-Datenanalyse sind Bestandteil aktuel-ler Entwicklungen.[95–98]

Für die Ermittlung von Abstandsverteilungen über das Frequenzspektrum, das über Fourier-Transformation der Messdaten gepulster, dipolarer ESR-Spektro-skopie gewonnen wird, wird üblicherweise eine Reihe von Annahmen verwendet (für Details sei auf [6, 45, 51] verwiesen):

1. die Dipolwechselwirkung ist wesentlich kleiner als die Elektronen-Zee-man-Wechselwirkung

2. der g-Faktor ist isotrop

3. die Differenz zwischen den Resonanzfrequenzen beider Spins ist viel grö-ßer als die Dipolkopplung

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4. die ungepaarten Elektronen sind punktförmig lokalisiert

1.3.3 Zugänglicher Abstandsbereich und Genauigkeit

Während Annahmen 1 und 2 sowohl bei DEER als auch bei LaserIMD als Nä-herungen gut gerechtfertigt sind4, trifft Annahme 3 bei Abständen≤ 1,5 nm für

DEER mit Nitroxiden nicht zu.

Im Bereich schwacher Kopplung ist die Differenz zwischen den Resonanzfre-quenzen beider Spins A und B (s. Abbildung 3 (b)) viel größer als die Dipolkopp-lung: A − ωB| ≫ |ωDD|. Dies ist, wie oben gesagt, bei DEER mit Nitroxiden

oberhalb von 1,5 nm der Fall. Die Dipolwechselwirkungskonstante D in Glei-chung (1) nimmt dann die bekannte Form an:[25,45]

Dschwach =

μ0μ2BgAgB

. (2)

Im Bereich starker Kopplung (|ωA− ωB| ≪ |ωDD|) hingegen beträgt die

Dipol-wechselwirkungskonstante Dstark = 32Dschwach.[25,45] Im Übergangsbereich

zwi-schen 1,0–1,5 nm ist die Präzision der Abstandsmessung mit Abweichungen von bis zu 15 % beeinträchtigt.[9] Dies kann über genauere Simulationen allerdings

minimiert werden,[99]was im Fall von SIFTER[25]oder Tritylmarkern[45]auch für längere Abstände gemacht wird.

Annahme 4 ist als Punkt-Dipol-Näherung bekannt (s. S. 414 in [100] und

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Magnetfeld-tel 2.4 in [51]) und trifft für DEER mit Nitroxiden gut zu.[1]Je nach Spinabstand

r und Größe des π-Elektronensystems schlägt diese für Tritylmarker,[45] Kupfer-porphyrinmarker,[101]Metallcluster in Proteinen,[102]Triplett-Dublett-DEER[79,80] und folglich eventuell auch bei LaserIMD fehl. Der Dipolwechselwirkungsten-sor ist in diesem Fall zwar nicht im Allgemeinen axialsymmetrisch,[51]dennoch

konnte die Spindelokalisierung in den zuvor genannten Fällen unter der Annah-me von AxialsymAnnah-metrie durch eine mit der Spindichte gewichtete SumAnnah-me über alle Atompositionen berücksichtigt werden:[103]

ωDD =Dm,n ρmρn (1− 3 cos2θ mn) r3 mn . (3)

1.3.4 Experimentelle Bedingungen

Im vorhergehenden Abschnitt wurden die Grenzen dargestellt, die sich physika-lisch für die Elektronendoppelresonanz ergeben. Diese hängen natürlich auch mit experimentellen Rahmenbedingungen zusammen, von denen jene im fol-genden dargestellt sind, bei denen LaserIMD (s. Abschnitt 1.4) Verbesserungen verspricht.

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ent-sprechend gewählt wird. Die Beobachtungsfrequenz wird dann auf ein Neben-maximum gelegt. Diese Frequenzwahl ist in Abbildung 3 (b) am Beispiel von Nitroxiden im X-Band gezeigt. Beobachtungs- und Pumpfrequenz sind hier mit ωAund ωBmarkiert. Durch diese Wahl verliert man etwas an Signalqualität des

refokussierten Echos, was aber durch die höhere Modulationstiefe λ überkom-pensiert wird. Der Abstand zwischen beiden Frequenzen wird durch die Band-breiten der Pulsanregung und des Resonators oder aber über die spektrale Breite der verwendeten Spinspezies vorgegeben (s. u.). Diese Überlegungen gelten zwar allgemein, gleichzeitig werden aber in speziellen Fällen die Frequenzen anders gewählt, z. B. bei Orientierungsauswahl (s. u.).

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limitiert die spektrale Breite der verwendeten Spinspezies den möglichen Fre-quenzunterschied zwischen Pump- und Beobachtungsfrequenz. Bei DEER im X-Band wird beispielsweise eine Pumppulslänge von 12 ns gewählt, um Puls-überlappung zu vermeiden, wenngleich kürzere Pulslängen möglich wären. Kernmodulationen Trotz sorgfältiger Wahl von Pulslängen (Bandbreite der Pulsanregung) und Frequenzunterschied überlappen sich die Anregungsbanden der Pump- und Beobachterpulse zu einem kleinen Teil. Hierdurch werden Os-zillationen mit einer Frequenz, die der Larmorfrequenz räumlich benachbarter Kernspins entspricht, sogenannte Kernmodulationen, in den DEER-Daten er-zeugt. Für die Zeitskala, auf der das DEER-Experiment stattfindet, besitzen Pro-tonen oder Deuteronen relevante Kern-Larmorfrequenzen. Ein Mittelungsver-fahren wird eingesetzt, um diese Artefakte zu minimieren. Kernmodulationen treten sowohl bei DEER[104]und DQC[105]als auch bei RIDME[58]auf.

zugänglicher Abstandsbereich Die magnetische Dipolwechselwirkungs-frequenz hängt nicht nur vom Spin-Spin-Abstand ab, sondern auch vom Win-kel θ zwischen externem Magnetfeld und Verbindungsvektor zwischen den bei-den Elektronenspins (s. Gleichung (1)). Hierdurch ergibt sich nicht nur eine be-stimmte Dipolwechselwirkungsfrequenz, sondern ein ganzes Dipolwechselwir-kungsspektrum, ein sogenanntes Pake-Spektrum[106] wie in Abbildung 3 (d)

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Anregungsbandbrei-te bestimmt,[49,107] die bei kürzeren Abständen zwischen den Elektronenspins

(hohe Dipolwechselwirkungsfrequenz) nicht mehr das gesamte Pake-Spektrum abdeckt. Andererseits wird darüber hinaus in allen zuvor genannten Software-paketen zur Auswertung von DEER-Daten vom Bereich schwacher Kopplung ausgegangen (s. o.).

Orientierungsauswahl Selektive Mikrowellenpulse (s. o.) regen Spinmarker mit nur bestimmten Orientierungen relativ zum externen Magnetfeld an, wenn ihre Spektren anisotrop verbreitert sind. Dies ist u. a. bei Nitroxiden der Fall, wie in Abbildung 3 gezeigt. Der Pumppuls auf dem Maximum des Nitroxidpulver-spektrums erreicht sämtliche Spins, deren Molekülhauptachsen x und y paral-lel zum externen Magnetfeld sind. Die Beobachterpulse erreichen diese jedoch nicht. Sind also die Hauptachsensysteme beider Nitroxide, die als Marker an ei-nem Makromolekül angebracht sind, relativ zueinander immer gleich orientiert, können diese Paare nicht mittels DEER beobachtet werden. Bedingt beispielswei-se die Orientierung eines Nitroxidmarkers des Paares mit beispielswei-seiner x-Achbeispielswei-se parallel zum externen Magnetfeld eine gleiche Orientierung des anderen Nitroxidmar-kers, wird dieses Paar nur gepumpt, aber nicht beobachtet. Um diesen Effekt zu unterdrücken, wird das DEER-Experiment mit unterschiedlichen spektralen Po-sitionen von Pump- und Beobachterpulsen durchgeführt. Es wird also über ver-schiedene Orientierungen spektral gemittelt.[10,108,109]Auf der anderen Seite kann

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Abbildung 3:Orientierungsauswahl bei Nitroxiden im X-Band. Leicht angepasst aus [1]. (a) Molekülachsensystem mit simulierten CW-ESR-Spektren entlang der Hauptachsen. (b) Echodetektiertes ESR-Spektrum (schwarz, Überlagerung der Absorptionsspektren aller Orientierungen). Orientierungsauswahl kann unter-drückt werden, indem das externe Magnetfeld B0 verschoben wird, was einer

Verschiebung der Beobachter- und Pumppositionen entlang der roten und blau-en Liniblau-en blau-entspricht. (c) Abstandsvektor zwischblau-en Spin A (rot) und B (blau) der Länge ribei einem Winkel von θimit dem magnetischen Feldvektor ⃗B0. (d)

Dipola-res Spektrum (Pake-Spektrum, durchgezogene Linie), wie es mit DEER detektiert wird, sowie Zugehörigkeit der Frequenz ωee,izum Winkel θi(orange gepunktete

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Bandbreite: Resonator Unter Umständen steht nicht genügend Mikrowel-lenleistung oder Resonatorbandbreite zur Verfügung, um Pulslängen und -fre-quenzen wie oben beschrieben optimal für DEER zu wählen. So war die Mikro-wellenleistung beim kommerziell erhältlichen gepulsten Q-Band-Spektrometer von Bruker zum Zeitpunkt dieser Doktorarbeit begrenzt. Gleichzeitig bietet das Q-Band eine höhere Sensitivität,[62]sodass sich ein Kompromiss dennoch lohnt.

Für maximale Modulationstiefe wurde der Resonator für Q-Band-DEER wäh-rend dieser Arbeit (s. [8]) kritisch gekoppelt, die Mikrowellenleistung maximal gewählt und so der Pumppuls so kurz wie möglich eingestellt. Im Gegenzug wird die Beobachterpulsleistung und Sensitivität durch die verringerte Bandbreite des Resonators verkleinert. Darüber hinaus kann die Beobachtungsfrequenz so nicht auf ein Nebenmaximum eingestellt werden.

1.4 LaserIMD

Die Pulssequenz von LaserIMD ist in Abbildung 4B gezeigt. Zum direkten Ver-gleich ist noch einmal die Pulssequenz von DEER in Abbildung 4A dargestellt. Bei LaserIMD wird ein konventioneller, persistenter Spinmarker mit einer Ge-samtspinquantenzahl von SD = 12als beobachtete Spezies verwendet. Es können

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Anre-π π 2 π π π π 2 echo V(t) laser prim. echo echo V(t) τ2 νobs V(t) V(t) τ1 τ1 τ2 τ τ νobs νLaser

A

B

t νpump t 0 t' t'max 0 t'– t'±,max t'+ 0

Abbildung 4:A: Pulssequenz des DEER-Experiments. B: Entsprechende

Pulsse-quenz von LaserIMD. Reprinted (adapted) with permission from [112]. Copy-right 2016 American Chemical Society.

zahl von ST = 1 zunutze zu machen. Die optische Anregung durch einen mit

einem Laser erzeugten Lichtblitz tritt also an die Stelle der Anregung mit der Pumpfrequenz.

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dem DEER-Experiment mit drei Pulsen,[20] liefert im Gegensatz hierzu

aller-dings totzeitfreie Daten. Der Ausdruck, der das zeitliche Verhalten des LaserIMD-Signals beschreibt, ist im entsprechenden Artikel ausgeführt.[112] LaserIMD hat einige mögliche Vorteile gegenüber DEER.[112,113]

optimale Beobachtungsfrequenz Bei LaserIMD kann das Maximum des Spektrums des persistenten Radikals detektiert werden, ohne an Modulationstie-fe zu verlieren. Dies erhöht die Sensitivität gegenüber DEER. Gleichzeitig bleibt der Vorteil einfacher Hintergrundkorrektur durch Faktorisierung der Messdaten in Form- und Hintergrundfaktor erhalten. Dies ist bei anderen Einfrequenztech-niken wie DQC oder SIFTER nicht der Fall.[1]

optimale Beobachterpulslängen Als Einfrequenztechnik benötigt Laser-IMD keine zweite Mikrowellenfrequenz. Daher benötigt man keine große Band-breite des Resonators, was eine hohe Güte ermöglicht. Daraus resultiert bei gleich-bleibender Eingangsleistung eine höhere Mikrowellenleistung im Resonator. Da-mit einher gehen kürzere Pulslängen und eine erhöhte Sensitivität bei der Detek-tion.

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niedrigere untere Abstandsgrenze Durch die praktisch unendliche Anre-gungsbandbreite des Lichtblitzes bei LaserIMD wird die untere Abstandsgren-ze allein durch die Beobachterpulsbandbreiten bestimmt (mit anderen Worten: durch die entsprechenden Pulslängen).[114]Das Triplettspektrum ist um zwei bis

drei Größenordnungen größer als die Dipolwechselwirkung, wodurch die Be-dingungen für schwache Kopplung[9,51]besser erfüllt sind und die Präzision von

Abstandsmessungen unter 1,5 nm erhöht wird.

praktisch unendliche Anregungsbandbreite, keine Orientierungsaus-wahl Der Lichtblitz regt Chromophore aller Orientierungen an, was einer Breitbandanregung des gesamten ESR-Spektrums entspricht. Damit wird eine Orientierungsauswahl der gepumpten Spins verhindert und gleichzeitig poten-tiell die Modulationstiefe erhöht.

kürzere und einfachere Pulssequenz Der Lichtblitz interferiert nicht mit den Mikrowellenpulsen. Damit kann eine einfache Hahn-Echo-Sequenz verwen-det werden, was dennoch totzeitfreie Daten liefert.

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die-ser Arbeit durch eine Anwendung an einem Beispielmakromolekül illustriert werden. Proteine, die ein Häm als prosthetische Gruppe tragen, wären hierbei besonders interessant. So könnte das Häm möglicherweise als Chromophor für LaserIMD nutzbar gemacht werden, ohne auf ein paramagnetisches Zentrali-on[75,115]zu setzen.

Neben der entsprechenden Veröffentlichung in Abschnitt 2.3 sei für Details auf die Masterarbeit von Dennis Bücker verwiesen.[116]

1.5 Anwendung von Abstandsmessungen im

Nanometerbereich

1.5.1 Allgemeines

Um eine neue Methode der gepulsten dipolaren ESR-Spektroskopie zu etablie-ren, war es notwendig, sich mit dem Stand der Technik bestens vertraut zu ma-chen. Am besten geeignet schienen Anwendungen von Abstandsmessungen auf relevante Fragestellungen aus anderen Disziplinen der Chemie.

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die enzymatische Hydrolyse mittels ESR zu verfolgen. Diese Arbeit zeigt, dass für solche Anwendungen die ESR-Spektroskopie Fluoreszenzmethoden komple-mentär ergänzen kann.

Bei der zweiten Fragestellung ging es um Ketten konjugierter Polymere, die üblicherweise als starr betrachtet werden. Es blieb unklar, wie sich einzelne Ket-ten an eine Umgebung in Nanopartikeln konformatorisch anpassen, spezifisch in Fällen, bei denen die Nanopartikel kleiner sind als die Kettenlänge. Als konjugier-te Polymere wurden Oligo(p-phenylenethinylen)e (OPEs) verwendet, die in der AG Mecking der Universität Konstanz mit definierter Länge synthetisiert wur-den. Um die Kettenkonformation in unterschiedlichen Umgebungen in Form des Ende-zu-Ende-Abstands mittels ESR beobachten zu können, wurden die OPEs an beiden Kettenenden mit Nitroxiden markiert. Solche doppelt markier-ten OPE-Ketmarkier-ten wurden nun in Nanopartikel, die ebenfalls aus OPEs gebildet wurden, eingebracht. Die so speziell präparierten Sonden erlaubten erstmals die Untersuchung der Kettenkonformation innerhalb solcher Nanopartikel, s. [8].

1.5.2 Beobachtung enzymatischer ATP-Hydrolyse

Enzymassays haben unter anderem die Aufgabe, Enzymaktivität aufzuklären. Entsprechend sind Enzymassays wichtige experimentelle Techniken, die zum Beispiel bei der Wirkstoffsuche in der Pharmaforschung eingesetzt werden und entsprechend gut in der Literatur abgebildet sind.[118–121] Eine Möglichkeit,

(36)

Abbildung 5:Beispiel für die Beobachtung einer enzymatischen Spaltung, ent-nommen aus [122]. a) Mechanismus der Aktivierung von Ubiquitin durch UBA1. Ubiquitin wird an UBA1 durch die Bildung einer Thioesterbindung angebunden. Dabei wird ATP verbraucht. AMP: Adenosinmonophosphat, PP: Pyrophosphat. b) Konzept der Signalisierung des ATP-Verbrauchs. Beim intakten ATP-Analo-gon fluoresziert der Akzeptor (A) nach Anregung des Donors (D) aufgrund von FRET. Nach der Spaltung durch UBA1 wird die Donorfluoreszenz beobachtet. Substrats. Dies hat den Vorteil, dass die Enzymaktivität zumeist mit dem vom As-say produzierten Signal direkt zusammenhängt und so Messartefakte vermieden werden.[120]

Ein wichtiges Beispiel für ein solches Verfahren ist die Verwendung fluoro-phormarkierter Substrate für FRET. Dabei wird ein Fluorophor-Quencher- oder Fluorophor-Fluorophor-Paar durch die enzymatische Spaltung in der Reaktions-lösung räumlich getrennt. Dies erzeugt dann ein Signal in Form erhöhter Fluores-zenz oder verschobener Emissionswellenlänge.[120]Dieses Prinzip ist beispielhaft

(37)

Stephan Hacker hat während seiner Promotion in der AG Marx doppelt farb-stoffmodifizierte ATP-Analoga synthetisiert. Das Ziel dieser Synthesen war, die enzymatische Spaltung von ATP direkt zu visualisieren.[123] Hierfür wurde zu-nächst die Stabilität der Anbindung eines 6-Azidohexylrestes (der später die An-bindungsfunktion für die Spinmarkierung bereithält) über Stickstoff, Sauerstoff und Kohlenstoff am Phosphatrest des ATPs untersucht.[124]Anschließend wurden

an Nukleobase und Ribose unterschiedlich modifizierte ATP-Analoga als Sonden für die Substratspezifität ATP-spaltender Enzyme verwendet.[125] Die

Kombina-tion dieser beiden ATP-ModifikaKombina-tionen erlaubt folglich die Markierung von ATP sowohl am Oligophosphat als auch an Nukleobase oder Ribose. Zur Beobachtung der ATP-Spaltung wurde ATP an unterschiedlichen Positionen mit verschiede-nen Chromophoren für FRET markiert[126]und so die Spaltung während der

Ak-tivierung von Ubiquitin mit UBA1 direkt verfolgt.[122]Für weitergehende

Litera-tur über phosphatmodifizierte Nukleotide zur Beobachtung der Enzymaktivität sei auf [127] verwiesen.

Die Beobachtung einer Spaltungsreaktion mittels ESR verfolgt einen zu FRET verwandten Ansatz. Hierbei nutzt man Änderungen im ESR-Spektrum aufgrund der abstandsabhängigen Austausch-[128]oder Dipolwechselwirkung.[89]Letzteres

kann auch mittels DEER in eine Abstandsverteilung überführt werden, deren zeitliche Änderung Aufschluss über die Reaktionsgeschwindigkeit gibt.[89]

(38)

anwendbar. Enzyme sind zumeist substratspezifisch und eine sterisch anspruchs-volle Anbindung von Markern am Substrat könnte dessen Akzeptanz durch das Enzym vermindern.

Könnte die Spaltungsreaktion beispielsweise über zeitliche Änderung der Di-polwechselwirkung auch dann verfolgt werden, wenn große und flexible synthe-tische Substrate eingesetzt werden, so würde dies die Untersuchung einer Viel-zahl von Enzymen ermöglichen. Die Vorarbeiten in der AG Marx auf dem Gebiet der fluoreszenzbasierten Verfolgung der ATP-Spaltung wurden dazu eingesetzt, diese Frage zu klären. Es konnte gezeigt werden, dass die Verfolgung der hydro-lytischen Spaltung von ATP möglich ist, vor allem wenn die Spinmarker flexibel angebunden sind. Als Beispielenzym wurde eine Phosphodiesterase, extrahiert aus dem Gift von Crotalus adamanteus,[129,130]verwendet.

(39)

1.5.3 Kettenkonformation konjugierter Polymere in

Nanopartikeln

Die Synthese kleinster Maschinen[137] wurde im vergangenen Jahr (2016) mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.[138] Für einige solcher

Konstruktio-nen werden starre Verbindungselemente benötigt. Hierfür könKonstruktio-nen kurze, para-konjugierte Polymere als rigide Stäbchen[139] verwendet werden. Entsprechend

wurde bei der Synthese eines elektrisch angetriebenen vierrädrigen Moleküls ein para-konjugiertes Oligomer zur Verbindung molekularer Motoren[140]

einge-setzt.[141]In einer ähnlichen Arbeit wurden kettensteife OPEs[142–145]als Bauteile

für ein thermisch angetriebenes vierrädriges Molekül verwendet.[146,147]

Doch in ihrer Eigenschaft als starre Stäbchen eignen sich OPEs auch für ande-re supramolekulaande-re Architektuande-ren, z. B. für formerhaltende Makrozyklen,[148,149]

als Rahmenelemente in metallorganischen Gerüststrukturen (englisch Metal-Or-ganic Framework, MOF)[150,151]oder als Abstandshalter zwischen elektronisch

in-teragierenden Resten.[152–154]Sie wurden entsprechend intensiv untersucht.[155]

Aufgrund dieser Anwendungen ist die intrinsische Flexibilität von OPEs von speziellem Interesse und wurde unter anderem mit DEER aufgeklärt.[10,108] Für

(40)

ro-Abbildung 6:Bindungsvektoren im Kugel-Stab-Modell der frei rotierenden Ket-te. Der Bindungswinkel θb ist an allen Verknüpfungspunkten ri konstant.

Ent-nommen aus [156].

tierende Kette5als ein solches Modell verwendet werden. Die Kette wird dabei

in einzelne Segmente gleicher Länge|Δri| = b = const. aufgeteilt, wie in

Abbil-dung 6 gezeigt. Die Segmente schließen an ihren Verknüpfungspunkten rieinen

festen Winkel θb=const. ein.

Durch die π-Konjugation in PPEs sind diese starrer als Polymere mit nicht-konjugierten Bindungen, man nennt PPEs daher halbflexibel oder halbrigide. Entsprechend bevorzugen PPEs daher eine möglichst gerade Ausrichtung ihrer Kette. Sie erinnern weniger an ein Wollknäuel, sondern eher an eine Angelseh-ne oder eiAngelseh-nen dünAngelseh-nen Draht, wie in Abbildung 7 veranschaulicht. Um dies in den Parametern der frei rotierenden Kette entsprechend abzubilden, wählt man einen sehr kleinen Winkel θbund eine sehr kurze Segmentlänge b. Dieser

(41)

Ne-Abbildung 7:Eine lange wurmartige Kette entspricht dem hier gezeigten Fa-denmolekül, entnommen aus [157]. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Reproduced with permission. Die verwendete Größe der Vorzugslänge Amist die heute gängige Kuhn’sche Segmentlänge, der Bindungslänge bidealeiner

idealen Kette, und entspricht dem doppelten der Persistenzlänge: bideal =2Lp.[156]

ben PPEs gehören DNS-Doppelstränge zu typischen Polymeren, die auf diese Weise beschrieben werden.[156,159]

Legt man an einen Punkt der wurmartigen Kette eine Tangente an, so sind Tan-genten in zunehmendem Abstand zunehmend wahllos orientiert. Die TanTan-genten verlieren exponentiell ihre Richtungskorrelation zueinander. Die Abklinglänge der Korrelation der Tangentenorientierungen entlang der Kette wird als Persis-tenzlänge Lpbezeichnet. Die Persistenzlänge hängt von Lösungsmittel,

Tempera-tur und Konzentration ab. Insbesondere die TemperaTempera-turabhängigkeit[160]ist hier

(42)

Lp =EI/(kbT). (4)

Hierbei ist E das Young’sche Modul der Kette und I das axiale Flächenmoment 2. Grades. Das Produkt EI ist daher ein Maß für die Biegsamkeit oder Biegefes-tigkeit der Kette.

Für kurze Ketten wie OPEs treten beim WLC-Modell zwei Probleme auf.[10,108]

Zum einen kann die Bindungslänge b nicht mehr als sehr kurz betrachtet werden, da bereits die Bindungslängen nicht mehr erheblich kürzer sind als die Ketten-länge eines OPEs. Allerdings kann sich das OPE lediglich an den Atomen biegen, die Bindungen sind hingegen steif. Zum anderen tritt nicht ausschließlich ein be-stimmter Winkel θb ̸= 0 auf, vielmehr ist eine Verteilung von Winkeln mit einem

Maximum beim Winkel null anzunehmen. Dies führt zum Modell der harmoni-schen segmentierten Kette (englisch Harmonic Segmented Chain, HSC), bei dem der Winkel zwischen zwei konsekutiven Segmenten am Verknüpfungspunkt ri

gemäß einer Wahrscheinlichkeitsverteilung ausgewählt wird, die einem harmo-nischen Potential entspricht.[10,108]Dies ist in Abbildung 8 für ein OPE illustriert.

Konjugierte Polymere besitzen eine Vielzahl interessanter elektronischer Ei-genschaften,[161,162]weshalb auch angeregte Zustände dieser Moleküle ein span-nendes Feld sind.[163] Darauf greifen die Untersuchungen des Triplettzustandes

(43)

Partikel-Abbildung 8:Visualisierung der Flexibilität eines OPEs. Eine Überlagerung von 25 Strukturen, die über das HSC-Modell simuliert wurden, ist gezeigt. Der mitt-lere Richtungsvektor ist entlang der (1,1,1)-Richtung. Reprinted (adapted) with permission from [10]. Copyright 2010 American Chemical Society.

größen bis hinab zu 8 nm berichtet.[175]Derart kleine Nanopartikel stehen im

Wi-derspruch zu den obigen Ausführungen, wonach konjugierte Polymere als starr zu betrachten sind.

Daraus folgt die überaus spannende Frage, welche Konformation die eigentlich rigiden Stäbchen in solchen Partikeln annehmen. Um die Kettenkonformation experimentell zu untersuchen, ist die Verteilung des End-zu-End-Abstands hilf-reich. Fluoreszenzbasierte Techniken können für stark fluoreszierende Partikel wie jene aus OPEs nur schwer angewendet werden.

(44)

OPE. Aus diesen Blockcopolymeren wurden mittels Nanoprezipitation stabile Dispersionen entsprechender Nanopartikel hergestellt. Bei der Nanoprezipitati-on wird das Blockcopolymer in einem wassermischbaren Lösungsmittel in hoher Konzentration gelöst und dann schnell in ein größeres Volumen Wasser einge-spritzt. Durch Variation von Kettenlänge und Konzentration des OPEs konnte gezeigt werden, dass die Partikelgröße von der Kettenlänge bestimmt wird.[177]

Aus diesen Arbeiten heraus hat Friederike Schütze eine ganze Reihe nützlicher DL-OPEs (doppelt end-markierte OPEs) dargestellt, indem sie Nitroxidspinmar-ker anstelle der PEG-Reste an beide Enden des OPEs angebracht hat. Diese dop-pelt markierten OPEs wurden für ESR-Experimente verwendet, um der Frage nach der Kettenkonformation in Nanopartikeln nachzugehen.

Bei den zuvor genannten Nanopartikeln aus Blockcopolymeren aus PEG und OPE ergab sich ein interessantes Phänomen. Aus obigen Ausführungen könn-te man folgern, dass der Partikeldurchmesser direkt über die Ketkönn-tenlänge vor-gegeben ist. Allerdings bilden Blockcopolymere mit kurzem OPE-Kern6etwas

größere Partikel als die Kettenlänge des OPEs vermuten lässt. Mischt man ein Blockcopolymer mit kurzem OPE-Kern mit einem geringen Anteil eines mehr als doppelt so langen OPEs7, so erhält man erheblich kleinere Partikel. Diese

Mischung ist daher ein ideales Modellsystem, um die Kettenkonformation des langen, beigemischten OPEs innerhalb der kleinen Partikel zu untersuchen. Der Partikeldurchmesser entspricht in diesem Fall weniger als der Hälfte der

(45)

Abbildung 9:Schematische Darstellung der Partikelbildung aus dem amphiphi-len Blockcopolymer PEG-OPE9 (der OPE-Kern ist als grüner Stab dargestellt, die PEG-Ketten als blaue Fäden) und doppelt endmarkiertem DL-OPE21 (die Spinmarker sind als rote Sterne dargestellt). Reproduced from Ref. [8] with per-mission from the PCCP Owner Societies.

(46)

1.6 Untersuchung der Triplettzustände

organischer Moleküle

1.6.1 Allgemeines

Nachdem der Stand der Technik hinsichtlich gepulster dipolarer ESR-Spektro-skopie im vorangegangenen Abschnitt erarbeitet wurde, musste nun Expertise in der ESR angeregter Triplettzustände organischer Moleküle aufgebaut wer-den. Entsprechende Moleküle, die eine Funktion über ihre Wechselwirkung mit Licht (hier: Absorption) erfüllen, nennt man Chromophore (altgriechisch χρῶμα (chrṓma) ›Farbe‹, φορός (phorós) ›tragend‹). Zumeist ist ihre Funktion naheliegen-derweise die Farbgebung als Pigment oder Färbemittel.

Nachdem ein Chromophor Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbiert hat, hat er verschiedene Möglichkeiten, die entsprechende Energie wieder abzu-geben. Die so involvierten Prozesse und Energieniveaus sind in einem Jabłoński-Diagramm in Abbildung 10 dargestellt. Für diese Arbeit am wichtigsten ist der Triplettzustand, im Diagramm mit T1bezeichnet. Dieser entspricht in den

meis-ten Fällen nicht dem Grundzustand des Chromophors. Der Grundzustand ist zumeist ein Singulettzustand S0und ist mit einem Gesamtspin von S = 0 nicht

ESR-aktiv. Durch Absorption von Licht kann der Chromophor in seinen ersten angeregten Zustand S1, ebenfalls ein Singulettzustand, überführt werden. Von

(47)

wie-E S0 S1 T1 ISC ISC VR VR VR absorption uor escenc e phosphor escenc e IC/VR

Abbildung 10:Jabłoński-Diagramm, entnommen aus [178]. Strahlende Prozesse

sind entsprechend ihrer Energie eingefärbt, abnehmend von blau nach rot. ISC ist durch gepunktete Pfeile markiert. Gewellte Pfeile zeigen vibronische Rela-xation (VR) und interne Konversion (englisch Internal Conversion, IC) an. Mit dünneren Linien gezeichnete Energieniveaus sind höhere vibronische Zustände des entsprechenden niedrigeren elektronischen Niveaus.

derum in den Grundzustand S0relaxiert.

Für die Verwendung eines Chromophors durch Anregen in seinen Triplett-zustand für Abstandsmessungen sind vor allem zwei Aspekte seiner vielen Ei-genschaften relevant: sein zeitliches Verhalten (Kinetik) sowie seine räumliche Ausdehnung (Delokalisierung).[79,80]

(48)

Triplettkinetik zu kennen. Speziell hilfreich ist es, die exakten kinetischen Pa-rameter eines im LaserIMD-Experiment eingesetzten Chromophors zu kennen oder zu ermitteln. Hierüber wurde ein Übersichtsartikel erarbeitet, s. [178].

Üblicherweise wird bei der dipolaren ESR-Spektroskopie davon ausgegangen, dass die Elektronen, zwischen denen die Abstandsmessung eigentlich stattfin-det, in einem Molekül punktförmig lokalisiert sind. Diese Annahme schlägt sich in der verwendeten Punktdipolnäherung nieder.[1,106] Diese gilt für die

größe-ren π-Elektronensysteme im Triplettzustand unter Umständen nicht. Die bereits zuvor vorgestellten OPEs dienen hier als geeignete Modellsysteme, um die De-lokalisierung des Triplettzustands in Abhängigkeit von der Ausdehnung des π-Elektronensystems zu untersuchen, s. [179].

1.6.2 Triplettkinetik

Vor beinahe 60 Jahren entdeckten Hutchison und Mangum mittels ESR, dass der phosphoreszierende Zustand von Naphthalen ein Triplettzustand ist.[180]

Unge-fähr zehn Jahre später entdeckten van der Waals et al. die optische Spinpolarisie-rung (OSP) in Triplettzuständen.[181]OSP beschreibt, dass die Unterzustände des Tripletts nach dem ISC nicht entsprechend einer Boltzmannverteilung populiert sind wie im thermischen Gleichgewicht. Seitdem wurden angeregte Triplettzu-stände intensiv untersucht. Dabei spielte die ESR-Spektroskopie eine wichtige Rolle.[182]

(49)

Triplettzustän-de vielseitige praktische Anwendungen, wie z. B. Photosensibilisierung,[183]

Pho-tovoltaik,[184]organische elektrolumineszente Vorrichtungen[185]und Photonen-umwandlung zu höherer Energie.[186]In der NMR-Spektroskopie nutzt man die OSP angeregter Triplettzustände, um mittels dynamischer Kernpolarisation (eng-lisch Dynamic Nuclear Polarisation, DNP) sehr hohe Spinpolarisierungen von Pro-tonen zu erreichen.[187,188]

Die OSP wird durch ungleiche Be- oder Entvölkerung der Triplettunterzustän-de hervorgerufen. Für die zuvor genannten Anwendungen kann es wichtig sein, die entsprechenden kinetischen Parameter zu ermitteln. Die involvierten Zustän-de und Übergänge sind in Abbildung 11 vereinfacht dargestellt. Es gibt eine Reihe von Übersichtsartikeln, die die Entwicklung der ESR[182]zur Charakterisierung

der Triplettkinetik nachzeichnen.[189–191] Zunächst geschah dies über CW-ESR

unter kontinuierlicher Lichteinstrahlung im stationären Zustand,[192,193] später

über zeitaufgelöste Verfahren wie direkt detektierte ESR (englisch Direct Detec-tion, DD)[194–196] oder die gepulste ESR.[197,198] Auf besonders breites Interesse

stieß die Charakterisierung des Triplettzustands über Magnetresonanz in einem besonderen Fall: bei der Untersuchung jener Chromophore, die bei der Photo-synthese eine Rolle spielen.[199–204]

(50)

Quantenaus-Abbildung 11:Schema der Übergänge zwischen den Triplettunterzuständen, in diese hinein und heraus. Inhaltsverzeichnisgrafik von [178]. Die gepunkteten Pfeile zeigen strahlungslosen (ISC) und strahlenden (Phosphoreszenz) Zerfall ge-meinsam an.

beuten, Lebenszeiten, Nullfeldaufspaltungsparametern (englisch Zero-Field Split-ting, ZFS) und optischen Spektren[205]zur Verfügung stehen, gibt es keine

Samm-lung beispielsweise der Spin-Gitter-Relaxationsraten. Daher musste die relevan-te Lirelevan-teratur gesammelt und nach experimenrelevan-tellen Techniken, Auswerrelevan-teverfahren und Daten gesichtet werden. Aus dieser Literatursammlung ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Übersichtsartikel über die ESR-Techniken zur Charakte-risierung der Triplettkinetik entstanden. Er enthält auch eine Auflistung, welche kinetischen Parameter in welcher Literaturstelle zu finden sind unter Angabe der verwendeten Matrix oder des Lösungsmittels und des untersuchten Temperatur-bereichs.

Eine verwandte, aber hier weniger nützliche und daher nicht verwendete oder besprochene Technik zur Beobachtung des Triplettzustands ist die optisch de-tektierte Magnetresonanz (ODMR).[206,207]Der Übersichtsartikel in dieser Arbeit

(51)

1.6.3 Delokalisierung kohärenter Triplettexzitonen in OPEs

Konjugierte Polymere besitzen eine Vielzahl interessanter elektronischer Eigen-schaften[161,162,208] wie beispielsweise Photo- und Elektrolumineszenz.[167,209,210]

Als Halbleiter ermöglichen sie lichtinduzierte Ladungstrennung[211] und

kom-men beispielsweise in optoelektronischen Geräten[212]oder als Chemo- und

Bio-sensoren[213] zum Einsatz. Zur Illustration ein Beispiel: modifizierte OPEs kön-nen als molekulare Zungen unterschiedliche Fruchtsäfte unterscheiden.[214] Es

liegt daher nahe, dass angeregte Zustände konjugierter Polymere im Allgemei-nen von großer Bedeutung sind.[163] Um nun Moleküle für die oben genannten

Anwendungen gezielt anzupassen, ist es unter anderem notwendig, angeregte Triplettzustände konjugierter Polymere zu verstehen. Triplettzustände können in dieser Hinsicht gleichzeitig Vor- sowie Nachteile besitzen.[215]

Eine wichtige Klasse konjugierter Polymere für solche Anwendungen sind PAEs.[142–144]Die OPEs, die bereits in Abschnitt 1.5.3 besprochen wurden, können

als Modellverbindungen für PAEs verwendet werden. Monodisperse Oligomere erlauben eine genaue Extrapolation der Struktur-Eigenschafts-Beziehungen hin zu jenen der jeweiligen Polymere.[216]Dies ist dann von großer Bedeutung, wenn

die entsprechenden Polymere nur schwer zugänglich sind oder charakterisiert werden können.[217] Gleichzeitig sind Oligomere für sich genommen bereits

(52)

219] sowie die Literaturangaben in der Einleitung von [220].

Monodisperse konjugierte OPEs wurden aus den Gründen, die in den beiden vorigen Absätzen genannt wurden, mit einer Vielzahl unterschiedlicher Metho-den auf diverse Eigenschaften und Anwendungen hin untersucht (s. Abschnitt 4.8. in [218]). Darunter findet sich ihre Photolumineszenz und Lasingeigenschaften in dünnen Filmen,[221]die Lichtblitzspektroskopie ihrer

Singulett-Triplett-Wech-selwirkungen in Lösung,[220]wie bereits oben gesehen, ihre molekulare Form in

Lösung[10,108] und in Nanopartikeln,[8] ihre elektrooptischen Eigenschaften,[222]

oder ihr lichtinduzierter Ladungstransfer.[223]

Die Delokalisierung des Triplettzustands kann entweder über die Länge (also die Anzahl an Wiederholeinheiten) eines Polymers oder über Verteilung der Spin-dichte entlang der Kette[224]beschrieben werden. Diese Charakterisierung kann

mittels ESR-Spektroskopie über die ZFS, die OSP und die Hyperfeinaufspaltung (englisch Hyperfine Splitting, HFS) erfolgen. In der Arbeitsgruppe von Christiane Timmel in Oxford wurden kürzlich von Tait et al. konjugierte Porphyrinoligo-mere mit zeitaufgelöster Transienten-ESR und Elektron-Kern-Doppelresonanz (englisch Electron-Nuclear Double Resonance, ENDOR) in dieser Hinsicht unter-sucht.[225–227] Mit einem ganz ähnlichen Ansatz wurde in der vorliegenden

Ar-beit die Charakterisierung des Triplettzustands der zuvor besprochenen OPEs verfolgt.

(53)

man als ZFS. Diese wird hauptsächlich durch die dipolare Kopplung der bei-den Triplettspins hervorgerufen und ist damit abhängig vom Abstand der beibei-den Triplettelektronen zueinander. Für die formale Beschreibung sei auf [192] ver-wiesen. Diese Aufspaltung wird durch die ZFS-Parameter D und E beschrieben, die aus dem ESR-Spektrum eines gegebenen Tripletts ausgelesen werden kön-nen. Entsprechend kann über die ESR-Spektren eine Aussage über den mittleren Abstand beider Triplettelektronen zueinander getroffen werden. Dieser wurde in der Vergangenheit häufig in Hinblick auf die Delokalisierung der Triplettelek-tronen interpretiert, wie in [225, 226] zusammengefasst.

Eine genauere Aussage über die Verteilung der Elektronendichte in einem kon-jugierten System erlaubt die Auswertung der HFS.[225,226]Die HFS wird durch die

Hyperfeinkopplungskonstante (englisch Hyperfine Coupling Constant, HFCC) A beschrieben, welche über ENDOR-Spektroskopie zugänglich sind. Im Prinzip verwendet man hierbei sowohl ESR als auch NMR gleichzeitig. Wie in Abbil-dung 12[228] beispielhaft an einem Triplettsystem illustriert, führt die Kopplung

von Kernspins (hier und in den meisten Fällen Protonen im betrachteten Chro-mophor) mit dem Triplettspin zur HFS. Diese wiederum hängt von der Aufent-haltswahrscheinlichkeit des Elektronenspins bei einem entsprechenden Kern-spin ab. Je größer diese ist, desto größer ist die HFS. Über die Zuordnung von HFCC zu bestimmten Kernen im Chromophor wird die Spindichteverteilung zugänglich gemacht.

(54)

Mikrowel-Abbildung 12:(A) Energieniveaus eines Triplettzustands mit positiver und nega-tiver HFS AZeines Kerns mit Spin I = 12für ein externes Magnetfeld parallel zur

Z-Achse des ZFS-Tensors. Dünne Pfeile: ESR-Übergänge; dicke Pfeile: NMR-Übergänge (B) ENDOR-Spektren von3P680 für die Feldpositionen Z

Iund ZII.

Die beiden ENDOR-Spektren sind aufgrund großer Magnetfelddifferenz gegen-einander verschoben (s. Verschiebung der intensiven schmalen Linie bei νH).

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len und manipuliert parallel den Kernspin über die Anregung des entsprechen-den NMR-Übergangs mit Radiowellen (Abbildung 12A). Als Doppelresonanz-technik weist ENDOR daher Ähnlichkeiten zu PELDOR auf.[51,229] Resultat ist das ENDOR-Spektrum, in dem die relativ zur Protonen-Larmorfrequenz νH

verschobenen NMR-Resonanzlinien die Ermittlung der HFCCs erlauben (Ab-bildung 12B). Für die Grundlagen der gepulsten ENDOR-Spektroskopie sei auf Kapitel 12 in [100] und für Methodik und Anwendungen auf Literaturangaben ebenda sowie auf [230] verwiesen. Daneben gibt es ein Buchkapitel über experi-mentelle und instruexperi-mentelle Voraussetzungen für gepulste ENDOR-Spektrosko-pie[231]und weitere, teils speziellere, Monografien zu diesem Thema.[229,232–234]

Ergebnis entsprechender Untersuchungen an den OPEs ist ein Modell von Frenkelexzitonen, bei dem die Triplettelektronen über die gesamte Kette bis hin zu fünf Wiederholeinheiten voll kohärent delokalisiert sind. Die Spindichtever-teilung wird dabei von einer Wellenfunktion beschrieben, die jener vom Grund-zustand des Partikels im Kasten entspricht. Dieses Modell konnte auf die von Tait et al. untersuchten Porphyrinoligomere[225,226] erfolgreich übertragen

wer-den. Die so gewonnene Spindichteverteilung könnte hilfreich sein, um den Ef-fekt der Delokalisierung auf LaserIMD-Messungen und die entsprechende Aus-wertung der Abstandsverteilung, beispielsweise mit Hilfe von Gleichung (3), zu untersuchen.

(56)

1.7 Zusammenfassung

Diese Arbeit zeigt, dass LaserIMD für Abstandsmessungen im Nanometerbereich geeignet ist, illustriert relevante Anwendungen verwandter Abstandsmessungen und charakterisiert lichtangeregte Triplettzustände mittels ESR-Spektroskopie. Die in dieser Arbeit durchgeführten Abstandsmessungen zur Klärung aktuel-ler Fragestellungen aus anderen Disziplinen der Chemie waren weniger reine Fingerübungen zum Erlernen dipolarer, gepulster ESR-Spektroskopie, sondern führen auch die Bedeutung dieser Technik vor Augen. So wurde am Beispiel der Verfolgung enzymatischer Hydrolyse von ATP mittels ESR gezeigt, dass die-se fluoreszenzbasierte Substratanaloga zur Beobachtung von Enzymaktivität er-folgreich ergänzen kann. Im Fall konjugierter Polymere, die üblicherweise als starr betrachtet werden, wurde zum ersten mal die individuelle Konformation einer solchen rigiden konjugierten Polymerkette innerhalb von Nanopartikeln aufgeklärt.

(57)

ENDOR untersucht und mit einem Exzitonenmodell beschrieben. Dies könn-te genutzt werden, um Abstandsmessungen mit LaserIMD zu solchen größeren, delokalisierten System zu erschließen.

(58)
(59)

2.1 Monitoring Enzymatic ATP Hydrolysis by

EPR Spectroscopy

2.1.1 Bibliographische Angaben und Lizenz

[117]: S. M. Hacker, C. Hintze, A. Marx, M. Drescher, »Monitoring Enzymatic ATP Hydrolysis by EPR Spectroscopy«, Chem. Commun. 2014, 50, 7262–7264, DOI 10.1039/C4CC02422B - Published by The Royal Society of Chemistry. (CC BY 3.0)

(60)

2.1.2 Relevante Konferenzbeiträge

• Poster beim 35. FGMR Discussion Meeting, Joint Conference of the Ger-man, Italian and Slovenian Magnetic Resonance Societies, Annual Meeting SPP 1601, Frauenchiemsee, 2013

• Poster beim IX. EF-EPR Groups Meeting, Marseille, 2014

2.1.3 CRediT

[237]

(61)
(62)

Cite this: Chem. Commun., 2014, 50, 7262

Monitoring enzymatic ATP hydrolysis by EPR

spectroscopy†

Stephan M. Hacker,*‡ Christian Hintze,‡ Andreas Marx* and Malte Drescher*

An adenosine triphosphate (ATP) analogue modified with two nitroxide radicals is developed and employed to study its enzymatic hydrolysis by electron paramagnetic resonance spectroscopy. For this application, we demonstrate that EPR holds the potential to complement fluoro-genic substrate analogues in monitoring enzymatic activity.

Probes that allow directly studying the activity of hydrolytic enzymes have wide-spread applications in biochemistry.1–3 In this context, Fo¨rster Resonance Energy Transfer (FRET)-based substrate analogues have been extensively used.1–3 These probes consist of a cleavage motif for the respective enzyme, e.g. a specific peptide sequence for a protease, which is flanked by two dyes suitable to undergo FRET.4

After enzymatic cleavage of the probe, FRET is abolished leading to a large change in the fluorescence characteristics. This concept has been widely applied for studying proteases,1but has also been used for studying various other enzymes.2,3

Determination of the distance-dependent dipole–dipole coupling of two electron spins by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy potentially offers an alternative way to monitor the cleavage of such analogues (Fig. 1a). In this case, two spin labels (SL) flank the cleavage motif and due to their spatial proximity, dipole– dipole coupling occurs in the non-cleaved state. After cleavage, the two spin labels are separated spatially and dipole–dipole coupling vanishes. Depending on the distance distribution of the labels in the intact state, changes in the distance distribution upon cleavage will be detectable by continuous-wave-EPR spectroscopy (cw-EPR, distances o2.5 nm)5 or by double electron–electron resonance spectroscopy (DEER, distances from 1.5 nm to 10 nm) also known as pulsed electron double resonance (PELDOR).6

Nitroxide spin labels, which are commonly used in EPR, are less sterically demanding than fluorophores used for FRET applications.7 They may therefore cause less interference in the enzymatic activity. Furthermore, EPR allows, in contrast to FRET, detecting the distance distributions over a large range of distances between two identical labels.8It therefore results in a deeper understanding of the actual structure of the probes, which may aid optimizing them. EPR is virtually background free owing to the absence of paramagnetic centres in most biological systems, hence also intracellular measure-ments are possible.7It also avoids radiation-induced damaging of biological samples due to the long wavelength of the used radiation. Therefore, it is highly promising to investigate EPR-based probes for their suitability to monitor enzymatic activity. Nevertheless, up to now only the non-enzymatic cleavage of a few very rigid and small molecules has been studied using this approach.9This probe design will not be applicable to typical enzymes. Here, we set out to investigate, whether this approach can also be transferred to large and flexible substrate analogues that could be used to study a larger variety of enzymes. In a benchmark study, we designed and synthesized EPR-based probe 1 (Fig. 1b and Scheme S1, ESI†) to study the activity of nucleotide processing enzymes using an adenosine triphosphate (ATP) core as a cleavage motif and the Phosphodiesterase I extracted from Crotalus adamanteus

Fig. 1 Concept of the detection of enzymatic activity by EPR. (a) For the envisaged EPR-based technology two spin labels (SL) are attached to a cleavage motif for an enzyme of interest and the change in the dipole– dipole coupling after cleavage is monitored. (b) Design of the ATP analogue 1 labelled with two spin labels for studying SVPD activity.

Department of Chemistry and Konstanz Research School Chemical Biology, University of Konstanz, Universita¨tsstraße 10, 78457 Konstanz, Germany. E-mail: malte.drescher@uni-konstanz.de, andreas.marx@uni-konstanz.de, stephan.hacker@uni-konstanz.de

†Electronic supplementary information (ESI) available: Fig. S1–S4, Table S1, synthesis and characterization of all molecules and detailed experimental proce-dures. See DOI: 10.1039/c4cc02422b

‡These authors contributed equally to this work. Received 2nd April 2014,

Accepted 7th May 2014 DOI: 10.1039/c4cc02422b www.rsc.org/chemcomm

COMMUNICATION

Open Access Article. Published on 15 May 2014. Downloaded on 28/07/2014 15:51:04.

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(Snake Venom Phosphodiesterase, SVPD)10as model enzyme. Modification of the d-phosphate of an adenosine tetraphosphate analogue has been chosen as d-modified tetraphosphate analogues have been shown to be superior substrates to g-modified triphos-phates for several enzymes11and as phosphoesters have been shown to be stable.12Modification of the N6-position is also well accepted by certain enzymes13 and has already been used to study ATP cleavage by SVPD.3 Furthermore, we decided to use a nitroxide embedded in a five-membered ring as these labels have been shown to be much more stable than their six-membered counterparts.14

To analyse the conformation of probe 1 we initially performed DEER to determine the distance distribution between the unpaired electrons (Fig. 2 and Fig. S1, ESI†) localized on the N–O-bond (point-dipole approximation). It was observed that the two spin labels in probe 1 have a broad distance distribution as can be expected due to the very flexible linkers used for their attachment. Furthermore, the distance distribution contains contributions featuring distances around 3 nm, but also a high probability below 2 nm. The larger distances correspond to a largely extended conformation of probe 1, whereas the occurrence of short spin–spin distances indicates that probe 1 can also fold in a way that the two labels reside close to each other. In this way, the EPR experiment shows that the flexibility of probes like 1 has to be carefully considered, when optimizing their properties. Furthermore, distances shorter than 1.5 nm, which are not accessible with DEER,6seem to occur in a large fraction of the molecules. Therefore, changes in the cw-EPR spectrum of probe 1 should occur during cleavage.5cw-EPR can, in contrast to DEER, be performed using inexpensive easy-to-use equipment and would therefore largely broaden the applicability of an EPR-based approach.16

To be able to compare the non-cleaved and the cleaved state of probe 1 by cw-EPR, we next tested, whether SVPD is able to cleave probe 1. For this purpose we incubated probe 1 with SVPD in the presence of magnesium chloride. As a negative control the same reaction was set up in the presence of EDTA that inhibits the enzymatic reaction due to complexation of magnesium ions. Analysis by RP-HPLC and HR-MS (Fig. S2, ESI†) revealed that probe 1 was quantitatively cleaved by SVPD between the a- and the b-phosphate, whereas no cleavage could be observed in the

presence of EDTA. This shows that probe 1 is a substrate for SVPD and might therefore be feasible to monitor its activity.

Next, we measured the X-band cw-EPR spectra of probe 1 after incubation with SVPD in the presence or absence of EDTA (Fig. 3). The experiments were set up in the same fashion as described above and after incubation with the enzyme adjusted to a final concentration of 20% glycerol in order to obtain a glassy solid upon freezing at 50 1C as needed for the EPR experiments. In the non-cleaved state a significant broadening of the EPR signal can be detected as compared to the cleaved state. This effect can be attributed to the dipole–dipole coupling of the two labels that are in the range of less than 2 nm apart from each other. As the cw-EPR spectrum of probe 1 changes during cleavage, it can be used for the concentration-independent detection of the enzymatic activity of SVPD.

To further investigate the applicability of the approach, we mixed different ratios of non-cleaved and cleaved probe 1 to yield a constant total probe concentration and recorded the cw-EPR spectra. The spectra were fitted by a linear combination of the spectra of the completely non-cleaved and completely cleaved state of probe 1 (Fig. S3, ESI†). Correlating the ratio used in the experiment with the ratio obtained by fitting (Fig. 3) shows that this method can be applied to monitor the fraction of cleaved probe 1 in a robust fashion.

Next, we investigated whether the EPR-based approach can also be used to monitor the time-course of the enzymatic reaction of SVPD (Fig. 4). For this purpose, we mixed probe 1, SVPD, magnesium chloride and 20% glycerol and immediately froze the solution. The initial cw-EPR spectrum was recorded. Afterwards, the solution was warmed to 20 1C and incubated for the indicated time, before it was frozen again to measure the cw-EPR spectrum of the first time-point. This procedure was repeated for all subsequent time-points. It can be seen that the fraction of non-cleaved probe 1 decreases over time for all enzyme and probe concentrations used and that no cleavage can be detected in the negative control in the absence of SVPD.

Fig. 2 Distance distribution obtained by model free analysis of the DEER form factor of probe 1.15The inset illustrates the flexibility of probe 1.

Fig. 3 cw-EPR spectra recorded at 50 1C in the X-band of probe 1 after incubation with SVPD in the absence (black) or presence (red) of EDTA, normalized to their double integral. Inset: correlation of the known percentage of cleaved probe 1 used in a given cw-EPR experiment (reference) and the percentage of cleaved probe 1 obtained by simulation of the respective EPR spectra. Data points indicate mean standard deviation of triplicates.

Open Access Article. Published on 15 May 2014. Downloaded on 28/07/2014 15:51:04.

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