Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ......................................................................................................... VII

Volltext

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IV

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... VII VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN ... X VERZEICHNIS DER TABELLEN ... XI

1 EINLEITUNG ... 1

1.1 AUFBAU DER HAUT ... 1

1.2 SENSORIK DER HAUT ... 2

1.3 AKTINISCHE KERATOSE ... 3

1.3.1 Pathogenese der Aktinischen Keratose ... 4

1.3.2 Therapie der Aktinischen Keratose ... 6

1.4 PHOTODYNAMISCHE THERAPIE ... 7

1.4.1 Aufnahme von ALA und MAL ... 9

1.4.2 Mechanismus der PDT ... 10

1.5 BESTRAHLUNG UND SCHMERZ ... 12

1.5.1 Interaktion von Keratinozyten und sensorischen Fasern ... 13

1.6 ZIELSETZUNG DER ARBEIT ... 16

2 MATERIAL UND METHODEN ... 18

2.1 MATERIAL ... 18

2.1.1 Tierhaltung... 18

2.1.2 Zelllinien ... 18

2.1.3 Medien und Lösungen für die Zellkultur ... 18

2.1.4 Medien und Puffer für die ALA- und MAL-Aufnahme ... 20

2.1.5 Puffer und Substanzen für calcium imaging-Analysen ... 21

2.1.6 Substanzen für Immunzytochemie ... 22

2.1.7 Molekularbiologische Methoden ... 25

2.2 METHODEN ... 26

2.2.1 Zellkulturen ... 26

2.2.1.1 Kultivierung von Keratinozyten-Zelllinien ... 26

2.2.1.2 Präparation von primären humanen Keratinozyten ... 27

2.2.1.3 Präparation von Hinterwurzelganglien ... 27

2.2.2 Zellzählung mit der Neubauer-Zählkammer ... 28

2.2.3 Immunzytochemie ... 29

2.2.4 ALA- und MAL-Aufnahme ... 30

2.2.4.1 Zelllyse und PpIX-Messung ... 31

2.2.5 MTS-Test ... 32

2.2.6 PDT von kultivierten Keratinozyten ... 32

2.2.7 Erfassung von Zelltod nach der PDT ... 32

2.2.7.1 Caspase-3 Immunzytochemie ... 33

2.2.7.2 PI/FDA-Färbung ... 33

2.2.8 Reverse Transkriptions-PCR ... 34

2.2.9 ATP-Freisetzung aus Keratinozyten ... 35

(2)

V

2.2.10.1 Mediumtransfer ... 36

2.2.11 Calcium imaging-Analysen ... 37

2.3 COMPUTERPROGRAMME UND STATISTISCHE AUSWERTUNG ... 38

3 ERGEBNISSE ... 39

3.1 IMMUNZYTOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ZELLEN ... 39

3.1.1 A431-Zellen ... 39

3.1.2 CCD-Zellen ... 40

3.1.3 Primäre humane Keratinozyten ... 40

3.1.4 Spinalganglien ... 41

3.2 PROTOPHORPYRIN IX-BILDUNG IN KERATINOZYTEN ... 42

3.2.1 Protoporphyrin IX-Bildung nach ALA-Aufnahme ... 42

3.2.2 Protoporphyrin IX-Bildung nach MAL-Aufnahme ... 45

3.3 EINSATZ VON INHIBITORISCHEN SUBSTANZEN ZUR KLÄRUNG DES AUFNAHMEMECHANISMUS... 47

3.3.1 Inhibition der ALA-Aufnahme in A431-Zellen ... 47

3.3.1.1 Beteiligung von Aminosäuren ... 47

3.3.1.2 Beteiligung von GABA-Transportern ... 50

3.3.2 Inhibition der MAL-Aufnahme in A431-Zellen ... 52

3.3.3 Inhibition der ALA-Aufnahme in CCD-Zellen ... 54

3.3.3.1 Beteiligung von Aminosäuren ... 54

3.3.3.2 GABA-Transporter ... 57

3.3.4 Inhibition der MAL-Aufnahme in CCD-Zellen ... 58

3.4 RT-PCR ... 61

3.5 ATP-FREISETZUNG NACH BESTRAHLUNG ... 62

3.6 APOPTOSE UND NEKROSE NACH PDT VON KERATINOZYTEN ... 66

3.6.1 Zelltod in CCD-Zellen ... 67

3.6.2 Zelltod in A431-Zellen ... 71

3.7 KOKULTUREN UND MEDIUMTRANSFER ... 75

3.8 CALCIUM IMAGING-ANALYSEN ... 78

4 DISKUSSION ... 86

4.1 IMMUNZYTOCHEMISCHE ANALYSEN DER VERWENDETEN ZELLKULTUREN ... 86

4.2 PROTOPHORPYRIN IX-BILDUNG IN KERATINOZYTEN ... 88

4.2.1 Zeitabhängige Bildung von PpIX ... 88

4.2.2 Aufnahme über Aminosäuretransporter ... 90

4.2.3 Aufnahme über GABA-Transporter ... 92

4.2.3.1 Expression von GABA-Transportern ... 94

4.3 ATP-FREISETZUNG NACH PDT ... 95

4.4 ZELLTOD NACH PDT ... 97

4.5 MEDIUMTRANSFER UND CALCIUM IMAGING-ANALYSEN ... 101

4.6 AUSBLICK... 105

5 ZUSAMMENFASSUNG ... 107

6 SUMMARY ... 110

(3)

VI

DANKSAGUNG... 128

LEBENSLAUF ... 129

VERÖFFENTLICHUNGEN ... 130

Abbildung

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Referenzen

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