A fehérjekutatás modern módszertana

A fehérjekutatás

modern módszertana

A fehérjekutatás modern módszertana

Szerkesztette: Ludány Andrea

Medicina Könyvkiadó Zrt ● Budapest, 2011

© Dr. Ludány Andrea, 2011

© Szerzők, 2011

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0054

© Prof. Dr. Ludány Andrea, 2011

Szerzők:

Prof. Dr. Berki Tímea

Prof. Dr. Kellermayer Miklós Prof. Dr. Kilár Ferenc

Dr. Kiss István

Prof. Dr. Komoly Sámuel Prof. Dr. Kovács L. Gábor Dr. Kőszegi Tamás Dr. Liszt Ferenc

Prof. Dr. Ludány Andrea Dr. Magyarlaki Tamás † Dr. Márk László Dr. Mezősi Emese Dr. Nagy Tamás

Dr. Tőkés-Füzesi Margit Vassné Lakatos Ágnes Prof. Dr. Wittmann István

Lektorálta:

Dr. Janáky Tamás egyetemi docens Szegedi Egyetem, Orvosi Kémia Intézet

Dr. Szabó Antal egyetemi tanár SE I.sz.Gyermekklinika

Medicina

A kiadásért felel a Medicina Könyvkiadó Zrt. igazgatója

Felelős szerkesztő: Benjámin Katalin Műszaki szerkesztő: Dóczi Imre Az ábrákat rajzolta: Olgyai Géza

Ábrák száma: 221 Azonossági szám: 3591 Terjedelem: 49,5 (A/5) ív

Prof. Dr. Berki Tímea

PhD, Med. Habil.

egyetemi tanár

PTE KK Immunológiai és Biotechnológiai Intézet

Prof. Dr. Kellermayer Miklós

DSc egyetemi tanár

PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet

DSc egyetemi tanár

PTE ÁOK Bioanalitikai Intézet

PhD egyetemi docens

PTE ÁOK Népegészségtani Intézet

DSc egyetemi tanár

PTE KK Neurológiai Klinika

MTA levelező tag egyetemi tanár

PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet

PhD, Med. Habil.

egyetemi docens

PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet

PhD egyetemi docens

PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet

Prof. Dr. Ludány Andrea

PhD, Med. Habil.

egyetemi tanár

PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet

PhD, Med. Habil.

egyetemi docens

PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet

PhD, Dr. Habil.

egyetemi docens

PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet

Dr. Mezősi Emese

PhD, Med. Habil.

egyetemi docens

I. sz. Belgyógyászati Klinika

PhD egyetemi adjunktus

PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet

egyetemi tanársegéd

PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet

PhD egyetemi docens

PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet

PhD Med. Habil.

egyetemi tanár

PTE KK II.sz. Belgyógyászati Klinika és Nephrológiai Centrum

A könyv szerzői

A fehérjekutatás modern módszerei, proteomika a klinikai kutatásban

A többszerzős szerkesztett tankönyvet a Medi- cina Könyvkiadó adja ki elektronikus formában.

2012 első negyedévétől lesz elérhető a www.tan- konyvtar.hu honlapon. A szerzők valamennyien a Pécsi Tudományegyetem ismert és elismert oktatói, akik az adott területeken sikeres klinikai laboratóriumi kutatómunkát végeznek.

A könyv a klinikai laboratóriumi kutatásban központi szerepet játszó fehérjevizsgálatok je- lenleg használatos módszertanát tárja a hallga- tók elé. Anyaga feltételez alapvető és megfelelő biokémiai/biológiai előképzettséget.

A könyv 1–10. fejezete a fehérjevizsgálatok módszertanát elsősorban elméleti megközelítés- ben ismerteti gazdag ábraanyaggal. Fejezetről fejezetre kitér a vizsgálati minták előkészítésére, az alapvető elválasztási eljárásokra, funkcionális aspektusokra, műszeres adaptációkra, a fehérjék

azonosítási lehetőségeire, valamint a mérési ada- tok értékelésére.

Az utolsó, 11. fejezet 19 alfejezetben a koráb- ban bemutatott módszertanok közvetlen klinikai laboratóriumi alkalmazására és diagnosztikus/

terápiás hasznosulására nyújt példákat. Ezzel különböző kutatási irányokra tereli az olvasó figyelmét a klinikai patológia területén. Így pl.

a véralvadástól a tumormarkerekig sor kerülhet különböző fehérje vizsgálatokra a legújabb eljá- rások szerint.

A tankönyv anyaga – a szerzők véleménye szerint – minden bizonnyal nem csak a klinikai laboratóriumi kutatók mesterképzéséhez, hanem a terület iránt érdeklődő szakemberek számára is hasznos lehet.

Pécs, 2011. november

Ludány Andrea szerkesztő

Előszó

Rövidítések . . . 17

1. Bevezetés (Kovács L. Gábor) . . . 27

A fehérje mint az élet princípiuma . . . 27

A fehérjék szerkezete, kémiai tulajdonságai . . . 27

Fehérjék az élő sejtben . . . 28

A fehérjék kölcsönhatásai . . . 32

Fehérjék mint enzimek (katalízis) . . . 33

Fehérjék szerepe a struktúraalkotásban . . . 34

Fehérjék szerepe a transzportfolyamatokban . . . 35

Sejtek és fehérjék . . . 35

A sejtek anabolizmusa és katabolizmusa . . . 35

Az emberi szervezet és a fehérjék . . . 36

A fehérjekutatás forradalma: a proteomika . . . 37

Összefoglalás . . . 37

2. A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei - a minták előkészítése . . . 39

Különféle minták előkészítése (Ludány Andrea) . . . 39

Sejtes minták előkészítése . . . 40

A sejtek feltárása . . . 40

Interferáló anyagok inaktiválása vagy eltávolítása . . . 40

A fehérjék szolubilizálása (oldatba vitele) . . . 41

A minták tárolása . . . 42

A minták előfrakcionálása az analízisekhez . . . 42

Eljárások (protokollok) . . . 45

Sejt- és szöveti minták extrakciója és szolubilizációja . . . 45

Az interferáló vegyületek eltávolítása a mintákból . . . 47

A minták előfrakcionálása . . . 48

Fehérjemeghatározások . . . 48

Irodalom . . . 50

Sejtes minták vizsgálómódszerei (Kőszegi Tamás) . . . 51

Intracelluláris fehérjék kimutatása . . . 51

Módszertani megközelítések . . . 52

Egyedi fehérjék kimutatása morfológiai módszerekkel . . . 52

Egyedi fehérjék kimutatása egyéb módszerekkel . . . 53

Irodalom . . . 54

Tartalom

3. Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei (Kilár Ferenc) . . . 57

Fehérjék extrakciója . . . 57

Fehérjék kromatográfiája . . . 57

Fehérjék frakcionálása ultracentrifugával . . . 58

Fehérjék vizsgálata elektroforézissel . . . 59

Fehérjék kapilláris-elektroforetikus elemzése. Chip-elektroforézis . . . 59

Fehérjék azonosítása és meghatározása a proteomikában . . . 65

Fehérjék bioinformatikája . . . 66

Irodalom . . . 70

4. Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban - Fehérjeelválasztási és fehérjedetektálási technikák . . . 71

(Ludány Andrea, Kőszegi Tamás)

Elektroforézis mint elválasztási technika . . . 71

A klinikai kutatásban használatos módszerek áttekintő ismertetése . . . 71

Gélelektroforetikus technikák - PAGE . . . 71

Preparatív és analitikai PAGE-eljárások . . . 72

Homogén és gradiens gélek . . . 72

Natív és denaturáló PAGE-rendszerek . . . 73

Izoelektromos fokuszálások poliakrilamid- (PAG) és agarózgélben . . . 73

Kétdimenziós elválasztások kombinációi . . . 74

Fehérjedetektálási technikák a klinikai kutatómunkában . . . 74

Izotópos jelölés . . . 75

Festékkötéses jelölés . . . 75

Ezüstözés . . . 75

Fluoreszcens festés . . . 75

Immunreakción alapuló jelölés . . . 75

Protokollok - A klinikai kutatásban általunk adaptált és alkalmazott elválasztási és fehérjejelölési eljárások . . . 76

Elválasztási technikák . . . 76

Nem denaturáló és denaturáló PAGE gélrudakban és lapgéleken . . . 76

Nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis (Ornstein és Davis szerint) . . . 76

Denaturáló SDS-gélelektroforézis (Laemmli szerint) . . . 77

Kétdimenziós PAGE denaturáló rendszerben . . . 79

Izoelektromos fokuszálás gélcsövekben . . . 80

Második dimenzió; SDS-elektroforézis homogén vagy exponenciális gradiens poliakrilamidgélben . . . 81

Izoelektromos fokuszálás lapgélen - denaturáló rendszerben (az O’Farrell-technika első dimenziójának megfelelő rendszer) . . . 84

Detektálási technikák . . . 84

Gélelőkészítés autoradiográfiához . . . 84

Fluorográfiás detektálás (Bonner és Laskey szerint) . . . 84

Ezüstözési eljárások . . . 85

Fehérjék direkt ezüstözése egydimenziós SDS lapgélen (Giulian, G. G.) . . . 85

Kombinált (gyors) ezüstözési eljárás leszárított festetlen, ill. festett „nedves”

géllemezeken (Willoughby és Lambert) . . . 85

Ezüstözéses fehérjedetektálás ultravékony PAGE-lemezeken (Sammons) . . . 86

A minták fehérjedúsítása és ezüstdetektálása (Marshall szerint) . . . 87

Fehérjék detektálása Marshall szerint, módosított ultraszenzitív ezüstözési eljárással . . . 87

MS-kompatibilis fehérjedetektálások poliakrilamidgélen . . . 89

MS-analízishez ajánlott CBB-festés (Wang) . . . 89

MS-kompatibilis ezüstfestés gélben (Gromova) . . . 89

Immunoblotting technikák fehérjék azonosítására . . . 90

Mini-Trans-Blot készülék használata („nedves” eljárás) . . . 90

Immunoblotting technika a fehérjék azonosítására (semi-dry blotting) . . . 93

Az immunreakció „előhívása” . . . 94

Poliakrilamidgél-lemez szárítása zselatinnal (Popescu szerint) . . . 98

Irodalom . . . 98

5. Fehérjék vizsgálata biológiai funkcióik alapján (Kellermayer Miklós) . . . 101

Immunglobulinok, antitestek és a komplementrendszer . . . 104

Történeti áttekintés . . . 104

Az immunglobulonok, az antitestek és a komplementek szerkezete, molekuláris sajátosságai . . . 105

Az immunglobulinok, az antitestek és a komplementrendszer funkciói . . . 106

Az immunglobulinok és az antitestek vizsgálata . . . 107

Motorfehérjék, kontraktilis fehérjék, intracelluláris vázfehérjék (citoszkeleton) . . . 109

Történeti áttekintés . . . 109

A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék szerkezete, molekuláris sajátosságai . . . 110

A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék funkciói . . . 112

A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék funkcióira irányuló vizsgálatok . . . 112

Enzimek, biokatalizátorok . . . 112

Történeti áttekintés . . . 113

Az enzimek, biokatalizátorok molekuláris sajátosságai . . . 113

Az enzimek funkciói . . . 114

Az enzimek, biokatalizátorok funcióira irányuló vizsgálatok . . . 114

Hormonok . . . 115

Történeti áttekintés . . . 115

A hormonok molekuláris sajátosságai . . . 115

A hormonok funkciói . . . 116

A hormonok vizsgálata funkcióik alapján . . . 116

A sejtnövekedést befolyásoló fehérjék, peptidek, a sejtnövekedési faktorok, a biológiai válaszmódosítók („biological response modifiers”) . . . 116

Történeti áttekintés . . . 116

A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai válaszmódosítók” molekuláris sajátosságai . . . 116

A sejtnövekedési faktorok, a “biológiai válaszmódosítók” funkciói . . . 117

A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai válaszmódosítók” vizsgálata funkcióik

alapján . . . 117

Extracelluláris szerkezeti elemek . . . 117

Történeti áttekintés . . . 118

Az extracelluláris, főként szerkezeti elemként funkcionáló fehérjék molekuláris

sajátosságai . . . 118

Az extracelluláris szerkezeti fehérjék funkciói . . . 119

Az extracelluláris szerkezeti fehérjék vizsgálata . . . 119

Raktárak . . . 120

Történeti áttekintés . . . 120

A raktárfehérjék molekuláris sajátosságai . . . 120

A raktárfehérjék funkciói . . . 120

A fehérjeraktárak funkcióira irányuló vizsgálatok . . . 121

Transzportőrök (szállítófehérjék) . . . 121

Történeti áttekintés . . . 122

A transzportőrök, a szállítófehérjék molekuláris sajátosságai . . . 122

A transzporterek, a szállítófehérjék funkciói . . . 122

A transzportfehérjék azonosítása funkcióik alapján . . . 122

Ligandumok . . . 122

Esszenciális táplálékok . . . 123

Irodalom . . . 123

6. Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában - Specifikus fehérjekimutatások oldatban és szilárd fázisú rendszerekben (Berki Tímea) . . . 125

Immunológiai alapok . . . 126

Immunológiai fogalmak . . . 126

Antitest-előállítási módszerek . . . 132

Ellenanyagok, antigének jelölése . . . 136

Konjugálási módszerek . . . 139

Immunológiai alapú laboratóriumi módszerek csoportosítása . . . 139

Antigén-antitest reakciókon alapuló módszerek . . . 139

Precipitáción alapuló eljárások . . . 140

Agglutináción alapuló módszerek . . . 141

Immunoassay . . . 142

Immunoassay-típusok csoportosítása . . . 142

Módszerek . . . 145

Az immunoassay-t befolyásoló faktorok . . . 156

Az immunoassay-k fejlesztési irányai . . . 158

Irodalom . . . 159

7. Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban . . . 161

Automatizáció a fehérjeanalitikában (Kőszegi Tamás) . . . 161

Általános szempontok . . . 161

Immunprecipitáción alapuló módszerek . . . 161

Immunturbidimetriás módszerek . . . 162

A turbidimetriás jel mérése . . . 163

Egyéb megfontolások . . . 163

Nefelometria . . . 164

Immunkémiai analitikai technikák (immunoassay-k) . . . 164

Történeti áttekintés . . . 164

Az immunoassay-kben leggyakrabban alkalmazott jelölések . . . 165

A mért jel detektálásának módjai . . . 167

Immunoassay-k típusai a közeg kialakítása szerint . . . 168

Immunoassay-k típusai a reakcióelv szerint . . . 169

Néhány példa a heterogén eljárások technikai megoldásaira . . . 169

Példa homogén eljárás technikai megoldására . . . 170

Az immunoassay-k kalibrációjának módjai . . . 171

Analitikai interferenciák . . . 172

Interferenciák kiküszöbölésének lehetőségei . . . 173

Különböző immunkémiai módszerek érzékenységének összehasonlítása . . . 174

Irodalom . . . 174

Műszeres analitikai lehetőségek - Tömegspektrometria (Márk László) . . . 175

A tömegspektrométer elvi felépítése . . . 175

A vákuumrendszer . . . 175

Mintabevitel . . . 176

Ionforrások . . . 176

Analizátor . . . 179

Detektor . . . 181

Fragmentálás és tandem tömegspektrometria . . . 182

A tömegspektrum . . . 183

A tömegspektrometria főbb alkalmazási területei . . . 184

Irodalom . . . 185

8. A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások (Liszt Ferenc) . . . 187

Mértékegységrendszerek . . . 187

Az analitikai referenciarendszer és elemei . . . 188

A fehérjemeghatározások standardizálása . . . 190

Normálérték és referenciaérték . . . 193

Irodalom . . . 194

9. A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége (Lakatos Ágnes) . . . 197

Irodalom . . . 201

10. Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban (Nagy Tamás) . . . 203

Előzmények . . . 203

Sejttenyésztés . . . 203

Sejttípusok . . . 203

Tenyésztőedények, flaskák . . . 206

Inkubátor . . . 206

Médiumok . . . 207

A tenyészetek kezelése . . . 209

A tenyészet kontaminációja . . . 211

Fagyasztás, fagyasztásból való felolvasztás . . . 212

A tenyészet sejtjeinek osztódása, sejtszámváltozások . . . 213

Detektálás - A sejtkultúra állapotának ellenőrzése, az állapot változtatása . . . 215

Állatkísérleti modellek . . . 216

Irodalom . . . 219

11. A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában - Az új módszertanok klinikai hasznosulása az orvosi kutatólaboratóriumban . . . 221

A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai (Tőkés-Füzesi Margit) . . . 221

A plazmafehérjék általános áttekintése . . . 221

Plazmafehérje-csoportok és vizsgálatuk . . . 222

Összfehérje . . . 222

Albumin . . . 222

A plazmafehérjék elektroforézise . . . 222

A különböző frakciókban vándorló jelentősebb fehérjék rendellenességei betegségekben . . . 224

Az albuminfrakcióban található fehérje . . . 224

Az α

-frakcióban található fehérjék . . . 224

Az α

-frakcióban található fehérjék . . . 225

A β-frakcióban található fehérjék . . . 225

A γ-frakcióban található fehérjék - Az immunglobulinok . . . 226

Irodalom . . . 233

Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása . . . 234

(Kőszegi Tamás)

A kis molekulatömegű fehérjék jellemzői . . . 234

A kis molekulatömegű fehérjék kimutatási lehetőségei . . . 235

Módszertani megközelítés . . . 235

Előzetes frakcionálást, dúsítást alkalmazó módszerek . . . 236

Ultraszűrés . . . 236

Méretkizárásos kromatográfia (gélszűrés) . . . 236

Acetonitriles (ACN) kicsapás . . . 236

Perklórsavas (PCA) módszer . . . 236

Perklórsavas (PCA) kicsapás . . . 236

Mennyiségi mérések . . . 237

Perklórsavas (PCA) kicsapás kombinálása Western blot módszerrel . . . 237

Egyedi fehérjék kimutatása immunanalitikai módszerrel (immunoassay) . . . 238

Intracelluláris polipeptid kimutatása szövettenyészeti sejtekből . . . 239

Irodalom . . . 239

Sejtes elemek differenciálása: flow citometria - Bevezetés a flow citometriába . . . 240

(Magyarlaki Tamás)

Definíciók és célkitűzések . . . 240

Műszeres áttekintés . . . 240

Az egyes sejtek lézeres vizsgálata . . . 241

Multiparaméteres (többparaméteres) analízis perifériás vérsejteken (PBC) . . . 242

Fluoreszcencia . . . 243

Irodalom . . . 250

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei (Berki Tímea) . . . 251

Az autoimmun betegségek jellemzői . . . 251

Az autoimmun betegségek típusai . . . 252

Az autoimmun betegségek diagnózisának kérdései . . . 253

Az autoantitest-meghatározás módszertana . . . 254

Antinukleáris autoantitestek a szisztémás kötőszöveti betegségek elkülönítésében . . . 254

Indirekt immunfluoreszcencia . . . 254

ANA ELISA-szűrőteszt (screen) . . . 255

ANA-immunoblot . . . 256

Multiplex autoantitest-meghatározási módszerek . . . 257

A laboratóriumi gyakorlatban mért autoantitestek . . . 259

Az autoimmun betegségekben elsősorban meghatározott autoantitestek . . . 259

A gyakorlatban vizsgált egyéb autoantitestek . . . 260

Szervspecifikus autoantitestek . . . 262

Irodalom . . . 265

A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata (Berki Tímea) . . . 266

Morfológiai módszerek . . . 266

Áramlási citometria . . . 266

Mikroszkópos módszerek . . . 270

Citokinek kimutatása . . . 273

Az ELISPOT-módszer . . . 277

Irodalom . . . 278

A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana (Tőkés-Füzesi Margit) . . . 279

A véralvadás folyamata . . . 279

Véralvadási tesztek . . . 282

Irodalom . . . 286

A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája (Tőkés-Füzesi Margit) . . . 287

D-dimer-meghatározás . . . 287

Thrombophiliák laboratóriumi diagnosztikája . . . 288

Antitrombin- (AT-) defektusok . . . 290

Protein C (PC-) defektusok . . . 290

Protein S (PS-) defektusok . . . 291

Aktivált Protein C (APC-) rezisztencia . . . 291

Protrombin 20210A polimorfizmus . . . 292

Antifoszfolipid-antitestek, lupus-antikoaguláns kimutatása . . . 292

Irodalom . . . 293

A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése . . . 294

A könny vizsgálata (Ludány Andrea) . . . 294

A könny fiziológiai szerepe és összetétele . . . 294

A könny fehérjéi . . . 294

A könnyfehérjék vizsgálata – klinikai diagnosztikai lehetőségek . . . 296

Szemészeti vonatkozások – a száraz szem szindróma . . . 296

A könnyfehérjék vizsgálata szisztémás betegségekben . . . 297

Ajánlott módszertani megközelítések a könny vizsgálatakor . . . 298

Irodalom . . . 300

A nyál fehérjéinek vizsgálata (Kőszegi Tamás) . . . 301

A nyál biológiai funkciói . . . 301

A nyál fehérje-összetétele . . . 301

A nyálfehérjék vizsgálati módszerei . . . 302

Funkcionális vizsgálatok . . . 303

Irodalom . . . 304

Vizeletvizsgálatok . . . 305

Vizeletvizsgálatok a proteinürítés tükrében (Ludány Andrea) . . . 305

Klinikai laboratóriumi analitikai módszerek . . . 305

Az emberi vizelet fehérjéi . . . 305

A fehérjék mennyiségi mérése . . . 305

A vizeletfehérjék megoszlási képének vizsgálata . . . 306

Vizeletfehérjék klinikai biokémiája és információs értékei . . . 308

Irodalom . . . 310

A proteinuria klinikai szempontjai (Wittmann István) . . . 311

Fogalmak, definíciók . . . 311

A proteinuria, microalbuminuria kialakulása . . . 311

A proteinuria, microalbuminuria előfordulása és jelentősége . . . 312

Az albuminuria meghatározása . . . 312

Meghatározás méretkizárásos kromatográfiával . . . 312

A proteinuria, microalbuminuria meghatározását befolyásoló tényezők . . . 312

Irodalom . . . 313

Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) - A POCT diagnosztikus értékei, a vizsgálatok hitelességének ellenőrzése (Liszt Ferenc) . . . 314

A betegellátás klinikai eredményességét javító POCT-gyakorlat lehetőségei a sürgősségi és intenzív terápiás ellátásban . . . 314

A POCT-gyakorlat kialakításának szakmai kérdései . . . 316

A POCT-gyakorlat minőségbiztosítása . . . 318

A POCT-diagnosztika hibaforrásai . . . 318

Rizikó-management a POCT területén . . . 318

A POCT-gyakorlat minőségirányítási rendszere . . . 318

Irodalom . . . 319

Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban (Kőszegi Tamás) . . . 321

A tumormarkerek jellemzői . . . 321

A tumormarker definíciója . . . 321

Általános szempontok . . . 321

Peptid-fehérje tumormarkerek . . . 322

A fehérje természetű tumormarkerek extracelluláris térbe kerülésének mechanizmusa . . . 322

Tumormarkerek használata az orvosi gyakorlatban . . . 325

Irodalom . . . 327

Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban (Ludány Andrea, Kőszegi Tamás) . . . 328

Az akut myocardialis infarctus diagnózisa . . . 328

Az akut coronaria-szindróma jelenlegi cardialis markerei . . . 328

A cardialis markerek szerepe az akut coronaria-szindróma terápiás döntéseiben . . . 332

Laboratóriumi medicina és a troponinok . . . 332

Cardialis markerek krónikus vesebetegségben és nem ischaemiás szívbetegségben . . . 333

Sürgősségi cardialis markerek . . . 334

Irodalom . . . 336

A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai (Komoly Sámuel) . . . 337

Irodalom . . . 340

A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban . . . 341

(Mezősi Emese, Kőszegi Tamás)

A neuroendokrin rendszer és hormonjai . . . 341

A neuroendokrin rendszer betegségei, a hormontermelés változásai . . . 342

A fehérje- és peptidhormonok meghatározásának klinikai jelentősége és nehézségei . . . 344

A peptidhormonok kutatásának eredményei . . . 345

Irodalom . . . 346

A csontanyagcsere fehérjemarkerei (Kőszegi Tamás) . . . 347

A csontrendszer . . . 347

A csontanyagcsere . . . 348

Osteoblastok által termelt faktorok . . . 348

Osteoclastok által termelt faktorok . . . 349

A csontanyagcsere endokrin szabályozása . . . 349

A leggyakoribb csontanyagcsere-betegségek . . . 350

Irodalom . . . 351

A metabolikus szindróma és a fehérjék (Wittmann István) . . . 353

A metabolikus szindróma definíciói . . . 353

A metabolikus szindróma előfordulása . . . 354

A metabolikus szindróma patogenezise . . . 354

Az inzulin szerepe . . . 354

Fehérjék az inzulin kivételével . . . 355

Obesitasban a zsírsejtek által termelt proteinek . . . 355

Egyéb hormonok . . . 357

Az inzulin intracelluláris jelátvitelében szerepet játszó proteinek és működésük

károsodása metabolikus szindrómában . . . 357

Irodalom . . . 359

A proteomika kutatási eredményei a jelen és a jövő klinikai laboratóriumában . . . 361

(Márk László)

Irodalom . . . 363

A daganatok epidemiológiai biomarkerei (Kiss István) . . . 364

Irodalom . . . 368

Tárgymutató . . . 369

A

A2M α

-makroglobulin

AAT α

-antitripszin

ABC avidin-biotin-peroxidáz komplex

ACC Amerikai Kardiológiai Kollégium

ACN acetonitril

ACR albumin-kreatinin hányados;

albumin-creatinin ratio

ACS akut coronaria szindróma

ACT α

-antikimotripszin

ACTH adrenokortikotrop hormon;

corticotropin; adrenocorticotropic hormone

ADH antidiuretikus hormon

ADP adenozin-difoszfát

AF antinukleáris faktor

AFP α-fötoprotein

AGP savanyú glikoprotein

AIDS szerzett immunhiányos szindróma;

acquired immunodeficiency syndrome

AIH autoimmun hepatitis

α

-AT α

-antitripszin

AMI akut myocardialis infarctus

AMPK adenozin-monofoszfát-kináz

AMPPD dinátrium 3-(4-metilspiro-[1,2-dioxetán-3,2′-triciklo-[3.3.1.1]dekán]-4-il) fenilfoszfát

ANA antinukleáris antitest

ANCA antineutrofil citoplazma elleni antitest ANNA-1 antineuronalis nukleáris antigén 1

ANP A típusú natriuretikus peptid; atrialis natriuretikus peptid

AP alkalikus foszfatáz

APC antigénprezentáló sejt

APCI légköri nyomású kémiai ionizáció; atmospheric pressure chemical ionization APCI, APPI fotoionizáció

APS antifoszfolipid-szindróma

APTI aktivált parciális tromboplasztin idő

ARF ADP-ribozilációs faktor

ARIS Apoenzim Reaktivációs Immunoassay

ATCC American Type Culture Collection

ATP adenozin-trifoszfát; adenosine triphosphate

Rövidítések

B

BAP csontspecifikus alkalikus foszfatáz

BDGF csont eredetű növekedési faktor

BIPM Bureau International des Poids et Mesures

B

M β

-mikroglobulin

BMI testtömeg-index; body mass index

BMP bone morphogenetic protein

BNP B típusú natriuretikus peptid; brain natriuretic peptide; agyi natriuretikus peptid BPI bactericidal/permeability increasing protein

BSA marha-szérumalbumin; bovin serum albumin

C

CAH krónikus aktív hepatitis

CBB Coomassie Brilliant Blue

CCD charge-coupled device

CCP ciklikus citrullinált peptid, filaggrin

CD cluster of differentiation

CDR komplementaritást detektáló régió

CE kapilláris-elektroforézis; capillary electrophoresis

CEA carcinoembryonalis antigén

CEDIA Cloned Enzyme Donor Immunoassay

CER cöruloplazmin

CHCA, HCCA α-ciano-4-hidroxifahéjsav; α-cyano-4-hydroxycinnamic acid

CI kémiai ionizáció; chemical ionization

CID collision induced dissociation

CIDP krónikus inflammatiós demyelinisatiós neuropathia CIEEL kémiailag indukált elektroncserélő lumineszcencia

CK kreatin-kináz

CK-BB kreatin-kináz BB izoenzim (agy; brain)

CK-MB kreatin-kináz MB izoenzim (szív)

CK-MM kreatin-kináz MM izoenzim (izom; muscle)

CLIA Chemiluminescent Immunoassay

CMC kritikus micelláris koncentráció

CMIA kemilumineszcens mágneses immunoassay

CMV citomegalovírus

CNP C típusú natriuretikus peptid

CP cöruloplazmin

CRAB calcium, renal, anaemia, bone

CREST calcinosis, Raynaud-jelenség, oesophagusmotilitás zavara, sclerodactylia, teleangiectasia

CRMP5 Collapsin Response Mediator Protein

CRP C-reaktív protein

CT számítógépes rétegvizsgálat; komputer-tomográfia; computer tomography

CV variációs koefficiens

D

DAB diaminobenzidin

DCCT Diabetes Control and Complications Trial DELFIA késleltetett fluoreszcenciájú immunoassay

DHB 2,5-dihidroxi-benzoesav; 2,5-dihydroxybenzoic acid

DM diabetes mellitus

DMSO dimetil-szulfoxid

DNS dezoxiribonukleinsav; deoxyribonucleotic acid; DNA

DPD dezoxi-piridinolin

DPP-4 dipeptidil-peptidáz-4

dsDNS kétszálas DNS; double stranded DNA DTE ditioeritritrol

DTT ditiotreitol

E

EBV Epstein-Barr-vírus

ECL enhanced chemiluminescence

ECLIA elektrokemilumineszcenciás immunoassay

EDE párolgáson alapuló száraz szem; evaporative dry eye EDTA etilén-diamin-tetraecetsav; ethilenediaminetetraacetic acid EGF epidermalis növekedési faktor; epidermal growth factor EGTA etilénglikol-tetraacetát

EIA enzimimmunoassay

EIHIA Enzyme Inhibitory Homogeneous Immunoassay

EKG elektrokardiográfia

ELISA enzyme-linked-immuno-sorbent-assay ELISPOT enzyme-linked immunosorbent spot

EMIT enzyme-multiplied immunoassay technique

ENA extrahálható nukleáris antigének elleni autoantitestek eNOS endothelialis nitrogén-monoxid-szintáz

EPCA early prostate cancer antigen EPO erythropoietin

EQA external quality assessment; külső minőségellenőrzési rendszer ER endoplazmatikus retikulum; endoplasmic reticulum

ERK extracelluláris receptor-kináz

ESI elektroporlasztásos ionizáció; ElectroSpray Ionization ESI-MS elektrospray ionizációs mass spectrometry

ETD electron transfer dissociation

F

F

fragment antigen binding

FAB gyors atombombázás; fast atom bombardment

FACS fluorescence activated cell electron transfer dissociation, ETD sorting

FAD flavin-adenin-dinukleotid; flavin adenine dinucleotide FBS foetal Bovine Somatotrophin)

F

fragment crystallizable

FCM flow cytometry; áramlási citometria FD térdeszorpció

FGF fibroblast növekedési faktor; fibroblast growth factor FI térionizáció

FIA fluoreszcens immunoassay

FIB gyors ionbombázás; fast ion bombardment FITC fluoreszcein-izotiocianát

FL fluorescent scatter

FLC szabad könnyűlánc; free light chain FPIA fluoreszcenciapolarizációs immunoassay fPSA szabad (free) PSA

FRET fluoreszcenciarezonancia-energiatranszfer FSC forward scattered

FSH folliculusstimuláló hormon

G

GAPDH glicerinaldehid-foszfát-dehidrogenáz

GC-MS gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria; Gas Chromatography-Mass Spectrometry

G-CSF granulocyte-colony stimulating factor GDF9 growth differentiation factor-9

GFP green fluorescent protein

GIP glukózdependens inzulinotrop peptid GLP-1 glukagonszerű peptid-1

GLUT glukóztranszporter

GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor

GOT glutamin-oxálecetsav-transzamináz; aszpartát-aminotranszferáz (AAT) GPC gyomor parietalis sejt

GPT glutamin-piroszőlősav-transzamináz

H

HAMA heterogén anti-mouse (antiegér) antitest

Hb hemoglobin

HbCO karboxihemoglobin

HBV hepatitis B vírus

HCCA, CHCA α-ciano-4-hidroxi-fahéjsav

HCDM Human Cell Differentiation Molecules

HCG, hCG humán koriogonadotropin

HCV hepatitis C vírus

HDGF hepatoma-derived growth factor

HDL high density lipoprotein

HE humán epididymisprotein

HEp-2 sejt Human Epithelioma Type 2 Cells HGF hepatocyte growth factor

hGH humán növekedési hormon; human growth hormone HIS kórházi számítógépes rendszer

HIV humán immundeficiencia-vírus HLB hidrofil/lipofil egyensúly (balansz)

HLDA Humán Leukocyta Differenciálódási Antigén Hp haptoglobin

HPLC nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia; High Performance Liquid Chromatography HPT haptoglobin

HRP torma- (horseradish) peroxidáz HS CRP High-Sensitive CRP

HUVS hypocomplementaemiás-urticariás vasculitis szindróma HYDRAGEL agarózgél-elektroforézis

I

IA immunoassay

IDDM idiopathiás diabetes mellitus IDF Nemzetközi Diabetes Szövetség

ID-GCMS izotóphígításos gázkromatográfia/tömegspektrometria IE immunelektroforézis

IFCC International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine IFE immunfixáció

IFG emelkedett éhgyomri vércukorszint; impaired fasting glucose IFN interferon

Ig immunglobulin

IGF inzulinszerű növekedési faktor; insulin-like growth factor IGT csökkent glukóztolerancia; impaired glucose tolerance IIF indirekt immunfluoreszcencia

IL-6 interleukin 6

ILAC International Laboratory Accreditation Cooperation IMA ischaemia okozta módosult albumin

IRS inzulinreceptor-szubsztrát ISD in source decay

IUIS International Union of Immunological Societies IVD in vitro diagnosztikum

IVDD In Vitro Diagnostical Directive; in vitro diagnosztikai irányelv IVF in vitro fertilizáció

J

JCA juvenilis krónikus arthritis

JCTLM Joint Committee on Traceability in Laboratory Medicine

K

KIR központi idegrendszer

KLH Keyhole Limpet Hemocyanin (limpet: kürtcsiga)

L

LC folyadékkromatográfia; fluid chromatography

LC-ESI folyadékkromatográfiás elektroporlasztásos ionizáció;

Liquid Chromatography Electron Spray Ionization

LC-ESI-MS folyadékkromatográfiás elektroporlasztásos tömegspektrométer;

Liquid Chromatography Electron Spray Ionization Mass Spectrometry LCM lézer-disszekció; laser capture microdissection

LC-MS/MS folyadékkromatográfiával kapcsolt tandem tömegspektrometria (Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LDI lézerdeszorpciós ionizáció LDL low density lipoprotein LGL large granular lymphocyte

LH luteinizáló hormon

1

LIF lézerindukált fluoreszcencia

2

LIF leukaemiainhibitor faktor

LIR laboratóriumi informatikai rendszer

LIS laboratóriumi számítógépes rendszer

LKM máj-vese mikroszóma; liver-kidney microsomal LSIMS folyadék szekunderion tömegspektrometria

M

MALDI mátrix segített lézerdeszorpciós ionizáció; Matrix-Assisted Laser Desorption/

Ionization

MALDI-MS mátrixszal segített lézer-deszorpciós-ionizációs mass spectrometry

MALDI-TOF mátrixszal segített lézer-deszorpciós-ionizációs repülési idő tömegspektrometria MALDI-TOF MS mátrix segítette lézerdeszorpciós ionizációt alkalmazó repülési idő

tömegspektrometria; Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry

MAPK mitogén aktiválta protein-kináz MB microbead; mikrogyöngy

MBS m-maleimidobenzil-N-hidroxiszukcinimid-észter MCP monocyta kemoattraktáns protein

MCTD kevert kötőszöveti betegség; mixed connective tissue disease

MEIA Microparticle Enzyme Immunoassay

MetHb methemoglobin

MFI mean fluorescent intensity; átlag fluoreszcencia

MGUS monoklonális gammopathia nem meghatározott jelentőséggel;

monoclonal gammopathies with undetermined significance

MHC major histocompatibility complex

MIF migrációt gátló faktor miRNS mikro-RNS

MPGN membranoproliferativ glomerulonephritis MPO mieloperoxidáz

MR mágneses rezonancia képalkotás

mRNS hírnök RNS; messenger RNS

MS tömegspektrometria; mass spectrometry MSH melanocytastimuláló hormon

mTOR mammalian target of rapamycin

MUP 4-metil-umbelliferon-foszfát

N

NACB National Academy of Clinical Biochemistry NAD

oxidált nikotinamid-adenin-dinukleotid NADH redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid

NADP nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NDAS nem differenciált autoimmun betegség

NDC nem differenciált collagenosis NGF nerve growth factor

NGSP National Glycohemoglobin Standardization Program

NHS N-hidroxiszukcinimid

NO nitrogén-monoxid

NSE neuronspecifikus enoláz

NSTD Non-Sjögren Tear Deficient Dry Eye

NSTEMI non-ST-szegment emelkedés myocardialis infarctus NT-pro BNP N-terminális pro-B típusú natriuretikus peptid

O

OGP oligoklonális gammopathia

P

PACAP adenilát-cikláz-aktiváló polipeptid PAG poliakrilamidgél

PAGE poliakrilamid-gélelektroforézis

1

PAP peroxidáz-antiperoxidáz

2

PAP prostata savi foszfatáz

1

PBC primer biliaris cirrhosis

2

PBC vérsejtek

PBS pufferolt sóoldat PCA perklórsav

PCR polimeráz-láncreakció; Polymerase Chain Reaction

PD plazmadeszorpció

PDGF thrombocyta eredetű növekedési faktor; platelet-derived growth factor PDK foszfoinozitiddependens protein-kináz

PE fikoeritrin

PerCP peridinin-klorofill-protein

PHA fitohemagglutinin

PI protrombinidő

PIGF placental growth factor PKC protein-kináz C

PMA forbol-12-mirisztát-13-acetát PMF Peptide Mass Fingerprinting PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid POC point-of-care

POCT point of care testing; point-of-care test PPO difeniloxazol

PSA prostataspecifikus antigén PSC primer sclerotizáló cholangitis PSS progresszív szisztémás sclerosis PSD post source decay

PTC procalcitonin

PTH parathormon

PYD piridinolin

Q

QC quality control

R

RA rheumatoid arthritis

RAAS renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer RANKL receptor aktivált nukleáris faktor k-B ligand

RES reticuloendothelialis systema; reticuloendothelialis rendszer; monocyta-macrophag rendszer

RF rheumatoid faktor RIA radioimmunoassay

RNP ribonucleoprotein (particle)

RNS ribonukleinsav; ribonucleotic acid; RNA rRNS riboszóma RNS

S

SA mustársav

SDS nátrium-dodecil-szulfát; Sodium Dodecyl Sulphate

SELDI-MS felület segítette lézerdeszorpciós/ionizációs tömegspektrometria; Laser Desorption

Ionization Mass Spectrometry

SI Système International d’Unités; Mértékegységek Nemzetközi Rendszere SIMS szekunder ion tömegspektrometria

siRNS short interfering RNA

SLE szisztémás lupus erythematosus

SLFIA Substrat-Labeled Fluorescent Immunoassay

SMA simaizom elleni antitestek; smooth muscle antibodies snuRNS mag-RNS

SOD szuperoxid-dizmutáz

SPDE szilárd fázisú dinamikus extrakció; Solid Phase Dynamic Extraction SPE szérumfehérje elektroforézis

srpRNS mag-RNS

SS Sjögren-szindróma SSC side scatter

STEMI ST szegment emelkedéssel járó akut myocardialis infarctus

T

TAG tumorasszociált glikoprotein

TAT turn around time; leletátfordulási idő TBP tributilfoszfin

TBS TRIS pufferolt sóoldat TCA triklórecetsav

TDDE kis könnytartalmon alapuló száraz szem; tear-deficient dry eye TEMED N,N,N,N-tetra-metilén-diamin

Tg tireoglobulin

TGF-

transforming growth factor alpha

TGF-b transzformáló növekedési faktor-β; transforming growth factor beta TK timidin-kináz

TNF-a tumour necrosis factor alpha TnC troponin C

TnI troponin I TnT troponin T

TOF repülési idő (analizátor); time-of-flight TPA tripropilamin

TPA szöveti (tissue) polipeptid-antigén

1

TPO thrombopoietin

2

TPO pajzsmirigy-peroxidáz tPSA total PSA

TRAP tartarátrezisztens savanyú foszfatáz TRF transzferrin

TRH tireotrop releasing hormon TRITC tetrametil-rodamin-izotiocianát tRNS szállító RNS; transzfer RNS TSH thyroideastimuláló hormon

TSPA könnyspecifikus prealbumin; tearspecific prealbumin

tTG szöveti transzglutamináz

U

UAER vizelet-albuminürítés

UCTD nem differenciált kötőszöveti betegség

UPE vizeletfehérje elektroforézis; urine protein electrophoresis UPI vizeletfehérje immunfixáció; urine protein immunofixation

UPLC igen nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia; Ultra Performance Liquid Chromatography

UPLC-MS/MS ultrahatékonyságú folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometria;

Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry UPR unfolded protein response

UV ultraibolya; ultraviolet

V

VEGF vascular endothelial growth factor VLDL very high density lipoprotein

W

WHO World Health Organization, Nemzetközi Egészségügyi Világszervezet

A fehérje mint az élet princípiuma

Az élő rendszernek inherens módon egységnek kell lennie, és biológiai anyagcserét kell folytatnia. Ez nem pusztán anyagok felvételét és leadását, valamint átala- kítását jelenti, hanem azt is, hogy eközben a szerve- zet saját anyagait a rá jellemző arányokban, időben és térben előállítja, sőt akár gyarapíthatja is, miközben az anyagátalakítások kémiai energiával is ellátják. Az anyagátalakítások során a rendszer azokat az infor- mációkat is forgalmazza, amelyek a szabályozásához és önszerveződéséhez szükségesek. A sajátos módon szervezett biokémiai reakcióhálózatok egyes vagy so- rozatos reakciói katalizáltak és szabályozottak. Az élő rendszernek stabilisnak kell lennie; vagyis reagálni kell tudnia környezetének ingereire, de ezenközben nem vesztheti el önazonosságát (a homeosztázis fo- lyamata). Az élő rendszernek rendelkeznie kell olyan alrendszerekkel, amelyek a teljes rendszer keletkezé- se, létezése és működései számára hordoznak infor- mációkat. Ilyen az örökletes információt hordozó genetikai állomány, a sejtek közötti kommunikáció rendszere (főleg a hormonális és az idegrendszer), to- vábbá a sajátot az idegentől megkülönböztető önvédő rendszer (immunrendszer). Ez összetett feladatrend- szer ellátásának egyik titka a fehérjékben rejlik.

A fehérje (protein) kifejezés a görög „protosz”

szóból ered, jelentése az „első” az elemek közt. A fe- hérjék az élő szervezetet felépítő biomolekulák egyik meghatározó csoportját alkotják. Szerkezetükben az unikális és az univerzális elemek sajátos egyensúlya valósul meg. Így amellett, hogy pl. egyedi enzim- funkciókat látnak el, számos közös tulajdonsággal is rendelkeznek. A fehérjék valamennyi élő sejt számára az optimális szerkezet, a jó funkció, a növekedés, a működési zavarok helyreállításának elengedhetetlen eszközei. Fontos biológiai szerepüket jellemzi, hogy minden sejtben lejátszódó folyamatban részt vesz- nek. Számos fehérje enzimaktivitást mutat, azaz vala- milyen biokémiai folyamat katalizátoraként segíti elő a sejt életben maradását. Fehérjék rendelkezhetnek

stabilizáló, szerkezeti funkcióval is. Ilyen a sejt alakjá- nak kialakítása (aktin, mikrotubuláris sejtváz, inter- medier filamentum), sejten belüli transzportfolyama- tok lebonyolítása (dinein, kinezin, miozin), mozgatás (aktomiozin rendszer). Más fehérjék a sejt és környe- zete közötti információáramlás megvalósítása révén teszik lehetővé, hogy a sejt érzékelni tudja a külvilág ingereit és reagálni tudjon rájuk. Összegezve, a fehér- jék az élet nélkülözhetetlen tényezői.

A molekuláris biológia központi tétele a genetikai információ áramlását az élő szervezetekben a DNS-től az RNS-en keresztül a fehérjékig határozza meg. A legújabb technikák már alkalmasak arra, hogy az e biomolekulák közötti sokféle kölcsönhatásról és a ge- netikai információáramlás minden egyes lépcsőfoká- ról, az azokat befolyásoló specifikus körülményekről, így a környezeti hatásokról és a stresszállapotokról információt szerezzünk. Közülük megemlíthetjük a genomikát, a transzkriptomikát, a proteomikát, vala- mint a glikomikát és a metabolomikát.

A fehérjék szerkezete, kémiai tulajdonságai

A fehérjék szerkezete és kémiája. A fehérjék amino- savak lineáris polimerjeiből felépülő szerves mak- romolekulák. Aminosavsorrendjüket a gének nuk- leotidszekvenciája kódolja a genetikai kódszótárnak megfelelően. Kialakításukban 20 féle „proteinogén”

(fehérjealkotó) aminosav vesz részt, melyek az ami- no- és karboxilcsoportjaik között kialakuló peptid- kötés révén kapcsolódnak egymáshoz. Egyes poli- peptidek kialakításában több ezer aminosav is részt vehet, míg azokat, melyek kevesebb (<50) amino- savból épülnek fel, peptideknek szokás nevezni, bár a peptid–fehérje megkülönböztetést elég lazán kezeli a tudományos nómenklatúra. A funkcióképesség meg- szerzéséhez vagy a megfelelő szabályozás érdekében gyakran találkozunk az aminosav oldalláncainak utólagos (poszttranszlációs) módosításával. A leg- gyakoribb módosítás a foszforiláció, melynek során a

1. Bevezetés

Kovács L. Gábor

fehérjére specifikus kináz enzim foszfátcsoportot he- lyez egy meghatározott Ser, Thr, Tyr, ritkábban His oldalláncra. A glikoziláció szintén gyakori jelenség, ebben az esetben oligoszacharid/monoszacharid lán- cok kapcsolódnak Asn, Ser, Thr láncokhoz. Az amid- és aminocsoportot tartalmazó aminosav-oldalláncok között, transzglutamináz-reakció eredményeként, ki- alakulhatnak peptidkötést tartalmazó kereszthidak, mint pl. véralvadás vagy a tej megalvadása során.

Az elsődleges vagy primer szerkezet a fehérje ami- nosavszekvenciája. A fehérjelánc szintézisekor a leg- utoljára beépült aminosav karboxilcsoportjához kap- csolódik a következő aminosav aminocsoportja és így tovább. Így megkülönböztetjük a fehérjelánc „elejét”, a szabad aminocsoportot tartalmazó N-terminálist, valamint a „végét”, a szabad karboxilcsoportot tartal- mazó C-terminálist.

A másodlagos vagy szekunder szerkezeten a pep- tidgerinc hidrogénkötések által stabilizált lokális (legalább négy aminosavra kiterjedő) rendezettsé- gét értjük. Ezt a szerkezeti szintet a peptidsíkok egy- máshoz képest történő elfordulásával jellemezhetjük.

E szerkezeti elemek legfőbb csoportjai a jobb- vagy balmenetes hélixek, a redők, a hurkok és a kanyarok;

leggyakoribb az α-hélix, az antiparallel β-redő és a β-kanyar.

A harmadlagos vagy tercier szerkezet egy polipep- tidlánc teljes térbeli konformációja. Ezt a konformá- ciót mindenekelőtt a hidrofób kölcsönhatások stabi- lizálják. Egy peptidlánc tartalmazhat egyetlen vagy többféle másodlagos szerkezeti elemet, melyek ren- dezetlen szakaszokkal váltakoznak, de ismertek olyan fehérjék is, melyekből teljesen hiányoznak a rendezett szerkezetek, ezeket natívan rendezetlen fehérjéknek nevezzük.

Bizonyos fehérjéket több peptidlánc alkot, melye- ket ez esetben alegységeknek nevezünk (negyedleges szerkezet). A peptidláncok lehetnek azonosak vagy el- térőek, számuk általában nem haladja meg a nyolcat, de ismertek fontos kivételek: pl. egyes vírusok kap- szidja hatvan polipeptidből is állhat.

Egyszerű és összetett fehérjék. A fehérjéket osztá- lyozhatjuk összetételük alapján. Az egyszerű fehérjé- ket csak aminosavak építik fel, hidrolízisükkor csak aminosavak képződnek. Az összetett fehérjék hidro- lizátuma egyéb alkotórészt is tartalmaz. Így lehet-

nek metalloproteinek (fémionokat tartalmaznak, pl.

az alkohol-dehidrogenáz Zn²⁺-t, a citokróm-oxidáz Cu²⁺-t), foszfoproteinek (pl. kazein), hemproteinek (pl. hemoglobin, mioglobin, citokróm-c), glikopro- teinek (szénhidrátrészt tartalmaznak, pl. γ-globulin), lipoproteinek (pl. β₁-lipoprotein), flavoproteinek (pl. a szukcinát-dehidrogenáz) vagy nukleoproteinek (nuk- leinsavakat tartalmaznak, pl. a dohánymozaik-vírus és az atelomeráz enzim).

A fehérjék osztályozása funkciójuk alapján. A fe- hérjék sokféle funkciót töltenek be a szervezetben, ezek közül a fontosabbak: enzimek (pl. tripszin, cito- króm-c), transzportfehérjék (hemoglobin, hemocia- nin, szérumalbumin), védőfehérjék (lehetővé teszik, hogy a szervezet fertőzéssel vagy sérüléssel szemben védekezzék, pl. ellenanyagok, fibrinogén, trombin), toxinok (pl. kígyómérgek), hormonok (pl. inzulin, mellékvesekéreg-serkentő hormon: ACTH, növeke- dési hormon), struktúrfehérjék (a mozgáshoz szilárd vázat biztosítanak, és a külső védelmet szolgálják, pl.

kollagén, elasztin, retikulin), motorfehérjék (a sejt- szervecskék, vezikulumok sejten belüli mozgatása a feladatuk, pl. aktin, miozin, kinezin, dinein), vala- mint tartalékfehérjék (az embrionális fejlődés zálo- gai, pl. ovalbumin).

Fehérjék az élő sejtben

A fehérjék szintézise. A sejt DNS-állományában bá- zispár-kombinációk formájában tárolt információ tulajdonképpen a 20 féle aminosav valamelyikét kó- dolja, 3 bázispáros szavakban. Egy-egy gén egy fehér- je tervrajzát tartalmazza. A transzkripció során ez a leírás egy közti molekula (mRNS) formájában mobi- lizálódik, és a genomból a fehérjeszintézist végző ri- boszómákhoz kerül, amelyek az mRNS-t tervrajzként használva legyártják a fehérjéket, az aminosavakat egyenként egymás mögé kapcsolva. A transzkripció helye a sejt DNS-állományához kötött eukarióták vagy valódi sejtmagosokban a sejtmag, a prokarióták, vagy sejtmagnélküliekben a citoplazma.

Transzkripció. Az RNS-szintézist az RNS-polimeráz nevű enzim katalizálja („alternatív splicing”). A szin- tézis kezdetén a DNS kettős hélix szerkezete felnyí-

lik. Az RNS-polimeráz a DNS ún. értelmes szálához kapcsolódik, és megkezdi annak átírását. Ez az átírás a bázispárképzés szabályainak megfelelően megy végbe. A bázisok beépítéséhez ATP eredetű energia szükséges. A szintézis végén az RNS-molekula leválik a DNS-ről, és visszaáll a kettős hélix szerkezet. Ezután eukariótákban az mRNS a sejtmaghártya pórusain át a citoplazmába transzportálódik, prokariótáknál viszont már a transzkripció alatt úgynevezett ribo- szómák kapcsolódnak az mRNS-hez, és megkezdik a fehérjék előállítását. Egy-egy mRNS-hez egyszerre több riboszóma is kapcsolódhat, ami meggyorsítja a fehérjeszintézis folyamatát. Ezeket a képződményeket poliriboszómáknak nevezzük.

Aminosavak aktiválása. Az aminosavak aktiválá- sa energiaigényes, a szükséges mennyiséget az ATP hidrolízise fedezi. Az aminosavak aminosavaktivá- ló enzimhez kapcsolódnak, mely kapcsolatba lép a tRNS-molekulával, végül az aminosav kapcsolódik a tRNS aminosavkötő helyére.

Transzláció. A riboszóma kisebbik alegysége kapcso- lódik az mRNS 5’ végéhez, majd ezután kapcsolódik a riboszóma nagyobbik alegysége is. A transzláció során a riboszóma (multienzim-komplex) határoz- za meg a szintézisben részt vevő molekulák térbeli elrendeződését, együtt tartja az mRNS-t és a növek- vő polipeptidláncot, és a szintézis előrehaladásával folyamatosan továbblép az mRNS-en. A transzlá- ció apparátusa a polipeptid képzésekor az mRNS-en 5’–3' irányban halad. Minden egyes aminosavnak 3-3 nukleotidból álló kodonja sorakozik egymás után az mRNS-en, amelyek a tRNS-eken található 3-3 komp- lementer nukleotidból álló antikodonnal párosod- nak.

A transzláció első lépéseként az első aminosavat (a lánckezdő metionint) szállító tRNS kapcsolódik a riboszóma P- (peptidkötő) helyéhez, a következő aminosavat szállító tRNS pedig az A- (aminosav- kötő) helyéhez. A P-helyen lévő metionin (majd ké- sőbb a polipeptid) és az A-helyre szállított aminosav között ATP-energia felhasználásával és enzimek se- gítségével peptidkötés alakul ki, ezután a kialakított peptidszakasz továbbítódik a peptid-kötőhelyre, a beépült aminosavat szállító tRNS szabadon leválik, a riboszóma továbblép az mRNS-en. A megfelelő ko-

don felismerése után az aminoacil-tRNS-ek egymás után kapcsolódnak a riboszómához, adják le az ami- nosavakat és így hosszabbítják a polipeptidláncot. A növekvő polipeptidlánc a riboszóma kis alegységéhez kapcsolódik.

A polipeptidlánc szintézisének végét az úgy- nevezett „stop”-kodonok határozzák meg. Három lánczáró kodon létezik: UAA, UGA, UAG. A ter- minációs kodonhoz egy release-faktor kapcsolódik (peptidil-transzferáz), amely képes a P-helyen lévő utolsó tRNS és aminosav közötti kötés hidrolízisére.

Ezután a tRNS és a polipeptid távozik, majd megszű- nik a riboszóma és az mRNS közötti kapcsolat, végül a riboszóma alegységeire hidrolizál.

A fehérjék felgombolyodása (folding). A fehérje gombolyodásának problémája, hogy a frissen szin- tetizált polipeptidlánc hogyan jut el abba a három- dimenziós szerkezetbe, amely biztosítja a biológiai rendszerben neki szánt funkció teljesítését. Bizonyos konformációs betegségekben félig felgombolyodott fehérjék vízben oldhatatlan aggregátumai rakódnak le a szövetekben. Az irodalomban publikált felgom- bolyodási vizsgálatok valójában az újragombolyodást (refoldingot) tanulmányozták. A fehérjefelgombo- lyodás kísérleti tanulmányozására használt általános módszer a kémiai ágensekkel való denaturáció és az ezt követő hirtelen kihígítás, aminek következménye- ként a denaturáló kémiai ágens koncentrációja a kri- tikus alá csökken, így megindul a felgombolyodás. (A nyomás-denaturáció olyan új eszközt kínált, amellyel a kémiai ágenst kiválthattuk.)

A fehérjefelgombolyodási vizsgálatok egyik fon- tos kérdése a feltekeredési útvonalon létrejövő köz- tes állapotok létezése volt. Számos kísérletet, ill. mo- dellszámolást végeztek ugyanis annak bizonyítására, hogy a fehérjék feltekeredésük során köztes állapoto- kon mehetnek keresztül.

Posztszintetikus módosítások. A polipeptidlánc a szintézis lezárultával további átalakulásokon megy keresztül. Ilyen átalakulás során kialakul a fehérje másodlagos szerkezete, az első (metionin) vagy első néhány aminosavat enzimek eltávolíthatják, vagy a láncot elvághatják, vagy különböző funkciós csopor- tok kapcsolódhatnak a lánchoz (foszfátok, lipidek, szénhidrátok).

A fehérjék lebomlása. A fehérjelebontás, az amino- savátalakulás különösen az emlősök szervezetében igen nagy jelentőségű. A táplálékkal felvett fehérjé- ket hidrolitikus enzimek első lépésben aminosavakra bontják. A peptidkötést bontó enzimek a proteázok.

Az aminosavak aztán különféle átalakulási folya- matokban vehetnek részt, pl. az extracelluláris tér- ből aktív transzporttal a sejtbe jutó aminosavak fel- használódnak fehérjék, peptidek bioszintéziséhez; az aminosavak részt vesznek egyéb nitrogéntartalmú vegyületek bioszintézisében (koenzimek, purin- és pirimidinvázas vegyületek, hormonok); dekarboxi- lezéssel biogén aminok keletkeznek; az aminocso- port lehasadása után szénláncuk a lipid- és szén- hidrát-anyagcserefolyamatokba kapcsolódhat be (a citrátkörön keresztül); a sejtek ketosavaiból transz- aminálással más aminosavak keletkeznek; az amino- savak egymásba alakulásukkal endogén aminosavak (nem esszenciális) szintézisében is részt vehetnek, ill.

a lehasadó ammónia és szén-dioxid karbamiddá ala- kulva kiürül a szervezetből.

Az aminosavak dezaminálása. A legtöbb dezaminá- lás transzaminálási reakcióban valósul meg. Az ezt katalizáló enzim aktív centrumában piridoxál-fosz- fát (a B₆-vitamin származéka) van. Ennek aldehid- csoportja képes kapcsolatot létesíteni az aminosav aminocsoportjával. Ez víz hatására elbomlik, és ke- tosav lép ki a komplexből, míg az aktív centrumban piridox amin-foszfát marad vissza.

Oxidatív dezaminálás során ammónia keletkezik.

A glutaminsav oxidatív dezaminálását katalizáló de- hidrogenáz enzim jelentős szerepet játszik a folya- matban. Az aminocsoport eltávolításakor a NAD⁺ koenzim redukálódik, és egy könnyen hidrolizálódó iminosav köztiterméken keresztül α-keto-glutársav és ammónia képződik. Az ammónia karbamid for- májában ürül ki a szervezetből.

Nem oxidatív dezaminálás során az ammónia mellett kettős kötést tartalmazó termék is létrejön.

A dezaminálás során képződő szénlánc főként a cit- rátkörön keresztül alakul széndioxiddá és vízzé. Az

aminosavak hét fő intermedier molekulává (piruvát, α-keto-glutársav, szukcinil-KoA, fumársav, oxálecet- sav, acetil-KoA, acetoacetát) bomlanak le.

Az aminosavak dekarboxilezése. Az aminosavak a széndioxid kilépése után a megfelelő aminokká ala- kulnak. Az aminokat biogén aminoknak nevezzük, mert számos képviselőjük fontos biológiai funkciókat tölt be. Az aminosavak dekarboxilezését specifikus, piridoxál-5-foszfát koenzimmel működő dekarboxi- láz enzim végzi. A hisztamin hisztidinből, a tiramin tirozinból, a triptamin triptofánból, a kadaverin a li- zinből keletkezik dekarboxilezéssel. A glutaminsav- ból γ-amino-vajsav jön létre.

Az ubikvitinrendszer. Miközben a fehérjékkel kap- csolatos kutatások nagy része azzal foglalkozott, va- jon hogyan jöhetnek létre a proteinek, addig a ma- gyar származású Avram Hershko, a haifai Technion – Israel Institute of Technology munkatársa első ku- tatásai óta a lebomlás iránt érdeklődik. A fehérjék le- bontásáról sokáig nem sok ismeretünk volt, néhány egyszerű proteinlebontó enzimről tudtunk mindösz- sze. Ilyen pl. a tripszin, mely a vékonybélben bontja le az elfogyasztott ételekből származó fehérjéket. Ma már tudjuk, hogy a sejtek az ubikvitinrendszeren ke- resztül bontják le hibás fehérjéiket. Az újonnan lét- rejött proteinek 30%-a végzi a proteaszóma megsem- misítő gépezetében, ha nem jutnak keresztül a sejt szigorú ellenőrző rendszerén. Az ubikvitinrendszer hibás működése számos betegséghez, pl. rákhoz ve- zet. A szisztéma megismerésének orvosi jelentősége, hogy (többek között) bizonyos daganatos, immun-, idegrendszeri betegségek gyógyíthatók lennének, ha csak a káros fehérjék jelölődnének és bomlanának le.

A Nobel-díjas eredmények ahhoz is hozzájárultak, hogy jobban megértsük az immunrendszer műkö- dését. Ezekkel az új ismeretekkel lehetővé vált annak megértése is, hogy a sejtek molekuláris szinten mi- ként kontrollálnak számos fontos biokémiai folyama- tot, mint pl. a sejtciklust, a DNS-újratermelést és a génmásolást (1-1. ábra).

1-1. ábra. Fehérjék lebomlása – az ubikvitin (UB) szerepe 1. Az E1 enzim aktiválja az ubikvitinmolekulát

2. Az E1 enzim átadja az ubikvitinmolekulát az E2 enzimnek 3. Az E3 enzim már képes felismerni a lebontandó fehérjét 4. Az E2 enzim közel kerül a fehérjéhez, és átadja az ubikvitint 5. Ez többször is megismétlődik, így ubikvitinlánc alakul ki

6. A proteaszóma felismeri az ubikvitinláncot, és feldarabolja a fehérjét

A fehérjék kölcsönhatásai

A fehérjék szerkezetét fenntartó kölcsönhatások alap- vetően négy nagyobb csoportba oszthatók:

• Elektrosztatikus kölcsönhatások.

• Diszperziós erők.

• H-hidak.

• Hidrofób kölcsönhatások.

Mai értelmezésünk szerint a komplex biológiai rend- szerek, pl. egy sejt alkotóelemei, sokrétű bonyolult és dinamikus kölcsönhatásban vannak egymással, és ezek a kölcsönhatások elektromágneses természe- tűek, elsősorban Coulomb-erőkre vezethetőek vissza.

A fehérjék mindig vizes közegben működnek, és ma- guk is jelentős mennyiségű (20–70%), felszínükön és üregeikben kötött vizet tartalmaznak. E hidrátburok

vízmolekulái integráns részét képezik a térszerkezet- nek, és elengedhetetlenek a működéshez. A fehérjék különleges képessége, szerkezeti és funkcionális sok- oldalúsága elsősorban annak tulajdonítható, hogy szemben a szilárd anyagokkal, amelyeket főként erős kovalens és ionos kötések tartanak egyben, és a folya- dékokkal, amelyeknek részecskéi között gyenge má- sodlagos kötések hatnak, a fehérjékben e két kötés- típus kombinációjával találkozunk. Az aminosavak oldatát a sejt fehérjéitől az különbözteti meg, hogy a sejt működési körülményei között az aminosavak kovalens kötéssel, adott sorrendben láncba vannak rendezve. Ez a polipeptidlánc korlátozott flexibili- tással rendelkezik, ami lehetővé teszi a térbeli gom- bolyodást, felcsavarodást, a lánc nem szomszédos oldalláncainak közelkerülését. A nem-kovalens kö- tések közeli molekulák és molekularészletek közöt-

1-2. ábra. Sejt-sejt kapcsolatot kialakító fehérjék (pl. integrinek) aktiválódása során jellegzetes makroszkopikus szerkezet- változás következik be

(Rövidítések – EGF: epidermalis növekedési faktor; I: integrin; ICAM: intercelluláris adhéziós molekula)